GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0910

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 4071-4076.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0910

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植

王亚萍¹，孔祥平²，刘光泽²，卓丽¹，高洪波¹，唐小平¹，佟明华²

¹广州市第八人民医院重症肝病科，广东省广州市 510060；²解放军第四五八医院肝病防治中心，广东省广州市 510000

修回日期:2018-05-26 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 佟明华，博士，主任医师，解放军第四五八医院肝病防治中心，广东省广州市 510000; 并列通讯作者：唐小平，广州市第八人民医院重症肝病科，广东省广州市 510060
作者简介:王亚萍，女，1985年生，四川省眉山市人，汉族，硕士，主治医师。
基金资助:
国家973重点基础研究发展计划(2010CB945502)；广东省科技计划项目(2015B020226004)；广州市科技计划项目(201508020262)

Embryonic hepatic stem cells from GFP transgenic mice: in vitro separation, cultivation and intra-spleen transplantation

Wang Ya-ping¹, Kong Xiang-ping², Liu Guang-ze², Zhuo Li¹, Gao Hong-bo¹, Tang Xiao-ping¹, Tong Ming-hua²

¹Department of Severe Liver Diseases, Guangzhou Eighth People’s Hospital, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China; ²Liver Disease Prevention Center, the 458^th Hospital of PLA, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China

Revised:2018-05-26 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Tong Ming-hua, M.D., Chief physician, Liver Disease Prevention Center, the 458th Hospital of PLA, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; Tang Xiao-ping, Department of Severe Liver Diseases, Guangzhou Eighth People’s Hospital, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China
About author:Wang Ya-ping, Master, Attending physician, Department of Severe Liver Diseases, Guangzhou Eighth People’s Hospital, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Basic Research Program of China (973 Program), No. 2010CB945502; the Scientific Research Plan Project of Guangdong Province, No. 2015B020226004; the Scientific Research Plan Project of Guangzhou City, No. 201508020262

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐(L-CL₂MDP)：是Van Rooijen发现的一种特异性清除肝脏巨噬细胞(Kupper细胞)的方法，即将脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐通过静脉注入大鼠体内，脂质体被肝脏Kupper细胞选择性吞噬，吞噬后转运到溶酶体，溶酶体会破坏脂质体膜，使二氯亚甲基二磷酸盐释放，从而特异性清除巨噬细胞，这种方法对肝脏其他细胞几乎没有影响。
倒千里光碱：是吡咯烷类生物碱家族中的一种化学药物，它能将细胞阻滞在细胞周期中的G₁/S期、S后期和(或)G₂/M期，从而影响肝细胞的增殖能力，这种影响最长可持续数月，这就有利于对细胞移植后的体内示踪进行一个长期观察和研究。

摘要
背景：近年研究证实，干细胞移植的成功与否、移植后细胞功能的发挥均与体内微环境密切相关。正常生理情况下，肝脏不易接受外源性细胞，因此，在目前的细胞移植研究中，通常会先建立一个移植动物模型，通过造成宿主肝脏的损伤或降低宿主肝脏的免疫反应等方式，为外源细胞的植入和增殖创造一个良好的移植条件。
目的：观察GFP转基因小鼠胎肝干细胞在脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐/倒千里光碱联合1/3肝切除(L-CL₂MDP/RS/PH)模型大鼠肝脏内的定植和分布情况。
方法：①以孕15 d GFP转基因小鼠为供体，分离培养胎肝干细胞，荧光显微镜观察GFP表达，并行免疫细胞化学鉴定；②将30只SD大鼠随机分为实验组和对照组，实验组腹腔注射倒千里光碱溶液(30 mg/kg，共2次，每次间隔2周)，术前1 d每只大鼠静脉注射1 mL脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐(L-CL₂MDP)溶液，行1/3部分肝脏切除后经脾内移植GFP转基因小鼠胎肝干细胞，对照组用生理盐水分别代替L-CL₂MDP和倒千里光碱溶液，不进行1/3部分肝脏切除；③移植后3，15，30 d取出两组大鼠肝脏行冰冻切片，荧光显微镜下观察GFP阳性肝干细胞在大鼠肝脏的分布，并通过免疫组化染色方法检测抗小鼠C-Kit抗体在移植大鼠肝内的表达。
结果与结论：①镜下观察分离的肝干细胞大小均匀，呈鹅卵石形态。培养5 d后细胞体积逐渐增大，呈类圆形或梭形，荧光显微镜下可见绿色荧光，免疫细胞化学检测第3代肝干细胞表达CD34、AFP；②胎肝干细胞移植后3 d在荧光显微镜下发现实验组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞，移植后30 d大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达；③移植后3，15，30 d在实验组大鼠肝脏组织可见C-Kit阳性细胞表达；④结果表明，GFP转基因小鼠胎肝干细胞成功移植于L-CL₂MDP/RS/PH模型大鼠脾内，植入的细胞能够在大鼠肝脏中存活，并出现不同程度增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4593-1322(王亚萍)

关键词: GFP转基因小鼠, 胎肝干细胞, 倒千里光碱, 脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐, 1/3部分肝脏切除, 脾内移植, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have confirmed that the success of stem cell transplantation and the function of transplanted cells are closely related to the in vivo microenvironment. Under normal physiological conditions, the liver is not susceptible to exogenous cells. Therefore, a transplant animal model is usually established to damage the host liver or reduce the immune response of the host liver, creating a good condition for the transplantation and proliferation of exogenous cells.
OBJECTIVE: To observe the colonization and distribution of embryonic hepatic stem cells from GFP transgenic mice in a rat model of liposome-coated dichloromethylene diphosphate/retrorsine and 1/3 liver resection (L-CL₂MDP/RS/PH).
METHODS: GFP transgenic mice at gestational 15 days were taken as donors to separate and cultivate embryonic hepatic stem cells. Fluorescence microscope was used to observe the GFP expression followed by immunocytochemical identification. Thirty Sprague-Dawley rats were randomized into experimental group and control group. Rats in the experimental group were given intraperitoneal injection of retrorsine (30 mg/kg, twice, with an interval of 2 weeks). At 1 preoperative day, these rats were subjected to intravenous infusion of L-CL₂MDP (1 mL) and 1/3 liver resection followed by intra-spleen transplantation of embryonic hepatic stem cells from GFP transgenic mice. Rats in the control group were only given injection of normal saline instead of L-CL₂MDP and retrorsine, but no liver resection. Frozen liver sections were made in the two groups to observe the distribution of GFP-positive hepatic stem cells under the fluorescence microscope at 3, 15, 30 days after transplantation. Moreover, immunohistochemical staining was used to detect the expression of anti-mouse C-Kit antibody in the rat liver.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The hepatic stem cells under microscope were uniform with a cobblestone shape. After 5 days of culture, the cells with increased size presented with the shape of fusiform or polygon, and the green fluorescence was observed in cells under the fluorescence microscope. Passage 3 hepatic stem cells expressed CD34 and AFP. (2) At 3 days after spleen transplantation of embryonic hepatic stem cells, GFP positive cells were scattered in the experimental group under the fluorescence microscope, and the GFP positive expression was still visible in the liver at 30 days after transplantation. (3) At 3, 15, and 30 days after transplantation, C-Kit positive cells were visible in the liver of rats in the experimental group. All these findings reveal that embryonic hepatic stem cells from GFP transgenic mice have been successfully transplanted into the spleen of the L-CL₂MDP/RS/PH rat model, and the transplanted cells can survive and proliferate in the rat liver.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver, Stem Cells, Mice, Transgenic, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王亚萍，孔祥平，刘光泽，卓丽，高洪波，唐小平，佟明华. GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 4071-4076.

Wang Ya-ping, Kong Xiang-ping, Liu Guang-ze, Zhuo Li, Gao Hong-bo, Tang Xiao-ping, Tong Ming-hua. Embryonic hepatic stem cells from GFP transgenic mice: in vitro separation, cultivation and intra-spleen transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 4071-4076.

图/表（结果） 2

2.1 GFP转基因小鼠胎肝干细胞的形态特征和GFP表达 锥虫蓝染色证实分离细胞的存活率达到90%以上，倒置显微镜下见刚分离的细胞大小均匀，呈卵圆形。接种培养瓶24 h后细胞开始贴壁，培养5 d后细胞体积增大，呈多角形或梭形(图2A)，荧光显微镜下可见细胞发出绿色荧光(图2B)。经3次消化传代后细胞状态良好，荧光显微镜下仍可以见炫目的绿色荧光(图2C)。

2.2 胎肝干细胞的鉴定 采用免疫细胞化学法检测第3代肝干细胞表面标志物：可见CD34、AFP呈阳性表达，胞浆成棕黄色(图3A-C)。

2.3 荧光显微镜下GFP转基因小鼠胎肝干细胞在肝内的分布 GFP转基因小鼠胎肝干细胞经脾内移植3 d后，荧光显微镜观察两组大鼠肝脏冰冻切片：实验组大鼠肝脏内可见GFP阳性细胞，细胞大小较均匀，为正常肝细胞的1/3-1/2，呈散在分布，表现出明亮的绿色荧光(图4A-C)；对照组大鼠肝脏内未见GFP阳性细胞(图4D-E)。移植后30 d实验组大鼠肝脏内仍可见GFP表达，GFP阳性细胞聚集成团、呈局灶状分布，细胞大小与正常肝细胞相似(图4F-G)。

2.4 抗小鼠C-Kit抗体在实验组大鼠肝脏中的表达 移植后第3天肝内可见C-Kit染色阳性细胞，体积较小，为正常肝细胞的1/3-1/2，胞浆染色均匀，直径为25-30 μm，阳性细胞呈弥散性分布(图5A)；移植后15 d，C-Kit染色阳性细胞表达增强，散在分布，少数细胞呈团状分布(图5B)；移植后30 d，C-Kit染色阳性细胞聚集呈团、呈局灶状分布，细胞大小与正常肝细胞相似(图5C)。结果表明胎肝干细胞可以在移植大鼠肝脏定植，并表达肝干细胞的表面标志物。

参考文献

[1] Diehl AM, Rai R. Review: regulation of liver regeneration by pro-inflammatory cytokines. J Gastroenterol Hepatol. 1996; 11(5):466-470.

[2] Banas A, Teratani T, Yamamoto Y, et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 2009;24(1):70-77.

[3] Yu Y, Yao AH, Chen N, et al. Mesenchymal stem cells over-expressing hepatocyte growth factor improve small-for-size liver grafts regeneration. Mol Ther. 2007;15(7): 1382-1389.

[4] Pournasr B, Mohamadnejad M, Bagheri M, et al. In vitro differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. Arch Iran Med. 2011;14(4): 244-249.

[5] Oyagi S, Hirose M, Kojima M, et al. Therapeutic effect of transplanting HGF-treated bone marrow mesenchymal cells into CCl4-injured rats. J Hepatol. 2006;44(4):742-748.

[6] Si-Tayeb K, Noto FK, Nagaoka M, et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 2010;51(1):297-305.

[7] Yu LM, Luo N, Li QL, et al. EPCAM-positive normal hepatic progenitor cells transformation into liver stem cells and HBx-mediated effects on stability in adult mouse. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2015;23(11):854-859.

[8] Giri S, Acikgöz A, Bader A. Isolation and Expansion of Hepatic Stem-like Cells from a Healthy Rat Liver and their Efficient Hepatic Differentiation of under Well-defined Vivo Hepatic like Microenvironment in a Multiwell Bioreactor. J Clin Exp Hepatol. 2015;5(2):107-122.

[9] Habeeb MA, Vishwakarma SK, Bardia A, et al. Hepatic stem cells: A viable approach for the treatment of liver cirrhosis. World J Stem Cells. 2015;7(5):859-865.

[10] Khan AA, Shaik MV, Parveen N, et al. Human fetal liver-derived stem cell transplantation as supportive modality in the management of end-stage decompensated liver cirrhosis. Cell Transplant. 2010; 19(4):409-418.

[11] 吴波,张博,李伟光,等.TGF-β1基因修饰的肝干细胞诱导大鼠移植肝脏免疫耐受的实验研究[J].胃肠病学和肝病学杂志, 2014, 23(4):425-427.

[12] 韩博,徐三荣,张进,等.同基因与异基因胚胎肝干细胞移植治疗小鼠肝硬化[J].中国组织工程研究,2013,16(36):6474-6480.

[13] 张锡峰,胡代曦,芦永良,等. Wnt3a过表达对小鼠胚胎肝干细胞凋亡的抑制作用[J].细胞与分子免疫学杂志, 2013,29(12): 1277-1280.

[14] 黄增辉,曾珊,欧阳淼,等.肝素联合肝干细胞经脾移植治疗SD大鼠急性肝损伤[J].中南大学学报:医学版,2011,36(5):411-416.

[15] Ito M, Nagata H, Miyakawa S, et al. Review of hepatocyte transplantation. J Hepatobiliary Pancreat Surg. 2009;16(2): 97-100.

[16] Carpentier B, Gautier A, Legallais C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 2009;58(12): 1690-1702.

[17] 刘勇,冯东福,陈二涛,等.绿色荧光蛋白转基因胚胎大鼠神经干细胞生物学特性研究[J].实用医学杂志,2008,24(5):709-712.

[18] Gai H, Nguyen DM, Moon YJ, et al. Generation of murine hepatic lineage cells from induced pluripotent stem cells. Differentiation. 2010;79(3):171-181.

[19] Gouon-Evans V, Boussemart L, Gadue P, et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2006;24(11): 1402-1411.

[20] Polisetti N, Chaitanya VG, Babu PP, et al. Isolation, characterization and differentiation potential of rat bone marrow stromal cells. Neurol India. 2010;58(2):201-208.

[21] Sakaida I. Autologous bone marrow cell infusion therapy for liver cirrhosis. J Gastroenterol Hepatol. 2008;23(9): 1349-1353.

[22] 周晓飞,王茜,褚建新,等. Retrorsine对小鼠肝损伤后肝细胞增殖的影响[J].第二军医大学学报,2006,27(1):31-35.

[23] Mohamadnejad M, Alimoghaddam K, Mohyeddin-Bonab M, et al. Phase 1 trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis. Arch Iran Med. 2007;10(4):459-466.

[24] Giuliani AL, Wiener E, Lee MJ, et al. Changes in murine bone marrow macrophages and erythroid burst-forming cells following the intravenous injection of liposome-encapsulated dichloromethylene diphosphonate (Cl2MDP). Eur J Haematol. 2001;66(4):221-229.

[25] Bauer D, Schmitz A, Van Rooijen N, et al. Conjunctival macrophage-mediated influence of the local and systemic immune response after corneal herpes simplex virus-1 infection. Immunology. 2002;107(1):118-128.

[26] Tsai PC, Fu TW, Chen YM, et al. The therapeutic potential of human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton's jelly in the treatment of rat liver fibrosis. Liver Transpl. 2009; 15(5):484-495.

[27] Levicar N, Pai M, Habib NA, et al. Long-term clinical results of autologous infusion of mobilized adult bone marrow derived CD34+ cells in patients with chronic liver disease. Cell Prolif. 2008;41 Suppl 1:115-125.

[28] 李劲,张健,刘光泽,等. D-氨基半乳糖与脂多糖对小鼠肝脏损伤后再生修复的影响[J].南方医科大学学报,2012,32(1):50-54.

引言

材料方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 孕15 d GFP转基因小鼠；SPF级SD雄性大鼠30只。

1.1.2 实验试剂 倒千里光碱(RS)、胰岛素、Triton X-100、锥虫蓝(Sigma公司)；DMEM-F12培养基、胎牛血清(Hyclone公司)；Ⅳ胶原酶(Peprotech公司)；二氯亚甲基二磷酸盐(CL₂MDP)、兔抗鼠AFP、CD34抗体（Bioss公司）；抗小鼠C-Kit抗体(Bioss公司)；BrdU (Sigma公司)；Anti-Mouse IgG Fragment(Cellsignal公司)；免疫组化检测试剂盒(DAKO公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 GFP转基因小鼠胎肝干细胞的分离培养、传代及鉴定 无菌取出孕15 d GFP转基因小鼠胚胎肝脏，PBS洗涤，眼科剪剪碎后用0.05% Ⅳ型胶原酶液消化15 min，终止消化后过滤制成单细胞悬液，离心沉淀后接种于培养瓶中。倒置显微镜观察胎肝干细胞的生长情况和形态变化，荧光显微镜观察GFP的表达，待细胞长满(> 80%)时进行1∶3消化传代。免疫细胞化学染色检测肝干细胞标志物AFP、CD34的表达，以PBS作为阴性对照，操作方法按试剂盒说明书进行。

1.2.2 脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐(L-CL₂MDP)溶液的制备 将110 mg胆固醇和750 mg磷脂酰胆碱溶于氯仿；65 ℃水浴去除氯仿；然后加入含有28 mg二氯亚甲基二磷酸盐(CL₂MDP)的PBS(10 mL)中；室温下静置2 h；超声细胞破碎仪破碎3 min；4 ℃、20 000×g离心30 min；将沉淀重悬于40 mL PBS中，4 ℃密闭避光保存。

1.2.3 L-CL₂MDP/RS/PH大鼠移植模型的建立和实验分组 30只SD大鼠随机分为2组，每组15只。L-CL₂MDP/RS/PH组(实验组)：15只大鼠分别腹腔注射倒千里光碱溶液(30 mg/kg，共2次，每次间隔2周)；术前1 d每只大鼠静脉注射1 mL L-CL₂MDP溶液，行脾脏移植前再行1/3部分肝脏切除。对照组：用生理盐水分别代替L-CL₂MDP和倒千里光碱溶液，不进行1/3部分肝脏切除。

1.2.4 GFP转基因小鼠胎肝干细胞的脾内移植 ①细胞准备：将分离培养的胎肝干细胞消化后制备成单细胞悬液，调至细胞浓度为1.0×10⁹L^-1，锥虫蓝染色检测细胞活力为> 90%；②实验组大鼠行1/3部分肝脏切除，并行GFP转基因小鼠胎肝干细胞的脾内移植(图1)，术后保温至大鼠苏醒并自由进食及饮水。

1.2.5 观察GFP阳性肝干细胞在移植大鼠肝脏的分布 移植后3，15，30 d取材：①灌注固定：乙醚麻醉大鼠后打开腹腔，灌注针头从门静脉刺入，生理盐水冲管后继以0.1 mol/L PBS、4% HCHO灌注，冲管及灌注同时剪开腹主动脉；②后固定，脱水：后固定液固定后取出肝脏，30%蔗糖溶液脱水，肝组织块沉底后取出；③制作切片，荧光显微镜下观察GFP阳性肝干细胞分布。

1.2.6 检测抗小鼠C-Kit抗体在大鼠肝脏中的表达 移植后3，15，30 d，取实验组和对照组大鼠肝脏制作冰冻切片，行抗小鼠C-Kit免疫组化染色，检测抗小鼠C-Kit抗体在移植大鼠肝内的表达，操作流程按试剂盒说明书进行，胞浆棕黄色为阳性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肝干细胞是一类具有自我更新和高度分化潜能的原始细胞，在许多肝脏疾病治疗中具有非常大的应用前景^[6-14]。目前，随着干细胞研究的深入，利用肝脏干细胞作为种子细胞来进行移植的研究也越来越多，这些细胞移植研究往往需要对移植细胞做预标记，以方便对细胞在移植后的迁移分化进行示踪研究^[15]。而如何对移植细胞进行标记，这也是目前细胞移植研究的难点，目前常用的细胞标记方法包括分子免疫标记物、荧光色素标记物等，但这些细胞标记物均或多或少存在一些不足，比如标记率不高、追踪周期短、容易出现假阳性等，这些不足限制了其在细胞移植中的应用^[16]。随着转基因技术的飞速发展，逐渐将目光投向转基因实验动物，这些稳定表达某种基因的转基因动物在未来的示踪领域可能有着更广阔的应用空间^[17]。作者首次使用GFP转基因小鼠作为移植细胞来源，从其胚胎肝脏中成功分离出胎肝干细胞，原代培养和传代3次后的干细胞均能够稳定而强烈表达绿色荧光，这为干细胞移植方面的实验研究提供了良好的细胞来源，也进一步证明GFP转基因小鼠是研究肝干细胞迁移、分化的理想选材^[18]。

近年研究证实，干细胞移植的成功与否、移植后细胞功能的发挥均与体内的微环境密切相关。正常生理情况下，肝脏不易接受外源性细胞，因此，在目前的细胞移植研究中，通常会先建立一个移植动物模型，通过造成宿主肝脏的损伤或降低宿主肝脏的免疫反应等方式，为外源细胞的植入和增殖创造一个良好的移植条件。研究显示，移植动物模型的不同，细胞的植入率也不相同，因此选择一个好的细胞移植动物模型非常重要^[19]。倒千里光碱(retrorsine)是吡咯烷类生物碱家族中的一种化学药物，它能将细胞阻滞在细胞周期中的G₁/S期、S后期和(或)G₂/M期，从而影响肝细胞的增殖能力，这种影响最长可持续数月，这就有利于对细胞移植后的体内示踪进行一个长期观察和研究^[20-22]。另外，在移植动物模型中往往会涉及到肝脏部分切除，肝脏部分切除是指将特定的肝脏小叶完整切除而不影响其他肝小叶，肝脏部分切除后，一些启动和调控细胞再生反应的因子会分泌和释放入血，从而有利于外来细胞的存活和增殖^[23]。实验联合了倒千里光碱和部分肝脏切除，一方面抑制了自身肝细胞的增殖能力，为外源细胞的成功移植创造良好的增殖空间；另一方面通过移除部分肝细胞，为移植细胞提供一个增生性刺激，这些均有利于外源性细胞在宿主肝脏的定植。移植后干细胞的定植率除与体内微环境有关，还与宿主非特异性炎症反应相关。目前研究证实，抑制细胞移植后宿主早期非特异性炎症反应，能够显著提高移植细胞的存活率^[24]。因此，为了减轻宿主肝脏的非特异性炎症反应，延长移植细胞的存活时间，研究者作了许多尝试。由于在非特异性炎症反应中起主要作用的是巨噬细胞，因此这些尝试主要是针对肝脏巨噬细胞。L-CL₂MDP是Van Rooijen发现的一种特异性清除肝脏巨噬细胞(Kupper细胞)的方法，即将脂质体包裹的CL₂MDP通过静脉注入大鼠体内，脂质体被肝脏Kupper细胞选择性吞噬，吞噬后转运到溶酶体，溶酶体会破坏脂质体膜，使L-CL₂MDP释放，从而特异性清除巨噬细胞，这种方法对肝脏其他细胞几乎没有影响^[25-26]。目前，L-CL₂MDP主要应用于某些免疫性疾病治疗的实验研究，在肝干细胞移植方面的实验研究较少^[27]。实验首次联合了倒千里光碱、L-CL₂MDP和肝脏部分切除，成功构建了一种新的肝干细胞移植动物模型，在这种动物模型中，预先使用倒千里光碱抑制大鼠成熟肝细胞增殖，然后通过肝脏部分切除造成肝细胞大量缺失，从而产生强烈的肝再生信号^[28]，联合L-CL₂MDP的静脉注射，特异性清除脾脏及肝脏中的Kupper细胞，减轻宿主的非特异性炎症反应，提高了移植的肝干细胞在肝脏中的存活可能。实验成功从GFP转基因小鼠胎肝中分离出胎肝干细胞，并将其作为移植研究的细胞来源，然后成功构建了L-CL₂MDP/RS/PH大鼠模型，并将分离培养的GFP转基因小鼠胎肝干细胞通过脾内移植于L-CL₂MDP/RS/PH大鼠模型中，研究结果表明肝干细胞能够成功植入L-CL₂MDP/ RS/PH大鼠模型肝脏中，并观察到植入的肝脏干细胞能够在受体大鼠肝脏中存活，并可见不同程度的增殖，而对照组中未见肝脏干细胞的存活和增殖，这也进一步证实L-CL₂MDP/RS/PH大鼠模型能够为肝干细胞的移植提供一个好的微环境，有可能成为一种理想的细胞移植动物模型，这为研究适用于肝干细胞移植的实验动物模型提供了一些参考。下一步将进一步深入此项研究，探讨肝干细胞在受体肝脏中的存活时间、增殖情况及如何面对宿主肝脏复杂的微环境等问题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植

Embryonic hepatic stem cells from GFP transgenic mice: in vitro separation, cultivation and intra-spleen transplantation

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.