川芎嗪纳米喷雾剂干预术后腹腔粘连

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0875

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (18): 2896-2902.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0875

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川芎嗪纳米喷雾剂干预术后腹腔粘连

连紫宇¹，杨丽丽^2，3，卞尧尧⁴，王雅洁¹，马妍婷¹，王叶同⁴，唐升进⁴，曾莉³，李文林^3，5

南京中医药大学，¹第二临床医学院，²第一临床医学院，³敬文图书馆，⁴护理学院，江苏省南京市 210023；⁵江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏省南京市 210023

收稿日期:2018-04-09 出版日期:2018-06-28 发布日期:2018-06-28
通讯作者: 李文林，博士，教授，南京中医药大学图书馆，江苏省南京市 210023
作者简介:连紫宇，女，1992年生，山西省长治市人，汉族，南京中医药大学在读硕士，主要从事术后康复中医药挖掘与应用研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81673982，81704084)；江苏省中医药局科技项目(YB2015002，YB2017002)；2016年江苏省研究生创新工程项目(NO.27)；南京中医药大学2017年大学生创新创业训练课题(NO.16)

Ligustrazine nano-spray against postoperative abdominal adhesion

Lian Zi-yu¹, Yang Li-li^{2, 3}, Bian Yao-yao⁴, Wang Ya-jie¹, Ma Yan-ting¹, Wang Ye-tong⁴, Tang Sheng-jin⁴, Zeng Li³, Li Wen-lin^{3, 5}

¹Second Clinical Medicine School, ²First Clinical Medicine School, ³Jingwen Library, ⁴School of Nursing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China; ⁵Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China

Received:2018-04-09 Online:2018-06-28 Published:2018-06-28
Contact: Li Wen-lin, M.D., Professor, Jingwen Library, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China; Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
About author:Lian Zi-yu, Master candidate, Second Clinical Medicine School, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81673982, 81704084; the Science and Technology Project of Jiangsu Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. YB2015002, YB2017002; the Research Innovation Program of Academic Degree Postgraduates in Jiangsu Province in 2016, No. 27; the College Students Innovation and Entrepreneurship Program of Nanjing University of Chinese Medicine in 2017, No. 16

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

川芎嗪：是一种吸收快、代谢快、半衰期短的生物碱，但生物利用度低，作者所在团队研制的川芎嗪纳米制剂，利用纳米技术增加药物颗粒溶解度，提高生物利用度，并结合与聚乳酸发挥覆盖隔离作用。川芎嗪纳米制剂使用方便，靶向性给药，生物利用度高，且具有良好的生物相容性和低细胞毒性，有效弥补了川芎嗪的代谢短板，可促进川芎嗪在临床上的应用。

Nrf2-ARE信号通路：Nrf2属于CNC转录因子家族成员，含有6个不同的功能区，分别被命名为Neh1到Neh6。生理状态下，Nrf2与Keap1偶联存在于细胞质中并经泛素化降解，当受到有害刺激时，Nrf2与Keap1解离并活化转位进入细胞核，在核内与ARE结合激活Nrf2-ARE信号通路，诱导机体抗氧化基因表达，防止自由基产生。

背景：氧化应激是术后腹腔粘连形成的重要机制之一，转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路是重要的内源性抗氧化应激通路，课题组前期研究发现川芎嗪纳米喷雾剂可抑制实验性大鼠术后腹腔粘连形成，并且川芎嗪具有抗氧化作用。

目的：观察川芎嗪纳米喷雾剂对术后腹腔粘连大鼠Nrf2-ARE信号通路相关蛋白、mRNA表达的影响，以及对抗大鼠腹腔粘连的作用机制。

方法：将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、川芎嗪组和透明质酸钠组，假手术组打开腹腔后即缝合不予造模，模型组打开腹腔予什锦锉刀摩擦回盲部浆膜层以制备腹腔粘连模型，川芎嗪组和透明质酸钠组造模方法与模型组相同，关腹前分别予川芎嗪纳米喷雾剂和透明质酸钠凝胶创面给药。

结果与结论：与模型组相比，川芎嗪纳米喷雾剂可降低实验性术后腹腔粘连大鼠活性氧、基质金属蛋白酶抑制因子1水平，升高基质金属蛋白酶9水平，上调Nrf2、血红素加氧酶1 mRNA和蛋白表达水平。川芎嗪纳米喷雾剂对大鼠术后腹腔粘连具有抑制作用，其机制可能与调节Nrf2和血红素加氧酶1mRNA及蛋白水平从而激活Nrf2-ARE信号通路抗氧化作用有关。

ORCID: 0000-0002-7105-2743(李文林)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 川芎嗪, 腹腔粘连, 氧化应激, Nrf2-ARE信号通路, 中药, 术后, 大鼠, 纳米喷雾, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Oxidative stress is one of the important mechanisms of postoperative abdominal adhesion. The nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2)-antioxidant response element (ARE) signal pathway is an important endogenous anti-oxidation stress pathway. Our previous study found that ligustrazine nano-spray can inhibit the formation of postoperative abdominal adhesion in rats, and moreover, ligustrazine has an anti-oxidation effect.

OBJECTIVE: To observe the effect of ligustrazine nano-spray on the expression of mRNAs and proteins related to the Nrf2-ARE signal pathway in rats with abdominal adhesion, and to investigate the mechanism by which ligustrazine nano-spray inhibits abdominal adhesion via regulating the Nrf2-ARE signal pathway.

METHODS: Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, model group, ligustrazine group and sodium hyaluronate group. In the sham group, only laparotomy was performed without modeling. In the model group, an abdominal adhesion model was created but no drug was used. In the ligustrazine group, ligustrazine nano-spray was used on the wound before incision suturing. In the sodium hyaluronate group, sodium hyaluronate was applied on the wound before incision suturing.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, ligustrazine nano-spray reduced the levels of reactive oxygen species, tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1, but increased the level of matrix metalloproteinase 9 in the rat serum. The expression of Nrf2 and HO-1 mRNA and proteins was also up-regulated in the ligustrazine group relative to the model group. Therefore, ligustrazine nano-sprays can inhibit abdominal adhesions in rats, and its mechanism may be related to the regulation of Nrf2 and heme oxygenase 1 mRNA and proteins expression and the activation of Nrf2-ARE signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Adhesions, NF-E2-Related Factor 2, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

连紫宇，杨丽丽，卞尧尧，王雅洁，马妍婷，王叶同，唐升进，曾莉，李文林. 川芎嗪纳米喷雾剂干预术后腹腔粘连[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(18): 2896-2902.

Lian Zi-yu, Yang Li-li, Bian Yao-yao, Wang Ya-jie, Ma Yan-ting, Wang Ye-tong, Tang Sheng-jin, Zeng Li, Li Wen-lin. Ligustrazine nano-spray against postoperative abdominal adhesion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(18): 2896-2902.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠24只，无脱失或死亡，全部进入结果分析。

2.2 一般情况观察及粘连程度分级各组大鼠切口愈合良好。腹腔粘连程度分级结果显示，模型组大鼠粘连程度高于假手术组(P=0.004)，实验组大鼠经川芎嗪纳米喷雾剂干预后粘连程度显著低于模型组(P=0.006；表1)。

2.3 血清活性氧、基质金属蛋白酶抑制因子1、基质金属蛋白酶9表达水平及其相关性与假手术组相比，模型组大鼠血清活性氧表达水平升高(P < 0.01)；川芎嗪纳米喷雾剂组活性氧表达水平较模型组显著降低(P < 0.05)。与假手术组相比，模型组大鼠基质金属蛋白酶9表达水平降低(P < 0.01)，基质金属蛋白酶抑制因子1表达升高(P < 0.05)，经川芎嗪纳米喷雾剂干预后，大鼠基质金属蛋白酶9表达水平升高(P < 0.01)，基质金属蛋白酶抑制因子1表达降低(P < 0.01)，与模型组相比差异有显著性意义，如表2所示。

将大鼠血清活性氧和基质金属蛋白酶抑制因子1、基质金属蛋白酶9表达水平分别进行相关性分析，结果显示，活性氧与基质金属蛋白酶9呈负向直线相关(r=-0.439，P= 0.036)，如图1，但尚未发现活性氧与基质金属蛋白酶抑制因子9存在直线相关关系。

2.4 Nrf2和血红素加氧酶1的mRNA表达水平与假手术组相比，模型组大鼠粘连组织Nrf2和血红素加氧酶1mRNA表达水平升高(P < 0.01)；川芎嗪纳米喷雾剂组Nrf2和血红素加氧酶1mRNA表达水平较模型组进一步升高(P < 0.01，P < 0.05)，如表3。提示川芎嗪纳米喷雾剂对实验性腹腔粘连大鼠Nrf2和血红素加氧酶1 mRNA表达有明显激活作用。

2.5 Nrf2核蛋白和血红素加氧酶1浆蛋白表达水平模型组大鼠Nrf2核蛋白和血红素加氧酶1浆蛋白表达水平均较假手术组升高(P < 0.05，P < 0.01)，川芎嗪纳米喷雾剂组大鼠Nrf2核蛋白和血红素加氧酶1浆蛋白表达水平与模型组相比进一步升高，且差异有显著性意义(P < 0.01，P < 0.05)，透明质酸钠组大鼠血红素加氧酶1浆蛋白表达水平较模型组亦升高(P < 0.05)，如图2。提示川芎嗪纳米喷雾剂对实验性腹腔粘连大鼠Nrf2核蛋白和血红素加氧酶1浆蛋白表达有明显激活作用。

2.6 Nrf2和血红素加氧酶1蛋白表达水平及Nrf2核转位免疫组化检测光镜下显示，假手术大鼠肠组织中Nrf2蛋白呈低表达或不表达，模型组大鼠组织Nrf2蛋白呈棕色，为阳性表达，川芎嗪纳米喷雾剂组和透明质酸钠组Nrf2蛋白呈强阳性表达，细胞核中可见大量深棕色颗粒，胞浆染色亦呈棕色。血红素加氧酶1蛋白在假手术组组织胞浆中呈弱阳性表达，模型组可见多量棕色阳性表达，川芎嗪纳米喷雾剂组和透明质酸钠组大鼠组织血红素加氧酶1蛋白呈强阳性表达，细胞核和胞浆中均可见大量深棕色阳性染色(图3)。

与假手术组相比，模型组Nrf2和血红素加氧酶1蛋白表达显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，川芎嗪纳米喷雾剂组Nrf2、血红素加氧酶1蛋白表达较之模型组进一步升高(P < 0.01)(图4)，且川芎嗪纳米喷雾剂组细胞核中可见大量棕色颗粒，提示手术损伤导致的氧化应激可促使Nrf2、血红素加氧酶1蛋白表达上调，川芎嗪纳米喷雾剂可诱导Nrf2转入细胞核内激活Nrf2-ARE信号通路，并进一步促进Nrf2、血红素加氧酶1蛋白高表达，从而发挥抗氧化作用。

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引言

术后腹腔粘连是指腹部手术之后，由腹膜局部缺血、感染、组织创伤、异物植入等原因造成的腹腔内脏器或脏器与腹壁之间异常的纤维连接，是腹部手术最常见的并发症之一^[1-2]。据报道，90%以上的开腹手术会发生术后腹腔粘连^[2]，并引发腹痛、女性不孕甚至肠梗阻等严重并发症^[3-4]。即使腹腔镜、宫腔镜等微创技术在临床上广泛应用，极大地减少了腹部外科手术对机体造成的创伤，也仍然不能完全避免术后腹腔粘连的发生^[5]。

中医理论认为，术后腹腔粘连形成与手术导致腹部气血凝滞有关^[6]，川芎为血中之气药，具活血化瘀、行气止痛之功，主要治疗血瘀气滞所致的头痛、胸胁痛、脘腹痛、癥瘕积聚，风寒湿痹，月经不调等病症，临床多应用于心脑血管、呼吸系统、泌尿系统及妇科疾病^[7-8]。川芎嗪是川芎的主要有效成分，当前研究发现，川芎嗪能抑制纤溶酶原激活物抑制剂1的表达，减少细胞外基质沉积，抑制心、肺、肝、肾等脏器的纤维化，并且具有抗炎，清除氧自由基，调节免疫功能的作用^[9-10]。术后腹腔粘连的形成机制目前尚不明确，但研究发现粘连形成与炎症反应、缺血缺氧、纤溶系统失衡密切相关，作者所在课题组既往实验对川芎嗪抗术后腹腔粘连的作用进行研究，发现川芎嗪可抑制异常纤维增生从而有效防治术后腹腔粘连^[11-12]。然而川芎嗪作为一种生物碱，具有吸收快、代谢快、半衰期短的特点^[13]，导致生物利用度低，限制其临床应用，课题组针对川芎嗪的代谢特点研制了川芎嗪纳米制剂，利用纳米技术增加药物颗粒溶解度，提高生物利用度，并结合与聚乳酸发挥覆盖隔离作用。川芎嗪纳米制剂使用方便，靶向性给药，生物利用度高，且具有良好的生物相容性和低细胞毒性，有效弥补了川芎嗪的代谢短板，对促进川芎嗪在临床上的应用意义重大。

氧化应激是术后腹腔粘连形成的重要病理机制^[14]，活性氧是含有氧的化学反应性因子，是氧代谢的副产物，手术创伤、异物侵入等诱因可使机体在短时间内产生大量活性氧，当活性氧堆积超出机体的清除能力时即对组织器官造成过氧化损伤^[15]。氧化应激与炎症反应、免疫失衡、纤溶系统失衡等病理变化息息相关^[14]，因此减少和清除体内活性氧以调控机体抗氧化能力是防治术后腹腔粘连的重要手段。转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-E2- related factor 2，Nrf2)-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)通路是迄今为止发现的最重要的内源性抗氧化应激通路，其调控机体抗氧化能力的作用目前已在消化系统、循环系统、免疫系统等多种疾病中得到初步证实^[16]。作者拟探索川芎嗪纳米喷雾剂对Nrf2-ARE通路蛋白及基因的调控作用，探究川芎嗪抗氧化防治术后腹腔粘连的分子生物学机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年7月至2017年9月在南京中医药大学护理科研实验室完成。

1.3 材料

动物：雄性SD大鼠24只，SPF级，鼠龄8周，体质量(220±20) g，合格证号2010002612192，由上海市杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2013-0006。实验前所有动物适应性喂养1周，自由饮食和饮水。按随机数字表法将大鼠随机分为假手术组、模型组、川芎嗪纳米喷雾剂组和透明质酸钠组，每组6只。实验严格遵循南京中医药大学动物实验使用和保护的规定。

实验用主要试剂与仪器：川芎嗪纳米喷雾剂由南京中医药大学药学院配制^[17]，透明质酸钠凝胶购自山东博士伦福瑞达制药有限公司，活性氧、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶抑制因子1ELISA试剂盒购自南京金益柏生物科技有限公司，台式高速冷冻离心机(Allegra 64R)购自美国Beckman公司，酶标仪(Victor X3)购自美国PerkinElmer公司，Nanodrop 2000c超微量样本分光光度计购自Thermo公司，化学发光成像仪购自美国Bio-Rad公司；TRIzon Reagent、Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒、抗β-action鼠单克隆抗体、羊抗鼠抗体、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自康为世纪公司，反转录试剂盒购自Thermo公司，QPCR预混液购自Vazyme公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，兔抗大鼠Nrf2抗体购自Santa Cruz Biotechnology，兔抗大鼠血红素加氧酶1抗体、兔单克隆抗体PCNA抗体abcam公司，羊抗兔抗体购自Bioworld公司。

1.4 方法

1.4.1 造模方法锉刀法建立大鼠实验性腹腔粘连模型^[18]，造模前禁食12 h，自由饮水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3.5 mL/kg)；仰卧位固定，剃毛、消毒，于下腹部取前正中切口1.5 cm逐层进腹；用什锦锉刀反复磨擦回盲部右侧面浆膜层，直至表面出现点状出血，形成约2.0 cm × 1.5 cm的受损创面，在空气中暴露5 min后纳入腹腔，3-0无菌丝线逐层缝合。

1.4.2 干预方法假手术组：打开腹腔后即逐层缝合，不予造模；模型组：造模后逐层关腹，不给任何药物；川芎嗪纳米喷雾剂组：造模后关腹前创面喷涂川芎嗪纳米喷雾剂5 mL/kg；透明质酸钠组：造模后关腹前创面涂抹1%透明质酸钠凝胶0.5 mL/kg。造模后各组大鼠禁食禁水24 h后方予以进食，分笼饲养7 d。

1.4.3 一般情况及粘连程度评分观察各组大鼠术后进食、活动情况及伤口愈合情况。大鼠术后第8天处死，处死前禁食12 h，自由饮水。于下腹部取“U”形切口开腹，2名实验者独立采用Evans等^[19]发表的评分标准对各组大鼠腹腔粘连程度进行分级，评分标准：0分：无粘连；1分：自发分离的膜状和无血管粘连；2分：坚固而有限的血管粘连，须通过牵引分离；3分：密集的粘连，须通过尖锐切割分离。

1.4.4 血清活性氧、基质金属蛋白酶抑制因子1及基质金属蛋白酶9水平测定大鼠处死前眼眶后静脉丛采血 1.5 mL，全血室温静置1 h后，离心机3 000 r/min离心 20 min，吸取上清液，-80 ℃保存。ELISA检测各组大鼠血清活性氧、基质金属蛋白酶抑制因子1、基质金属蛋白酶9水平。

1.4.5 实时PCR法检测粘连肠组织中Nrf2和血红素加氧酶1 mRNA表达水平打开腹腔找到大鼠回盲部，用眼科剪剪取带有粘连组织的肠管约100 mg，TrIzon试剂盒提取总RNA，Nanodrop 2000c测定各样本中总RNA浓度，A₂₆₀/A₂₀₈的值处于1.8-2.0之间方可使用。转录后的cDNA进行PCR反应，反应体系为20 μL(2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.4 μL，cDNA模板0.5 μL(总量500 ng)，ddH₂O 8.7 μL)，反应条件设置为95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s退火(40个循环)。反应使用引物用Primer Premier 5.0软件设计，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，以GAPDH为内参引物，引物序列：GAPDH：正向5'-ATC TCG CTC CTG GAA GAT GG-3'，反向5'-CAA GTT CAA CGG CAC AGT CA-3'；血红素加氧酶1：正向5'-ATG GAG CGC CCA CAG CTC GAC AGC A-3'，反向 5'-ACT GGG TTC TGC TTG TTT CG-3'；Nrf2：正向5'-CCA TTT ACG GAG ACC CAC-3'，反向5'-TCT GAG CGG CAA CTT TAT-3'。所得结果应用2^-^??Ct表示。

1.4.6 Western blot法检测粘连肠组织核蛋白Nrf2和胞浆蛋白血红素加氧酶1表达水平取“U”型切口开腹，剪取回盲部带有粘连组织的肠管约100 mg，参考Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂盒说明书提取胞浆蛋白和胞核蛋白，nanodrop 2.0测定各样本蛋白含量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同分子量蛋白，然后转移到PVDF膜上，用5%PBST脱脂奶粉封闭2 h，一抗以5%PBST脱脂奶粉按一定比例稀释，4 ℃孵育过夜，PBST漂洗3次，每次5 min。二抗同样以5%PBST脱脂奶粉按一定比例稀释，室温孵育 2 h，PBST漂洗3次，每次10 min。高灵敏度化学发光检测试剂盒检测信号，化学发光成像仪成像，Image Lab 5.0分析条带。

1.4.7 免疫组化法检测Nrf2和血红素加氧酶1蛋白表达取大鼠粘连肠组织100-200 mg，多聚甲醛固定24 h后常规石蜡包埋，4 μm切片行免疫组化法染色。切片常规脱蜡至水后行抗原修复，滴加一抗4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次5 min，后滴加二抗室温孵育30 min，PBS冲洗3次，每次 5 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，树胶封固。每张切片随机选取5个视野下(10×10)结构较完整的肠组织切片，采用Image pro plus 5.0软件计算各组Nrf-2和血红素加氧酶1蛋白阳性区域的平均光密度值。

1.5 主要观察指标大鼠腹腔粘连程度分级；ELISA测定大鼠血清活性氧、基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶抑制因子1表达水平；RT-PCR、Western blot和免疫组化法测定大鼠粘连肠组织中Nrf2和血红素加氧酶的表达情况。

1.6 统计学分析数据采用SPSS 16.0软件包进行统计分析。大鼠各组粘连评级比较采用行×列表的χ²检验，并两两比较，P < 0.008为差异有显著性意义。符合正态分布的计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用LSD法，相关性分析采用偏相关分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

生理状态下，机体氧化抗氧化系统保持动态平衡，当受到应激源刺激时，机体氧化还原系统失衡诱发氧化应激，持续的氧化应激会破坏细胞如脂质、蛋白质和核酸的结构和功能，损伤生物大分子，造成氧化损伤^[20]。活性氧是含有氧的化学反应性因子，在细胞信号传导和维持细胞稳态方面发挥重要作用^[21]，活性氧异常升高可导致血管细胞损伤、炎性细胞募集、脂质过氧化等反应^[22]，活性氧还可介导血管纤维化变化，调节胶原和纤维连接蛋白^[23]，有研究报道，活性氧可诱导成纤维细胞增殖和细胞外基质分泌，从而促使组织纤维化。研究结果显示，模型组大鼠血清活性氧水平较假手术组升高，提示手术导致的损伤促使活性氧生成增多，对机体造成氧化损伤，引发缺血缺氧、炎症反应等病理变化，从而促使粘连形成，可见活性氧表达水平升高与术后腹腔粘连的形成密切相关。基质金属蛋白酶抑制因子1/基质金属蛋白酶9在组织胶原代谢中发挥关键作用，其失衡可导致细胞外基质代谢失衡，胶原纤维溶解功能障碍^[24]，实验结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠血清基质金属蛋白酶抑制因子1表达水平上调，而基质金属蛋白酶9表达水平下调，提示实验性术后腹腔粘连大鼠基质金属蛋白酶抑制因子1/基质金属蛋白酶9的相对平衡被打破，导致细胞外基质积聚增多，纤溶系统功能紊乱。与模型组相比，川芎嗪纳米喷雾剂可降低实验性腹腔粘连大鼠血清活性氧和基质金属蛋白酶抑制因子1水平，升高基质金属蛋白酶9水平，提示川芎嗪纳米喷雾剂具有纠正氧化应激、恢复基质金属蛋白酶抑制因子1/基质金属蛋白酶9平衡、抑制纤维沉积的作用，此外，相关性分析结果显示，活性氧与基质金属蛋白酶9表达水平呈负向直线相关，基质金属蛋白酶9可促进细胞外基质降解，减少纤维沉积^[24]，而活性氧的表达水平升高会抑制基质金属蛋白酶9的表达，抑制纤维蛋白溶解，从而促使组织粘连形成。氧化应激与纤溶系统失衡的病理变化密切相关、互相影响，均对术后腹腔粘连的形成有重要的影响，纠正机体氧化应激状态，有利于恢复纤溶系统平衡和腹腔环境的内稳态，因此抑制机体氧化应激可作为防治术后腹腔粘连的一个有效途径进行深入研究。

Nrf2-ARE信号通路是重要的内源性抗氧化应激防御机制^[25]，生理状态下，Nrf2与Keap1偶联存在于细胞质中并经泛素化降解，当受到有害刺激时，Nrf2与Keap1解离并活化转位进入细胞核，在核内与ARE结合激活Nrf2-ARE信号通路，诱导机体抗氧化基因表达，防止自由基产生^[26]。Nrf2是Nrf2-ARE信号通路中的关键因子，是细胞抗氧化防御机制的中枢调节者，当前研究发现，Nrf2能降低细胞对死亡信号的敏感性，具有消除毒素和致癌物质、恢复细胞稳态的作用^[27]。血红素加氧酶1是一种重要的抗氧化剂酶，能通过清除自由基发挥细胞保护作用^[28]，Nrf2活化可诱导血红素加氧酶1高表达，诱导下游编码抗氧化蛋白酶和Ⅱ相解毒酶的基因表达^[29]，在外源性和内源性抗氧化应激中都具有重要作用。研究结果显示，实验性术后腹腔粘连大鼠Nrf2、血红素加氧酶1蛋白和mRNA表达均较假手术组升高，提示手术损伤破环生物内稳态，可能引发机体自身的代偿性保护机制，应激状态下激活Nrf2-ARE信号通路，诱导Nrf2、血红素加氧酶1表达上调，以抵御有害刺激对机体造成的损伤。与模型组相比，川芎嗪纳米喷雾剂组Nrf2、血红素加氧酶1蛋白和mRNA表达水平进一步升高，且细胞核内蛋白表达明显增多，提示实验性术后腹腔粘连大鼠经川芎嗪纳米喷雾剂干预后Nrf2蛋白被激活并转入核内，进一步诱导Nrf2和血红素加氧酶1表达，以发挥抗氧化和细胞保护作用。可见激活Nrf2-ARE信号通路，诱导其抗氧化蛋白表达可能是川芎嗪纳米喷雾剂发挥抗粘连作用的有效靶点和途径，调控Nrf2-ARE信号通路可能为防治术后腹腔粘连的深入研究提供新的尝试和思考。

Nrf2-ARE 信号通路在维持机体氧化还原平衡和细胞稳态方面具有重要意义，然而有研究发现，Nrf2在降低肿瘤细胞易感性同时还能增加肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，可能促进癌症病程的发展^[30-31]，其机制目前尚不明确，有研究认为Nrf2增强肿瘤细胞耐药性可能与Nrf2调控肿瘤细胞使其免受过度氧化应激、化疗、放疗等作用有关^[32]，因此在氧化还原系统恢复平衡后Nrf2与ARE解离并出核避免过度堆积对Nrf2发挥调控作用具有重要意义，提示Nrf2出核转运机制正常是防止肿瘤细胞耐药性产生的重要保证，同时也提示临床工作者在治疗肿瘤的不同阶段对Nrf2的调控要根据具体情况制定治疗方案。此外，血红素加氧酶1的过度表达会使铁离子和一氧化碳异常升高，产生细胞毒性作用^[33]。鉴于Nrf2-ARE 信号通路及其下游蛋白对机体的双向调节作用，对此通路进行深入研究有助于明确其在生物体内发挥作用的条件和靶点，从而为通过调控Nrf2-ARE信号通路预防和治疗疾病提供理论依据。

研究仍存在一定的局限性，实验设计以药物干预为立足点正向探究了川芎嗪纳米喷雾剂对Nrf2-ARE信号通路的影响，但未从通路蛋白角度出发反向验证实验结果，要明确Nrf2-ARE信号通路在防治术后腹腔粘连中的具体作用机制，尚需进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

川芎嗪纳米喷雾剂干预术后腹腔粘连

Ligustrazine nano-spray against postoperative abdominal adhesion

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