骨髓间充质干细胞联合脱细胞真皮基质修复尿道损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0486

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
组织工程尿道的构建：一般可分为2类方法：①以单纯支架材料构建尿道，主要通过宿主组织细胞长入移植物，并分泌细胞外基质，从而替代逐步降解吸收的支架材料，达到重建尿道的目的；②采用种子细胞与支架复合物构建尿道，将制备的种子细胞接种到支架材料上，之后在短时间内植入宿主体内，种子细胞依照基质材料提供的框架生长，达到一定时间后生物材料开始逐渐降解，从而达到修复的目的。
脱细胞基质材料：完全去除了带有个体差异的实质细胞，降低了免疫原性，保留了细胞外的特殊蛋白多糖、氨基酸序列等功能基团，为细胞生长提供支撑和良好的微环境，更好地促进细胞的生长、增殖及分化。

摘要
背景：近年来，组织工程学的发展为尿道损伤修复提供了更多的选择。
目的：探讨骨髓间充质干细胞联合脱细胞真皮基质修复尿道损伤的效果。
方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，接种于脱细胞真皮基质材料表面，构建组织工程尿道。将36只新西兰大白兔随机分3组，每组12只。实验组于尿道损伤处植入骨髓间充质干细胞-脱细胞真皮基质复合物，对照组于尿道损伤处植入单纯脱细胞真皮基质材料，正常组既无损伤也不做任何处理。术后4，8，12周，尿道修复组织进行苏木精-伊红染色，术后12周，进行免疫组织化学染色和尿动力学检查。
结果与结论：①术后4周，实验组尿道缺损区可见有少许薄层上皮再生，连续性较好；对照组修复段尿道新生黏膜尚不连续。术后8-12周，实验组修复段尿道上皮层逐渐变厚，与正常尿道上皮连续性良好，黏膜逐渐增厚，尿道黏膜光滑连续；对照组修复段尿道新生黏膜连续性较好，再生上皮层次较少；②术后12周，免疫组化可见实验组修复尿道标本uroplakin Ⅲa，CK AE1/AE3，α-SMA表达阳性；③实验组手术前后的最大尿道压比较差异无显著性意义；对照组术后最大尿道压高于术前，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，骨髓间充质干细胞联合脱细胞真皮基质修复尿道损伤的效果优于单纯脱细胞真皮基质材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5992-9509(符津山)

关键词: 干细胞, 脱细胞基质, 骨髓间充质干细胞, 尿道损伤, 组织工程, 海南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, the development of tissue engineering provides more choices for the repair of urethral injury.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) combined with acellular dermal matrix in the repair of urethral injuries.
METHODS: Passage 3 BMSCs from New Zealand white rabbits were inoculated on the acellular dermal matrix to construct tissue-engineered urethra grafts. Thirty-six New Zealand rabbits were randomized into three groups (n=12 per group). Experimental group was implanted with BMSCs-acellular dermal matrix complex at urethral injury. Control group was implanted with acellular dermal matrix material at urethral injury. Normal group had neither injury nor treatment. At postoperative 4, 8 and 12 weeks, the repaired urethral tissue was subjected to hematoxylin-eosin staining. At postoperative 12 weeks, immunohistochemical staining and urodynamic study were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: At postoperative 4 weeks, thin-layer epithelial regeneration was visible in the urethra defect area of the experimental group, and the continuity was better. The urethra mucosa of the control group was discontinuous. At postoperative 8-12 weeks, the urethral epithelial layer in the experimental group became thickened, exhibiting a good continuity with the normal urethral epithelium, thickened mucosa, and smooth and continuous urethral mucosa; the regenerated urethral mucosa of the control group exhibited good continuity, but less regenerated epithelial layers. At postoperative 12 weeks, immunohistochemical results showed the repaired urethra in the experimental group was positive for uroplakin IIIa, CK AE1/AE3, and α-smooth muscle actin. The maximum urethral pressure in the experimental group showed no significant difference before and after operation, while the postoperative pressure in the control group showed a significant increase (P < 0.05). Overall findings indicate that the combination of BMSCs and acellular dermal matrix has better efficacy than the acellular dermal matrix alone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Urethral Diseases, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

符津山，周治彦，许思怡. 骨髓间充质干细胞联合脱细胞真皮基质修复尿道损伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2075-2080.

Fu Jin-shan, Zhou Zhi-yan, Xu Si-yi. Bone marrow mesenchymal stem cells combined with acellular dermal matrix for repair of urethral injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2075-2080.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的形态 骨髓间充质干细胞原代培养过程中，约24 h即可出现贴壁生长，细胞呈圆形、梭形、三角形，生长缓慢，换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14 d达70%-80%融合，可传代；传代细胞形态单一，呈梭形或扁平形，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列(图1)。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定

2.2.1 CD34、CD44表面标记物 流式细胞仪检测结果显示，骨髓间充质干细胞表面标记物CD44阳性表达，CD34阴性表达(图2A)。

2.2.2 成骨诱导分化能力 成骨诱导培养21 d，茜素红染色可见钙结节，呈阳性(图2B)。

2.2.3 成脂诱导分化能力 成脂诱导培养21 d，油红O染色可见红色的脂滴颗粒，呈阳性(图2C)。

2.3 动物实验结果

2.3.1 大体观察结果 术后4周，实验组脱细胞基质材料表面由黏膜覆盖，尿道表面光滑；对照组脱细胞基质表面无黏膜覆盖。随着时间的推移，术后12周时，实验组尿道黏膜表面无瘢痕形成，尿道及膀胱也未形成结晶；对照组尿道表面瘢痕明显，尿道及膀胱可见大量结晶。各时间点正常组尿道黏膜光滑平整。

2.3.2 苏木精-伊红染色观察结果 见图3。术后4周，实验组尿道缺损区可见有少许薄层上皮再生，连续性较好；对照组修复段尿道新生黏膜尚不连续。术后8-12周，实验组修复段尿道上皮层逐渐变厚，与正常尿道上皮连续性良好，黏膜逐渐增厚，尿道黏膜光滑连续；对照组修复段尿道新生黏膜连续性较好，再生上皮层次较少。

2.3.3 免疫组织化学染色观察结果 术后12周，免疫组化可见实验组修复尿道标本uroplakin Ⅲa阳性，CK AE1/AE3阳性。证实有成熟上皮细胞覆盖，且上皮细胞之间有连接功能。抗α-SMA免疫组化阳性证实新生尿道有排列规则的平滑肌束(图4)。

2.3.4 尿道造影检查结果 实验组未发生尿道明显狭窄及尿瘘等并发症，对照组有实验动物出现尿道狭窄及尿瘘等并发症，但由于剩余实验动物数量较少，未进行统计学分析。

2.3.5 尿动力学检查结果 实验组手术前后的最大尿道压比较差异无显著性意义；对照组手术前后的最大尿道压比较差异有显著性意义(表1)。

参考文献

[1] Hong YK, Choi KH, Lee YT, et al. Predictors for success of internal urethrotomy in patients with urethral contracture following perineal repair of pelvic fracture urethral injuries. Injury. 2017;48(5):1035-1039.

[2] 唐勇,李养群,赵穆欣,等.口腔黏膜卷管游离移植一次性重建远段尿道[J].中华整形外科杂志,2017,33(1):34-36.

[3] 江志勇,李学德,何庆鑫,等.下唇黏膜或加颊黏膜与生殖器带蒂皮瓣联合修复复杂性长段前尿道狭窄[J]. 中国男科学杂志,2015, 29(6):44-47.

[4] 何越,田智泉,郜香黎,等.人羊膜脱细胞基质填充材料的生物相容性及动物有效性研究[J].中国美容整形外科杂志,2016,27(6): 381-384.

[5] 南文滨,徐志浩,王永学,等.脱细胞胶原基质双层材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性研究[J].国际生物医学工程杂志,2016, 39(1):16-19.

[6] Hon HH, Mubang RN, Wernick BD, et al. Acellular Dermal Matrix Versus Inferior Deepithelialized Flap Breast Reconstruction: Equivalent Outcomes, with Increased Cost. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2017;5(6):e1382.

[7] Qayyum AA, Kaur KP, Mathiasen AB, et al. Influence of patient related factors on number of mesenchymal stromal cells reached after in vitro culture expansion for clinical treatment. Scand J Clin Lab Invest. 2017;77(7):541-548.

[8] Zhang X, Bendeck MP, Simmons CA, et al. Deriving vascular smooth muscle cells from mesenchymal stromal cells: Evolving differentiation strategies and current understanding of their mechanisms. Biomaterials. 2017;145:9-22.

[9] Shudo Y, Goldstone AB, Cohen JE, et al. Layered smooth muscle cell-endothelial progenitor cell sheets derived from the bone marrow augment postinfarction ventricular function. J Thorac Cardiovasc Surg. 2017;154(3):955-963.

[10] 吴梦青,朱榕嘉,刘开彦.失血性贫血小鼠骨髓间充质干细胞向成骨成脂分化的变化[J].中国实验血液学杂志,2014,22(1): 177-182.

[11] 丁浩.大鼠血管内皮细胞对大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导的影响研究[D].泸州:西南医科大学,2015.

[12] 赵刚,刘微微,高伟玮,等.不同组织来源间充质干细胞体外成骨分化能力的比较研究[J].中国骨质疏松杂志,2017,23(5):561-566, 584.

[13] 唐宇星,赵庆,杨中萌,等.音猬因子修饰纳米晶胶原基骨复合骨髓间充质干细胞修复股骨缺损[J].中国组织工程研究,2017,21(14): 2180-2185.

[14] 陈能,邵云峰,刘傥,等.带部分松质骨小牛皮质骨复合骨髓间充质干细胞植入兔体内成骨及骨形态发生蛋白2的表达[J].中国组织工程研究,2017,21(17):2684-2689.

[15] Ishihara K, Nakayama K, Akieda S, et al. Simultaneous regeneration of full-thickness cartilage and subchondral bone defects in vivo using a three-dimensional scaffold-free autologous construct derived from high-density bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 2014;9:98.

[16] 余瑞新,杜远立.骨髓间充质干细胞向软骨分化的研究进展[J].中国医药导刊,2012,14(1):94,103.

[17] Lemcke H, Gaebel R, Skorska A, et al. Mechanisms of stem cell based cardiac repair-gap junctional signaling promotes the cardiac lineage specification of mesenchymal stem cells. Sci Rep. 2017;7(1):9755.

[18] 邓宁波,曾元清,韩腾龙,等.hHO-1联合GATA-4修饰大鼠骨髓间充质干细胞抗凋亡及向心肌分化的实验研究[J].解放军医学杂志,2017,42(4):314-319.

[19] 韩效林,李敬东,王婉玲,等.抗坏血酸促进骨髓间充质干细胞的上皮转分化[J].中国组织工程研究, 2017,21(1):13-17.

[20] Di G, Du X, Qi X, et al. Mesenchymal Stem Cells Promote Diabetic Corneal Epithelial Wound Healing Through TSG-6-Dependent Stem Cell Activation and Macrophage Switch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017;58(10):4344-4354.

[21] Rowart P, Erpicum P, Krzesinski JM, et al. Mesenchymal Stromal Cells Accelerate Epithelial Tight Junction Assembly via the AMP-Activated Protein Kinase Pathway, Independently of Liver Kinase B1. Stem Cells Int. 2017; 2017:9717353.

[22] 郭海林.组织工程尿道重建从基础到临床应用的反思[J].现代泌尿外科杂志,2016,21(2):152-155,158.

[23] 杜小文,陈浩浩,刘庆,等.内纵外螺旋双层结构管状尿道支架复合体修复尿道缺损的可行性及其血管化方法[J].中华泌尿外科杂志,2017,38(1):59-65.

[24] 林阳彦,王沫,杨勇,等.尿道上皮细胞/片状多孔丝素蛋白支架复合物修复兔尿道缺损的实验研究[J].中国男科学杂志,2016, 30(3):14-18.

[25] Kajbafzadeh AM, Abbasioun R, Sabetkish S, et al. Future Prospects for Human Tissue Engineered Urethra Transplantation: Decellularization and Recellularization- Based Urethra Regeneration. Ann Biomed Eng. 2017;45(7): 1795-1806.

[26] Simões IN, Vale P, Soker S, et al. Acellular Urethra Bioscaffold: Decellularization of Whole Urethras for Tissue Engineering Applications. Sci Rep. 2017;7:41934.

[27] 蔡炳,李科,脱颖,王德娟.诱导多能干细胞向尿道上皮细胞分化体系的建立[J].中华腔镜泌尿外科杂志:电子版,2016,10(3):40-43.

[28] 李泸平.组织工程化尿道构建及尿道缺损修复的实验性研究[D]. 郑州:郑州大学,2016.

引言

对于先天性尿道下裂及尿道外伤、肿瘤、尿道狭窄等疾病，外科手术是有效的治疗方法，需要进行尿道修复或尿道重建手术。传统的尿道修复方法多应用患者自身包皮、阴囊组织原位修复，或者应用颊黏膜、膀胱黏膜等自体组织移植修复处理，但该方法产生的并发症较多，术后尿道瘘、尿道再狭窄、尿道结石等均较为常见，然而还有一部分患者因尿道缺损较长而存在自身修复材料不足等问题^[1-3]。因此学者们一直在寻找更加理想的尿道修复材料。

近年来，组织工程学的发展为尿道损伤修复提供了更多的选择。组织工程学包括种子细胞、细胞因子及生物材料(支架)3大要素，其将种子细胞种植于生物材料上，然后将细胞-支架复合物植入体内，修复受损组织或器官，细胞因子的作用就是促进细胞与支架的整合或植入物与体内微环境的整合。用于构建组织工程复合物的支架材料有很多，包括天然材料和人工材料，每种材料都有其自身的优点，适用于不同的组织修复。脱细胞基质材料完全去除了带有个体差异的实质细胞，降低了免疫原性，保留了细胞外的特殊蛋白多糖、氨基酸序列等功能基团，为细胞生长提供支撑和良好的微环境，更好地促进细胞的生长、增殖及分化^[4-7]。骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的干细胞，可分化为平滑肌细胞^[8-9]、脂肪细胞^[10-11]、成骨细胞^[12-14]、软骨细胞^[15-16]、心肌细胞^[17-18]、上皮细胞等^[19-21]，具有较强的增殖能力与可塑性^[7]，在组织工程研究中应用广泛。

实验将骨髓间充质干细胞种植于脱细胞真皮基质材料上，构建组织工程尿道，观察其修复尿道损伤的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机分组，对比观察动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年4至12月在海南医学院第一附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 成年健康雄性新西兰大白兔46只，体质量2.2-3.0 kg，由海南医学院科学实验中心提供，其中4只用于培养骨髓间充质干细胞，6只用于制备脱细胞真皮基质，另36只用于尿道损伤修复实验。动物实验经过海南医学院第一附属医院伦理委员会批准，对动物的处置遵循动物伦理要求。

1.3.2 主要试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清(GIBCO，美国)；胰蛋白酶、青/链霉素溶液(Beyotime，中国)；PBS(中山，北京)；油红O粉剂、茜素红粉剂(Sigma，美国)；淋巴细胞分离液(TBD)；CK AE1/AE3，uroplakin Ⅲa，α-SMA鼠抗兔单克隆抗体，兔抗大鼠CD44、CD34抗体，FITC标记的山羊抗兔抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；成骨、成脂细胞诱导培养液(上海赛弗生物科技有限公司)。

1.3.3 主要仪器 光学显微镜、倒置显微镜(OLYMPUS，日本)；迷你型超速离心机、微型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；CO₂恒温细胞孵箱(美国SHELLAB公司)；细胞培养瓶及细胞培养板(美国Costar公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脱细胞真皮基质材料制备 为同种异体的皮肤组织经脱细胞处理而成的细胞外基质。无菌条件下切取6只雄性新西兰大白兔背部8 cm×8 cm全层皮肤，用庆大霉素稀释液反复冲洗，然后置于0.25%胰酶-EDTA消化液中，4 ℃孵育48 h以去除表皮层，PBS冲洗3遍，放入0.5%的曲拉通X-100溶液中，振荡24 h，使真皮中细胞完全脱净，PBS冲洗至曲拉通X-100溶液无残留，制备好的脱细胞真皮基质置于PBS中，4 ℃保存备用。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的分离培养 取4只新西兰大白兔，麻醉处死后立即用体积分数75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出股骨和胫骨，剔除表面附着肌肉，PBS冲洗2遍。从中间剪断股骨和胫骨，用2 mL无菌注射器吸取DMEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓，反复吹打，吸管吸入离心管内，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用PBS重悬细胞。缓慢将细胞悬液加入预先装有5 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管内，保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层，注意不要搅动液面，保持二者分层界面。2 000 r/min离心15-25 min，离心后溶液分4层，吸取中间白色浑浊状细胞层，PBS洗3次。用含体积分数15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12重悬细胞，以1×10⁹ L^-1的细胞浓度接种于25 cm²培养瓶中，置37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养。24 h后弃去培养液，PBS冲洗两三次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3 d半量换液1次，一般10 d左右细胞生长融合。经0.25%胰酶消化，1︰2传代，其后3-5 d传代1次，选取生长良好的第3代细胞进行后续实验。

1.4.3 骨髓间充质干细胞的鉴定

表面标志物检测：取第3代骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液，胰蛋白酶消化后离心，PBS清洗3次，PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，分装于离心管中，分别加入单克隆抗体，流式细胞仪检测CD34和CD44的表达。

骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化：取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁹ L^-1的细胞浓度接种至6孔板，加入成骨细胞诱导培养液(含10 μmol/L地塞米松，50 μmol/L维生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油钠，体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)培养21 d，进行茜素红染色，观察钙结节形成情况。

骨髓间充质干细胞的成脂诱导分化：取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁹ L^-1的细胞浓度接种至6孔板，加入成脂细胞诱导培养液(含1 μmol/L地塞米松，200 μmol/L吲哚美辛，0.5 μmol/L IBMX，10 mg/L胰岛素，体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)培养21 d，进行油红O染色，观察脂滴形成情况。

1.4.4 骨髓间充质干细胞-脱细胞真皮基质复合物的构建 在接种细胞前72 h，将脱细胞基质材料浸泡于无血清的DMEM/F12培养基中，每24 h更换培养液1次；接种细胞前24 h，吸干培养液，在材料两侧均匀涂抹50 μL血清，备用。取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化后，离心，以培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2×10⁶ L^-1，将100 μL细胞悬液滴于脱细胞基质材料表面，置于细胞培养箱中37 ℃保存。

1.4.5 尿道损伤模型建立 将36只兔随机分3组，每组12只。正常组既无损伤也不做任何处理；实验组于尿道损伤处植入骨髓间充质干细胞-脱细胞真皮基质复合物，对照组于尿道损伤处植入单纯脱细胞基质材料。实验组和对照组新西兰大白兔耳缘静脉注射1 mL/kg水合氯醛麻醉后，平卧位固定，常规会阴区备皮、消毒、铺巾，留置导尿管，在阴茎头处缝牵引线并固定尿管，以生理盐水冲洗膀胱，在阴茎腹侧中段切开一长约3.0 cm切口，依次切开各层组织，充分暴露局部尿道组织，用眼科剪剪除长约2.0 cm×1.0 cm的尿道，完成模型制作。在植入前，将脱细胞基质材料以导尿管为支撑缝合为管状。术后以庆大霉素清洗创口，预防感染。术后10 d拔出导尿管。

1.4.6 苏木精-伊红染色 术后4，8，12周，每个时间点每组随机取3只兔，处死后获取尿道修复组织，用体积分数10%甲醛固定，常规脱水、浸蜡、包埋后制成组织蜡块，切成4 μm厚的连续切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察。

1.4.7 免疫组织化学染色 术后12周的实验组修复尿道标本切片分别在抗细胞角蛋白单克隆抗体(CK AE1/AE3)和抗uroplakin Ⅲa抗体中孵化，然后加入相应种属二抗观察尿道上皮的再生情况，采用抗α-SMA抗体检测平滑肌的再生情况。标本脱蜡、脱水操作同苏木精-伊红染色。染色大致步骤为：切片脱蜡后滴加体积分数0.3%H₂O₂，依次用纯水、PBS浸泡并冲洗。切片浸泡于枸椽酸盐溶液中，加热至92-98 ℃，持续10-15 min。取出切片冷却、冲洗、封闭。滴加适当比例稀释的一抗，37 ℃反应1.0-2.0 h。PBS反复冲洗标本3次，每次持续5 min。滴加标记二抗工作液，孵育10-30 min，PBS冲洗过程同前。加入DAB显色后水洗，之后进行苏木精复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.4.8 尿道造影和尿动力学检查 术后12周，每组取3只兔，分别行尿道造影和尿动力检查，观察尿瘘、尿道狭窄发生情况及尿道压变化。

1.5 主要观察指标 ①术后4，8，12周，各组兔尿道修复组织苏木精-伊红染色结果；②术后12周，实验组尿道修复组织免疫组织化学染色结果；③术后12周，各组兔尿道造影和尿动力检查结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0进行统计学分析，实验数据以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，检验水准为α=0.05。

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讨论

组织工程构建尿道一般可分为2类方法：①以单纯支架材料构建尿道，主要通过宿主组织细胞长入移植物，并分泌细胞外基质，从而替代逐步降解吸收的支架材料，达到重建尿道的目的。比较常见的支架材料有：小肠下黏膜组织、羊膜、膀胱黏膜下基质、真皮脱细胞材料等。与以往人工合成材料相比，此类生物材料可介导上皮重生及新生血管的形成，组织相容性较好，免疫排斥反应及并发症较少，可介导体内活性因子增加种子细胞的黏附与增殖分化^[22-23]；②采用种子细胞与支架复合物构建尿道，将制备的种子细胞接种到支架材料上，之后在短时间内植入宿主体内，种子细胞依照基质材料提供的框架生长，达到一定时间后生物材料开始逐渐降解，从而达到修复的目的^[24-26]。本研究选择第2种方案构建组织工程尿道，观察其相较于单纯支架材料的修复效果。

已有研究证实，骨髓间充质干细胞与脱细胞基质材料具有良好的生物相容性^[5]。实验采用骨髓间充质干细胞与脱细胞基质材料构建组织工程尿道修复兔尿道损伤，苏木精-伊红染色显示，随着时间的进展，实验组尿道重建区尿道上皮细胞由单层演变为多层，术后12周时接近正常尿道组织结构；对照组虽有一定的修复效果，但尿道上皮再生情况不及实验组。尿路上皮细胞在尿道发挥正常功能中具有举足轻重的作用，可抵抗尿液腐蚀、防止结石形成^[27]。实验结果说明骨髓间充质干细胞在尿道损伤中发挥着重要作用，可促进尿道上皮细胞的形成。并且大体观察结果同样也说明了实验组尿道上皮细胞再生效果较好。实验组尿道上皮细胞出现的时间快于对照组，并且在术后8-12周时黏膜逐渐增厚，尿道黏膜光滑连续，说明骨髓间充质干细胞在其中发挥了重要作用；相对于单纯脱细胞真皮基质修复，骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质构建的组织工程尿道具有更好的修复效果。尿道造影检查结果显示，实验组未发生尿道明显狭窄及尿瘘等并发症，对照组有实验动物出现尿道狭窄及尿瘘等并发症，但由于剩余实验动物数量较少，未进行统计学分析。此结果说明实验组构建的组织工程尿道有降低尿道狭窄及尿瘘并发症的趋势，与以往的研究报道相符^[28]。但此次实验未做全尿道解剖和功能观察，将在后续实验中加入相关检查，进一步验证最大尿道压出现变化的原因。尿动力学检查结果显示，实验组手术前后的最大尿道压比较差异无显著性意义；对照组手术前后的最大尿道压比较差异有显著性意义，说明实验组重建尿道表面无明显梗阻与瘢痕形成，尿路通畅。

实验结果虽证实了骨髓间充质干细胞与脱细胞基质材料构建的组织工程尿道可良好地修复尿道损伤，但实验观察时间较短，对于远期效果尚不得而知，并且骨髓间充质干细胞植入后的远期分化需要进行活体示踪观察。为了发挥和扩展组织工程的潜力，一定要继续研究种子细胞参与再生过程的途径及具体机制，使其在体内外更好地扩增。未来可将基因技术融合于细胞培养中，以达到更接近人体正常组织的效果。最后还要继续探索支架制备工艺研究，以更利于种子细胞的增殖与分化。

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