骨髓间充质干细胞对衰老大鼠学习能力的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0506

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 1999-2004.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0506

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骨髓间充质干细胞对衰老大鼠学习能力的影响

刘洋¹，王飞清¹，刘燕青¹，李红日¹，张波¹，李艳菊²

¹贵阳中医学院第一附属医院，贵州省贵阳市 550001；²贵州医科大学附属医院血液科，贵州省贵阳市 550004

修回日期:2018-03-29 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 李艳菊，博士，副主任医师，贵州医科大学附属医院血液科，贵州省贵阳市 550004
作者简介:刘洋，男，1978年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，博士，副教授，主要从事干细胞生物学功能研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31660326)；贵州省科学技术厅项目(黔科合基础[2016]1019、黔科合LH字[2017]7140号)；贵州省教育厅拔尖人才项目(黔教合KY[2016]074)；贵中医科研院内[2016]47号

Bone marrow mesenchymal stem cells improve learning ability of the aging rat

Liu Yang¹, Wang Fei-qing¹, Liu Yan-qing¹, Li Hong-ri¹, Zhang Bo¹, Li Yan-ju²

¹First Affiliated Hospital of Guiyang University of TCM, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; ²Department of Hematology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Revised:2018-03-29 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Li Yan-ju, M.D., Associate chief physician, Department of Hematology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Liu Yang, M.D., Associate professor, First Affiliated Hospital of Guiyang University of TCM, Guiyang 550001, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31660326; the grant from the Science and Technology Department of Guizhou Province, No. [2016]1019, LH[2017]7140; the Top Talent Program of Guizhou Provincial Department of Education, No. KY[2016]074; the grant from the Guizhou Institute of Traditional Chinese Medicine, No. [2016]47

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
氧化应激：是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。同时氧化应激是自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。
脑源性神经营养因子：是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用。脑源性神经营养因子能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化，而且也是维持成熟神经元生存及正常生理功能所必需。

摘要
背景：目前国内外研究表明骨髓间充质干细胞可作为理想的种子细胞用于修复衰老和病变引起的组织器官损伤。
目的：探讨骨髓间充质干细胞对衰老大鼠脑组织氧化水平及脑源性神经营养因子表达的影响，解析其修复衰老大鼠学习记忆能力的机制。
方法：选用清洁级SD大鼠30只，分为对照组、模型组和细胞治疗组，每组10只，雌雄各半。采用D-半乳糖皮下连续注射3个月方式构建大鼠衰老模型，造模成功后，细胞治疗组大鼠尾静脉注射骨髓间充质干细胞，每周输入1次，共输入8次。末次移植后采用Morris水迷宫法检测各组大鼠学习记忆能力，采用黄嘌呤氧化法检测脑组织中超氧化物歧化酶活性，硫代巴比妥酸法检测脑组织中丙二醛水平，采用Fe3+还原法检测脑组织总抗氧化能力，采用Real-Time PCR和免疫印记法检测衰老大鼠脑组织脑源性神经营养因子mRNA和蛋白表达。
结果与结论：①与模型组相比，细胞治疗组大鼠脑组织超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、脑源性神经营养因子mRNA和蛋白水平升高(P < 0.05)，丙二醛水平降低(P < 0.05)；②与模型组比较，细胞治疗组大鼠穿越平台时间减少，穿越平台次数增多，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，骨髓间充质干细胞改善衰老大鼠学习记忆能力可能是通过提高抗氧化能力，调节脑源性神经营养因子表达来实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6037-9727(刘洋)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 衰老, D-半乳糖, 超氧化物歧化酶, 丙二醛, 总抗氧化能力, 脑源性神经营养因子, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: At present, studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have self-renewal ability, which can be used as ideal seed cells for repairing tissue and organ damages caused by aging and lesions.
OBJECTIVE: To study the changes in the levels of oxidation, inflammatory factors and neurotrophic factors (BDNF) in the brain of aging rats undergoing BMSCs transplantation, and to analyze the mechanism underlying the repair of learning and memory ability in the aging rats.
METHODS: A total of 30 clean Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, model group and BMSCs group, 10 rats in each group. Aging models were made in the rats by 3-month subcutaneous injection of D-galactose. After modeling, BMSCs treatment was performed via tail vein injection in the BMSCs group. The injection was performed once a week, for 8 continuous weeks. Morris water maze was used to detect the learning and memory abilities of the rats in each group after the final injection of BMSCs. Superoxide dismutase activity in the brain tissue of rats was detected by xanthine oxidase method. Level of malondialdehyde in the rat brain tissue was detected by thiobarbituric acid method. Total antioxidant capacity of the brain tissue was detected by Fe3+ reduction method. Real-time PCR and western blot assay were used to detect the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the brain tissue of the aging rat, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the BMSCs group exhibited significantly higher activity of superoxide dismutase, stronger total antioxidant capacity, and higher levels of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein (P < 0.05), but the lower malondialdehyde level in the brain (P < 0.05). Compared with the model group, there was less time and higher frequency for passing through the platform in the BMSCs group (P < 0.05). Our findings further indicate that BMSCs can improve the abilities of learning and memory in aging rats, and the underlying mechanism is likely to improve antioxidant capacity and to regulate the level of brain-derived neurotrophic factors.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Aging, Brain-Derived Neurotrophic Factor, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘洋，王飞清，刘燕青，李红日，张波，李艳菊. 骨髓间充质干细胞对衰老大鼠学习能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 1999-2004.

Liu Yang, Wang Fei-qing, Liu Yan-qing, Li Hong-ri, Zhang Bo, Li Yan-ju. Bone marrow mesenchymal stem cells improve learning ability of the aging rat[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 1999-2004.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞的培养形态以及鉴定结果 刚接种时，于显微镜下观察可见悬浮于其中的大量骨髓细胞，无贴壁细胞；第3天换液，大量的造血干血细胞被除去，于显微镜下可观察到培养瓶底壁贴壁的细胞分布不均，部分呈巢状生长；第6天可见形成多个成纤维样细胞集落，10 d左右细胞融合80%-90%。传代培养后细胞形态基本上趋于一致，光镜下见细胞呈星形，梭形，见图1。

经流式细胞仪检测，第3代骨髓间充质干细胞的特异性表面标志物CD105，CD90，CD73呈阳性表达，阳性率分别为99.81%，99.62%，96.25%；CD11b，CD45，HLA-DR，CD19，CD34呈阴性表达，阴性率分别为0.11%，0.22%，0.08%，0.07%，0.03%，提示第3代贴壁细胞为骨髓间充质干细胞，见图2。

2.2 实验动物数量分析 30只SD大鼠均进入结果分析，无脱失。

2.3 水迷宫检测大鼠学习记忆能力变化 通过水迷宫空间探索实验，模型组和细胞治疗组大鼠首次穿越平台时间明显大于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组比较，细胞治疗组大鼠穿越平台时间减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。穿越平台次数对照组明显多于模型组和细胞治疗组，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组比较，细胞治疗组大鼠穿越平台次数明显多于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.4 光镜观察大鼠脑组织病理形态 200倍光镜下观察，对照组可见形态规则的尼氏小体、星形细胞，核仁清晰，未见衰老现象(图3A)。模型组大鼠脑组织尼氏小体明显减少，部分核仁固缩边缘化，细胞出现肿胀，呈现明显衰老的现象(图3B)。细胞治疗组大鼠脑组织尼氏小体增加，核仁清晰，脑组织未见明显肿胀衰老迹象，与模型组比较明显改善(图3C)。

2.5 衰老大鼠脑组织超氧化物歧化酶、总抗氧化能力和丙二醛水平 模型组和细胞治疗组大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性低于对照组，模型组与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。细胞治疗组大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性与模型组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。模型组和细胞治疗组大鼠脑组织丙二醛水平高于对照组 (P < 0.05)，细胞治疗组大鼠脑组织丙二醛水平低于模型组(P < 0.05)。模型组和细胞治疗组大鼠脑组织总抗氧化能力水平低于对照组(P < 0.05)，细胞治疗组大鼠脑组织总抗氧化能力水平高于模型组(P < 0.05)，见表3。

2.6 Real-time PCR测定脑组织中BDNF mRNA表达 与对照组比较，模型组和细胞治疗组大鼠脑组织BDNF mRNA的表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组比较，细胞治疗组大鼠脑组织BDNF mRNA升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表4。

2.7 Western Blot检测脑组织BDNF蛋白表达 与对照组比较，模型组和细胞治疗组大鼠脑组织BDNF蛋白表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组比较，细胞治疗组大鼠脑组织BDNF蛋白表达升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表5。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验，体内作用对比观察。

1.2 时间及地点 实验于2016年12月至2017年8月在贵州医科大学分子生物学重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选用体质量为170 g左右清洁级SD大鼠30只，由贵州医科大学动物中心提供，动物编号为SCXK(黔)2012-0001，雌雄各半，实验室环境温度(22±3) ℃，湿度(70±20)%，实验经贵州医科大学伦理委员会批准符合动物伦理学要求。新生雄性SD大鼠5只，由贵州医科大学动物中心提供。

1.3.2 实验主要试剂及仪器 Morris水迷宫图像自动采集和处理系统(中科院药物研究所)；D-半乳糖(Sigma公司)；总抗氧化能力试剂盒、超氧化物歧化酶试剂盒和丙二醛试剂盒(南京建成生物科技工程公司)；L-DMEM培养基(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；Real-time试剂盒(超研生物科技公司)；SYBGREEN (华美生物工程公司)；引物序列由primer 3设计(上海英俊公司合成)；BDNF抗体(Santa Cruz公司)；倒置相差荧光显微镜、BI2000图像分析系统(德国Leica公司)；CO₂孵箱(美国Thermo Formo公司)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞培养 采用贴壁法培养骨髓间充质干细胞，收集大鼠骨髓细胞悬液置于新的离心管中，应用PBS清洗1遍后，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，收集沉淀，加入15 mL间充质干细胞专用培养基重悬，调整细胞浓度为(3-5)×10⁹ L^-¹，铺于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱培养。第3-5天可见细胞贴壁，此时采取半量换液，7 d后全量换液。待细胞长至80%左右融合时，0.25%胰酶消化传代至新培养瓶中，待长满后可冻存或继续传代培养，取第3代生长良好的细胞进行以下实验。

取达到80%-90%融合生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后，PBS洗涤一两遍，经300目尼龙网滤过，用PBS调整细胞量约为2×10⁵个，分别加入荧光直标的CD34，CD45，CD11，CD73，CD105，CD45，CD90，HLA-DR单克隆抗体，室温37 ℃下避光反应30 min，PBS洗涤3次，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。用PBS作为一抗设置阴性对照。

1.4.2 动物分组 适应性饲养1周，随机将30只SD大鼠分为对照组、模型组(D-半乳糖皮下注射)、细胞治疗组(D-半乳糖皮下注射+同种异体骨髓间充质干细胞尾静脉输入)，每组10只。

1.4.3 衰老动物模型的构建 每日对模型组和细胞治疗组大鼠皮下注射D-半乳糖400 mg/kg，连续注射3个月构建衰老大鼠模型^[15-16]。对照组注射等量生理盐水。

1.4.4 细胞移植 皮下注射D-半乳糖3个月后即开始输注骨髓间充质干细胞，细胞浓度为3×10⁹ L^-¹，注射体积为500 μL/kg，每周尾静脉输入1次，共输入8次。

1.4.5 采用Morris水迷宫检测学习和记忆能力变化 处死大鼠前5 d，采用Morris水迷宫图像自动采集和处理系统，实验分为定向航行实验及空间探索实验。实验过程中保持安静及光线的一致，定位航行实验时将大鼠从不同象限入水点面向池壁放入水中，观察大鼠自入水点找到平台所需的时间(逃避潜伏期)和航行轨迹。大鼠在60 s内若没有找到平台，人为将大鼠引到平台上并停留10 s，此时的潜伏期计为60 s，电脑智能记录大鼠成绩，连续4 d。第5天行空间探索实验(测试大鼠对原平台的记忆)，撤除平台，将各组大鼠从平台对侧象限放入水中，记录其在60 s内跨越平台的次数与在平台所在象限停留时间。

1.4.6 取材 水迷宫实验完成后，处死大鼠，迅速取出大脑组织，以中线轴将大脑切分成两半，一半多聚甲醛固定，一半-80 ℃冰冻保存待用。

1.4.7 大脑组织病理形态 大脑组织经多聚甲醛溶液固定2 d后，常规取材、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色。光镜200倍镜下观察大脑组织结构有无形态学改变。

1.4.8 衰老大鼠脑组织氧化水平的检测 精确称取各组大鼠脑组织，匀浆，分离出上清液，待用。采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活性、硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量和Fe³⁺还原法测定总抗氧化能力。具体检测实验步骤严格按照试剂盒内部说明书操作。

1.4.9 Real-Time PCR测定脑组织中BDNF mRNA表达 采用Trizol法提取脑组织总RNA，根据试剂盒说明书具体方法进一步采用实时定量-反转录聚合酶链反应进行基因片段扩增并定量。各PCR反应管中所加模板RNA的量约为1 μg。PCR扩增条件为：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，45 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共45个循环。结果通过RT-PCR仪记录的Ct值对起始模板相对定量分析。引物序列见表1。

1.4.10 Western Blot检测脑组织BDNF蛋白表达 取低温保存的大鼠脑组织标本，置于15 mL试管中，加入预冷的组织裂解液，用玻璃匀浆器在冰上匀浆，4 ℃，12 000 r/min离心10 min。将上述制备的上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；全湿式电转法将分离胶上的蛋白转移到PVDF膜，将PVDF膜置于封闭液中，室温下封闭2 h。信号用发光剂显影于感光胶片上成像，分析条带灰度值。

1.5 主要观察指标 ①大鼠学习和记忆能力；②脑组织的病理改变；③脑组织超氧化物歧化酶、总抗氧化能力、丙二醛水平；④脑组织BDNFmRNA表达和蛋白表达。

1.6 统计学分析 应用SPSS 22.0软件对数据进行处理，实验数据以x(_)±s表示，组间用单因素方差分析进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

衰老是机体功能衰退的复杂生理病理变化过程，不同组织器官衰老的时间有较大差异，且还受外界环境影响。在实验中观察到随着年龄的增加，脑组织存在神经元数目减少的现象，而脑老化的重要表现是神经元数目的减少。主流学说提出机体衰老主要机制是氧化损伤引起，由于抗氧化能力下降及过氧化物蓄积，进而造成组织器官、细胞结构和功能损伤，终末结果是诱导衰老^[17]。脑组织是高耗能器官，线粒体一方面为细胞提供所必须能量，同时也是过氧化物易于蓄积的细胞器。近年来，骨髓间充质干细胞对神经系统退行性疾病的修复研究和应用取得了令人鼓舞的进展^[18]。作者前期实验发现，骨髓间充质干细胞通过抑制神经细胞凋亡的作用来保护射线对脑组织的损伤^[19]。国内外学者通过实验给予阿尔茨海默症小鼠模型输注骨髓间充质干细胞后发现明显改善小鼠学习记忆能力并分泌神经因子保护大脑^[20-21]。Morris水迷宫检测对大鼠海马损伤后效应特别敏感，是神经生物学领域研究动物空间学习、记忆功能常用的方法^[21]。实验结果显示，模型组大鼠首次穿越平台时间明显延长，且穿越平台次数减少。通过给予骨髓间充质干细胞输注，大鼠首次穿越平台时间缩短，且穿越平台次数增多，说明骨髓间充质干细胞可改善大鼠学习记忆能力。病理结果进一步显示，衰老大鼠脑组织尼氏小体明显减少，部分核仁固缩边缘化，细胞出现肿胀，呈现明显衰老的现象。骨髓间充质干细胞治疗后大鼠脑组织尼氏小体增加，核仁清晰，脑组织明显改善，这与文献报道骨髓间充质干细胞可改善脑损伤结果相似^[22-23]。

现有研究表明骨髓间充质干细胞可改善D-半乳糖衰老动物模型机体氧化水平具有抗衰老作用^[24-27]。D-半乳糖构建衰老模型是研究衰老的理想模型，D-半乳糖可造成糖代谢障碍，引起组织中抗氧化能力明显降低，加重过氧化物蓄积，使机体出现退行性改变。作者长期从事衰老研究，已利用D-半乳糖皮下注射成功构建衰老大鼠模型^[28-31]。实验结果证实，D-半乳糖可导致大鼠脑组织超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力明显降低，脑组织丙二醛水平升高。大鼠骨髓间充质干细胞输注后脑组织超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力明显升高，脑组织丙二醛水平降低，提示骨髓间充质干细胞输注可改善大鼠脑组织衰老进程。

随着骨髓间充质干细胞研究的深入，研究人员发现骨髓间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，还能在损伤局部反应性分泌多种营养因子，可对损伤器官组织发挥修复治疗的作用^[32-34]。BDNF是脑内含量最为丰富的神经营养因子^[35]，可以促进神经元损伤后的修复、维持神经元的生长及促进再生、参与学习记忆过程，BDNF缺乏或功能异常可伴有严重的学习记忆功能障碍^[36-37]。BDNF还具有抗氧自由基的作用，有研究表明BDNF可调节超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽过氧化酶在神经元细胞中的含量，达到抗氧自由基，保护神经元的作用^[38]；实验结果显示，模型组脑组织BDNF表达水平明显降低，且伴随机体抗氧化能力降低，氧化产物和炎性因子蓄积。给予骨髓间充质干细胞输注治疗，大鼠BDNF表达得到升高，且伴随机体抗氧化能力提高，氧化产物和炎性因子降低。因此作者推断骨髓间充质干细胞改善衰老大鼠学习记忆能力可能是通过抗氧化，调节BDNF表达来实现的，同时通过水迷宫实验和苏木精-伊红染色脑组织形态比较，进一步论证显示骨髓间充质干细胞可明显改善衰老大鼠脑组织退行性病变，该研究结果为骨髓间充质干细胞临床移植修复衰老脑损伤提供了大量详实的实验数据，具有重要的临床意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞对衰老大鼠学习能力的影响

Bone marrow mesenchymal stem cells improve learning ability of the aging rat

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