黄精多糖防治绝经后骨质疏松症的分子机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0079

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (4): 493-498.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0079

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黄精多糖防治绝经后骨质疏松症的分子机制

张磊1，曾高峰1，宗少晖2，吴平平1，何基琛2，吴云乐2，严芳娜1，芩忠喜2，黄建华2

1广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2017-10-20 出版日期:2018-02-08 发布日期:2018-02-08
通讯作者: 曾高峰，博士，教授，博士生导师，广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:张磊，男，1991年生，广西壮族自治区南宁市人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事营养与疾病的基础性研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81360279)；广西自然科学基金(2015GXNSFAA139150)

Molecular mechanism of polygonatum sibiricum polysaccharide in the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis

Zhang Lei1, Zeng Gao-feng1, Zong Shao-hui2, Wu Ping-ping1, He Ji-chen2, Wu Yun-le2, Yan Fang-na1, Qin Zhong-xi2, Huang Jian-hua2

1School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Spine and Bone Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2017-10-20 Online:2018-02-08 Published:2018-02-08
Contact: Zeng Gao-feng, M.D., Professor, Doctoral supervisor, School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhang-Lei, Studying for master’s degree, School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360279; the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2015GXNSFAA139150

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
黄精多糖：本草纲目记载：“黄精补诸虚，填精髓，使五脏调和，肌肉充盛，骨髓坚强，其力倍增，多年不老，颜色鲜明，发质更黑，齿落更生”。黄精多糖来自于黄精的干燥根茎是黄精的主要活性之一，具有降血糖，降血脂，抗衰老，抗病毒，抗肿瘤，提高免疫力等药理作用。
骨密度：全称为骨矿物质密度，以单位体积或单位面积骨量表示，为一绝对值。在临床上常用双能X射线吸收测定法(DXA)测量骨密度，而又由于不同的骨密度检测仪的绝对值不同，通常使用相对值T值来判断骨密度是否正常，正常参考值在-1和+1之间，当T值低于-2.5时为不正常。骨密度是骨强度的一个重要定量指标，是预测骨折危险性的重要依据，反映了骨质疏松程度。

摘要
背景：课题组前期研究结果显示黄精多糖具有抗骨质疏松作用，但对其在体内对去卵巢骨质疏松防治效果的分子机制知之甚少。
目的：探究黄精多糖在体内对大鼠骨微结构、骨密度的作用以及对成骨、破骨相关基因mRNA表达的影响机制。
方法：25只SPF级雌性未受孕的3月龄SD大鼠随机分为5组，假手术组(等体积生理盐水)、模型组，唑来膦酸盐组[0.2 mg/(kg•d)]，高剂量黄精多糖组[800 mg/(kg•d)]，中剂量黄精多糖组[400 mg/(kg•d)]。除假手术组外均建立去卵巢大鼠模型。术后1周隔天灌胃相应药物，连续12周后将大鼠处死，取其子宫称质量，收集一侧胫骨行Micro-CT骨形态计量学分析，对侧胫骨提骨头RNA行q-PCR检测。
结果与结论：①相较于假手术组，模型组大鼠体质量显著性增加而子宫质量明显降低(P < 0.05)；与模型组相比，高剂量黄精多糖组和唑来膦酸盐组均能明显减缓体质量过快增加(P < 0.05)；②模型组相较假手术组骨密度下降63%(P < 0.001)，经过12周治疗，高剂量黄精多糖组与唑来膦酸盐组相较模型组骨密度均有所增加，分别增加44%和38%(P < 0.05)，骨体积分数、骨小粱数量也有所增加(P < 0.05)，骨小粱分离度明显降低(P < 0.05)；③在体内，高剂量黄精多糖组能明显促进成骨分化相关基因碱性磷酸酶、RUNX2、Col1a1、骨钙素的表达而抑制破骨分化相关基因ACP5、CTSK的表达(P < 0.05)，能明显抑制ACP5、CTSK的表达(P < 0.05)；④结果说明，高剂量的黄精多糖能够减少去卵巢大鼠的骨丢失、骨密度下降，改善骨微结构破坏，促进成骨相关基因而抑制破骨相关基因mRNA的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-0595-0043(曾高峰)

关键词: 黄精多糖, 组织构建, 去卵巢大鼠, Micro-Ct, 骨形态计量学

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that polygonatum sibiricum polysaccharide (PSP) exhibits anti-osteoporosis effect, but its therapeutic effect in ovariectomized osteoporotic rats and the molecular mechanisms are poorly understood.
OBJECTIVE: To investigate the effect of administration of PSP on the bone microstructure, bone mineral density as well as osteoblast- and osteoclast-related gene expression in rats.
METHODS: Twenty-five infertile female Sprague-Dawley rats aged 3 months were randomly allotted into five groups (n=5 per group): sham operation (same volume normal saline), model, zoledronate (0.2 mg/kg•d), high-dose PSP (800 mg/kg•d) and medium-dose PSP (400 mg/kg•d) groups. All rats were subjected to ovariectomy except sham operation group. The administration was intragastrically given every 2 days beginning at 7 days after modeling and lasted 12 weeks. Then, the rats were sacrificed, and the uterus was weighed. The bilateral tibias were removed, one side for histomorphometric analysis by micro-CT, and the other one for RNA detection by qualified PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham operation group, the rat body mass in the model group was significantly increased and the weight of uterus was significantly decreased (P < 0.05). Compared with the model group, zoledronate and high-dose PSP could significantly alleviate the excessive increase in body mass (P < 0.05). The bone mineral density in the model group was decreased by 63% compared with the sham operation group (P < 0.01), Compared with the model group, after 12-week high-dose PSP and zoledronate administration, the bone mineral density was increased by 44% and 38%, respectively (P < 0.01); the trabecular bone volume fraction and trabecular number rose significantly (P < 0.05), while the trabecular separation decreased significantly (P < 0.05). In vivo, PSP could significantly promote the expression levels of osteoblast-related genes (alkaline phosphatase, RUNX2, Col1a1 and osteocalcin), and significantly inhibit the expression levels of osteoblast-related genes (ACP5 and CTSK) (P < 0.05). These results imply that high-dose PSP can reduce bone loss and decrease of bone mineral density, improve the destruction of bone microstructure, as well as promote osteoblast-related genes but inhibit osteoclast-related gene mRNA expression in the ovariectomized rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Polygonatum, Polysaccharides, Ovariectomy, Osteoporosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张磊，曾高峰，宗少晖，吴平平，何基琛，吴云乐，严芳娜，芩忠喜，黄建华. 黄精多糖防治绝经后骨质疏松症的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(4): 493-498.

Zhang Lei1, Zeng Gao-feng1, Zong Shao-hui2, Wu Ping-ping1, He Ji-chen2, Wu Yun-le2, Yan Fang-na1, Qin Zhong-xi2, Huang Jian-hua2. Molecular mechanism of polygonatum sibiricum polysaccharide in the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(4): 493-498.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 25只SPF级雌性未孕SD大鼠随机分为5组，整个实验过程无大鼠脱失，均进入结果分析。

2.2 黄精多糖对去卵巢大鼠体质量的影响与假手术组相比，模型组大鼠体质量增加明显(P < 0.01)。12周药物治疗后，高剂量黄精多糖组与唑来膦酸盐组的体质量与模型组相比有显著性下降(P < 0.05)，而中剂量黄精多糖组体质量变化无明显差异，见图1。

2.3 黄精多糖对去卵巢大鼠子宫质量的影响与假手术组相比，模型组大鼠子宫质量降低，差异有显著性意义(P < 0.01)；12周后，唑来膦酸盐组与高剂量黄精多糖组及中剂量黄精多糖组在子宫质量上较模型组相比差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 黄精多糖对去卵巢大鼠骨密度的影响与假手术组相比，模型组大鼠骨密度下降了63%，其差异有显著性意义(P < 0.01)。与模型组相比，高剂量黄精多糖组和唑来膦酸盐组骨密度有所增加，分别增加了44%和38%，其差异有显著性意义(P < 0.05)，中剂量黄精多糖组在骨密度变化上与模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.5 大鼠胫骨近端micro-CT骨形态计量学分析与假手术组相比，模型组骨体积分数、骨小梁数量明显降低(P < 0.05)，骨小梁分离度明显增加(P < 0.05)，但骨小梁厚度变化差异无显著性意义(P > 0.05)。经过12周药物治疗后，与模型组相比，高剂量黄精多糖组和唑来膦酸盐组的骨体积分数、骨小梁数量有所增加，而骨小梁分离度明显降低，其差异具有显著性意义(P < 0.05)，然而高剂量黄精多糖组和唑来膦酸盐组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3，图2。

2.6 实时荧光定量PCR结果见表4，与假手术组相比，模型组成骨分化相关基因碱性磷酸酶、RUNX2、Col1a1、骨钙素和破骨分化相关基因ACP5、CTSK的相对表达量明显增加，其差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组相比，高剂量黄精多糖组能明显促进成骨分化相关基因碱性磷酸酶、RUNX2、Col1a1、骨钙素表达而抑制破骨形成相关基因ACP5、CTSK的表达，其差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组相比，唑来膦酸盐组能明显抑制破骨形成相关基因ACP5、CTSK的表达(P < 0.05)，而对成骨分化相关基因表达无影响。与模型组相比，中剂量黄精多糖组对成骨和破骨相关基因表达无明显差异。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 2016年6至12月在广西医科大学实验动物中心和再生医学重点实验室完成实验。

1.3 材料

实验动物：3月龄的SPF级雌性未受孕SD大鼠25只，体质量(225±8.3)g，动物质量合格证书号：SCXK桂2014-0002，均购自广西医科大学实验动物中心。所有大鼠在温度22-25 ℃，湿度40%-50%和12 h光照循环的清洁级动物房分笼饲养，自由摄食饮水适应1周。

实验用主要试剂与仪器：黄精多糖 (纯度98%，陕西慈缘生物技术有限公司)；戊巴比妥钠、青霉素(北京索莱宝生物技术有限公司北京)；唑来膦酸盐(sigma美国)；Micro-CT(Skyscan 1176，德国)；总RNA吸柱法提取试剂盒(Axygen美国)；反转录试剂盒(赛默飞上海)；SYBR Green 荧光染料试剂盒(Takara大连)；Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪(Roche/罗氏瑞士)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模及分组 SD大鼠随机分配到5组，每组5只。一组行假手术，其余4组行去卵巢术，包括高剂量黄精多糖组，中剂量黄精多糖组，唑来膦酸盐组和模型组。所有手术的动物提前12 h禁食和饮水，麻醉行2%的戊巴比妥钠 (2 mL/kg)腹腔注射。手术后每天观察大鼠伤口和饮食情况，并行碘伏擦拭伤口，抗生素治疗3 d。隔天灌胃给药开始于术后1周，假手术组和模型组给予等体积生理盐水 [10 mL/(kg•d)]，唑来膦酸盐组[0.2 mg/(kg•d)]，高剂量黄精多糖组[800 mg/(kg•d)]，中剂量黄精多糖组[400 mg/(kg•d)]，每周根据体质量相应调整灌胃量[10 mL/(kg•d)]。

1.4.2 测量体质量和子宫质量 12周实验结束，大鼠处死前称质量并记录，并取出大鼠子宫剥离子宫上附着物，迅速对子宫进行称质量。

1.4.3 Micro-CT骨形态计量学分析收集胫骨，剔除附着的肌肉和软组织，用生理盐水冲掉血液使其干净后，标记好左右胫骨并按对应存放条件冻存标本。100 g/L的多聚甲醛固定大鼠的左边胫骨，行Micro-Ct扫描(Skyscan 1176,比利时)。行Skyscan 1176(分辨率18 μm)扫描仪扫描。采用电压50 kV，500 μA，0.5 mm的铜质滤片参数进行扫描，用CTAn软件(Skyscan)对扫描图像进行三维重构，对骨密度测定先进行骨密度校正。对胫骨近端骨小梁区域行骨形态计量学分析，包括骨密度(BMD)、骨小粱数量(trabeculae number，Tb.N)、骨体积分数(bone volume/total volume，BV\TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小粱分离度(trabecular spacing，Tb.Sp)等指标。

1.4.4 实时荧光定量PCR 将用于实验的右胫骨从 -80 ℃冰箱取出，放入研钵中，倒入适量液氮快速研磨成粉末，骨头RNA采用Axygen总RNA吸柱法试剂盒提取。提取的RNA由赛默飞反转录试剂盒反转为cDNA，反转录好的cDNA可-20 ℃避光保存于冰箱，待用时提前取出解冻，但不可反复冻融。取各组2 μL的cDNA样与SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ荧光(TaKaRa，大连)荧光试剂混匀加入 100 μL的八连管中，配成20 μL反应体系，待管内无气泡时放入PCR仪中。罗氏SYBR Green荧光染料试剂盒进行扩增并由Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪检测目的基因(碱性磷酸酶、RUNX2、Col1a1、骨钙素、ACP5、CTSK)的相对表达量。

引物序列：
碱性磷酸酶	上游引物：下游引物：	5’- TGA ACC GCA GGA TGT GAA CT -3’ 5’- GAA GAA GGG GTG CTA CGT CC -3’
RUNX2	上游引物：下游引物：	5’- TGA TTT AGG GCG CAT TCC TCA-3’ 5’- AGG ATT GTG TCT GCC TGG GA -3’
Col1a1	上游引物：下游引物：	5’- GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG -3’ 5’- GCT ACG CTG TTC TTG CAG TG-3’
骨钙素	上游引物：下游引物：	5’- ATT GTG ACG AGC TAG CGG AC-3’ 5’- TCG AGT CCT GGA GAG TAG CC -3’
ACP5	上游引物：下游引物：	5’- TCC CCA GCC CTT ATT ACC GT-3’ 5’- GGC TGA CAA AGT CGT CGG AA -3’
CTSK	上游引物：下游引物：	5’- CCG TGG TGA GCT TTG CTC TA -3’ 5’- TGT TGT ACT GCT TCC CGT GG -3’
β-actin	上游引物：下游引物：	5’- TTG CTG ACA GGA TGC AGA AG-3’ 5’- CAG TGA GGC CAG GAT AGA GC-3’

1.5 主要观察指标各组大鼠体质量和子宫湿质量，骨密度、骨小粱数量(Tb.N)、骨体积分数(BV\TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小粱分离度(Tb.Sp)成骨分化碱性磷酸酶、Runx2(runt-related transcription factor 2)、Col1a1 (collagen type I alpha 1)、骨钙素相关基因和破骨分化ACP5(acid phosphatase 5，tartrate resistant)、CTSK(cathepsin K)等相关基因指标。

1.6 统计学分析 SPSS(17.0美国)统计软件包，以x(_)±s表示数据，单因方差分析比较多组间差异，Dunnett's t test法用来比较两两之间的差异，当P < 0.05时，差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨重建是一种动态、持续的过程，骨质疏松症为骨代谢失衡的一种骨科疾病，其主要特征有骨密度下降，骨微结构退变，骨强度下降，骨折易感性增加^[13]。目前临床上用于治疗骨质疏松症的药物主要被分成两类：包括抑制骨吸收药物(双膦酸盐、降钙素类和选择性雌激素受体调节等)和促进骨形成类药物(生长因子、PTH等)^[14-16]。尽管这些药物有不错的治疗效果，但同时其药物不良反应(乳腺癌或心血管疾病)或高昂成本价格是不得不考虑的因素^[17-19]。

去卵巢大鼠模拟绝经后骨质疏松是最常用的绝经后骨质疏松模型。去卵巢后，模型组大鼠体质量增加迅速，假手术组体质量增加正常，这种体质量的过快增长，可能是由于去卵巢后大鼠体内雌激素缺乏，造成大鼠体内脂肪大量生成^[20]。在12周治疗后，高剂量黄精多糖和唑来膦酸盐治疗能在一定程度上阻止大鼠体质量的过快增长。于此同时，由于雌激素的缺乏，大鼠子宫萎缩明显，黄精多糖治疗对子宫质量不产生影响。去卵巢手术后，大鼠体质量增长迅速和子宫萎缩的结果同时在一定程度上说明了造模的成功。

临床诊断骨质疏松的金标准一般用骨密度，它能在一定程度上反映骨强度的大小，而骨折风险又与骨强度有关，因此，骨密度也被作为预测骨折风险概率的重要指标之一^[21]。骨小梁为松质骨，是骨强度的重要组成部分，在胫骨近端骨小梁丰富，此区域骨代谢活跃，骨转换率高，能很好地反映体内骨代谢的一种变化特征^[22]。而皮质骨的骨结构坚硬致密，短期内并不能体现很明显的骨结构变化，因此，作者选取大鼠胫骨近端松质骨为研究对象。经过Micro-CT扫描三维重构和CTAn软件分析，在去卵巢12周后，模型组较假手术组相比，骨密度下降了63%，骨体积分数、骨小梁数量降低显著，而骨小梁分离度显著增加，大鼠的骨丢失和骨密度下降明显说明了造模的成功。药物治疗12周后，高剂量黄精多糖组和唑来膦酸盐组骨密度相较于模型组均有所增加，分别增加了44%和38%，同时骨丢失被有所控制，骨微结构的破坏也有所改善。这些结果表明高剂量的黄精多糖能够阻止由于绝经后骨质疏松症所造成的骨丢失和骨微结构破坏。

成骨细胞和破骨细胞分别控制骨形成和骨吸收，为骨重建的主要细胞。任何一方的过强或过弱，都会导致骨科相关疾病^[23]。骨骼处于不断重建中，当破骨细胞活性增强，而成骨细胞活性减弱时，此时破骨细胞对旧骨的吸收速度远远地大于成骨细胞对新骨的形成速度，骨质疏松症疾病发生^[24-25]。

成骨细胞由多能的间充质干细胞分化而来，其功能包括合成分泌胶原与糖蛋白，分泌骨基质，最终形成新骨；新骨的形成过程是新快后慢，在此过程中成骨细胞会合成

一些生长因子和刺激物，包括转化生长因子β、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白等^[26-27]；成骨分化过程中，有多种特异性标志物，其中碱性磷酸酶和骨钙素分别作为成骨形成的早期和晚期特异性标志，他们主要负责与骨形成相关的细胞外基质的成熟与矿化^[28-29]；Ⅰ型胶原蛋白是一种纤维状胶原蛋白，在成骨分化的中晚期分泌，能相互交织，并与细胞外基质等物质结合，是为成骨细胞晚期的矿化做准备^[28]；Runx2(Runt-related transcription factor 2)是Runx 转录因子家族的一员，在成骨细胞分化中发挥着关键的作用，能与核内相应的DNA结构域结合促使其下游成骨相关基因的表达，从而促进成骨分化^[30]。

破骨细胞是由多个单核巨噬细胞融合而成，其主要作用是分泌各种酸以及溶酶体并能分解吸收骨基质，调节体内血钙水平^[33]；破骨细胞其主要特异性标志物有抗酒石酸酸性磷酸酶(acid phosphatase 5，tartrate resistant，ACP5)和组织蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)^[24^，^31]；抗酒石酸酸性磷酸酶也叫抗酒石酸(ACP5)，是一种在哺乳动物中表达糖基化的单体金属蛋白酶，在活化的破骨细胞中高度表达，为破骨细胞分化形成的重要标志^[25^，^29]；组织蛋白酶K是一种蛋白酶，是肽酶C1(peptidase C1)家族一员，主要在破骨细胞中表达，作为一种蛋白酶参与骨吸收过程^[31]。通过Real-time PCR检测成骨和破骨形成相关基因mRNA的相对表达水平，此次实验结果表明黄精多糖能够促进成骨形成相关基因碱性磷酸酶，Runx2，col1a1，骨钙素的表达而抑制破骨形成相关基因CTSK，ACP5的表达。这些结果证明黄精多糖能够在成骨和破骨细胞分化方面发挥作用。

综上，本实验证明了黄精多糖对防治去卵巢大鼠骨质疏松症有较显著的积极作用。该实验中12周的去卵巢能够造成SD大鼠骨量大量丢失、骨微结构破坏和骨密度下降，而高剂量黄精多糖能阻止这种骨丢失、骨微结构破坏和骨密度下降，同时对大鼠子宫不产生刺激作用。黄精多糖的这种抗骨质疏松作用可能是对骨形成和骨吸收两方面产生影响，具体的分子机制还有待更深入地研究。因此，在临床抗骨质疏松症的药物中黄精多糖有望作为理想选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

黄精多糖防治绝经后骨质疏松症的分子机制

Molecular mechanism of polygonatum sibiricum polysaccharide in the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis

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