正常和类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞迁移、侵袭能力的差异

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.017

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (24): 3870-3874.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.017

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正常和类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞迁移、侵袭能力的差异

胡君^1，2，汤自征^1，3，张育¹，沈维干¹，柳桂萍¹，王雯雯¹，刘家欢¹

¹扬州大学临床医学院(苏北人民医院)风湿免疫科，江苏省扬州市 225001；²江苏省武警总队医院内科，江苏省扬州市 225001；³济南第四人民医院风湿科，山东省济南市 250031

修回日期:2017-03-19 出版日期:2017-08-28 发布日期:2017-08-30
通讯作者: 张育，硕士，教授，主任医师，扬州大学临床医学院(苏北人民医院)风湿免疫科，江苏省扬州市 225001
作者简介:胡君，女，1985年生，江苏省高邮市人，汉族，2009年山西医科大学毕业，主治医师，主要从事风湿免疫方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助(81470070)

Migration and invasion abilities of normal fibroblast-like synoviocytes versus fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis

Hu Jun^{1, 2}, Tang Zi-zheng^{1, 3}, Zhang Yu¹, Shen Wei-gan¹, Liu Gui-ping¹, Wang Wen-wen¹, Liu Jia-huan¹

¹Department of Rheumatology and Immunology, Clinical Medical College of Yangzhou University (North Jiangsu People’s Hospital of Jiangsu Province), Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; ²Department of Internal Medicine, Jiangsu Provincial General Hospital of Armed Police Force, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; ³Department of Rheumatology, the Fourth People’s Hospital of Jinan, Jinan 250031, Shandong Province, China

Revised:2017-03-19 Online:2017-08-28 Published:2017-08-30
Contact: Zhang Yu, Master, Professor, Chief physician, Department of Rheumatology and Immunology, Clinical Medical College of Yangzhou University (North Jiangsu People’s Hospital of Jiangsu Province), Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
About author:Hu Jun, Attending physician, Department of Rheumatology and Immunology, Clinical Medical College of Yangzhou University (North Jiangsu People’s Hospital of Jiangsu Province), Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China; Department of Internal Medicine, Jiangsu Provincial General Hospital of Armed Police Force, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81470070

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
细胞迁移：也称为细胞爬行、细胞移动或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的延伸、新的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。
细胞骨架：20世纪60年代后，人们使用戊二醛常温固定的方法开始逐渐发现细胞骨架。科学家发现，细胞骨架在细胞迁移过程起到承载和支撑的作用。在20世纪末21世纪初，科学家对细胞迁移复杂机制的认识有了非常大的进步，对细胞与基质的粘着、非对称性极化和胞内分层运动都有了进一步的了解、但是整个过程其实仍未被了解透彻，很多中间过程就是连起作用的物质都未明。科学家对其中部分需要进行假设，再进一步通过实验去证实。

摘要
背景：在类风湿关节炎的发病过程中，其滑膜衬里层的成纤维样滑膜细胞的病理生理学行为涉及细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡和破骨作用。
目的：比较类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞(MH7A)与正常关节成纤维样滑膜细胞(HFLS)迁移和侵袭能力。
方法：利用Transwell细胞迁移和侵袭实验比较2种细胞的迁移、侵袭能力，设计11种miRNA序列特异性引物，按SYBR®PrimeScript™miRNA RT-PCR Kit说明书进行实时定量聚合酶链式反应检测类风湿关节炎相关miRNAs的表达。
结果与结论：①Transwell细胞迁移、侵袭实验显示MH7A迁移和袭能力较HFLS明显增强；与HFLS相比，MH7A细胞中miR-132、-155、-203、-223、-124的表达上调；而miR-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a的表达下调。②结果说明，MH7A迁移和侵袭能力较HFLS明显增强；与HFLS相比，MH7A中类风湿关节炎相关的11种miRNAs表达水平的改变，可能通过相应的机制调节类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的迁移和侵袭，参与类风湿关节炎的发病。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7250-6305(胡君)

关键词: 组织构建, 组织工程, 类风湿关节炎, 成纤维样滑膜细胞, 迁移, 侵袭, miRNAs, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Fibroblast-like synoviocytes (FLS) in the synovial lining layer are related to the cell proliferation, invasion, migration and apoptosis as well as bone resorption in rheumatoid arthritis.

OBJECTIVE: To compare the migration and invasion abilities of FLS (MH7A) in rheumatoid arthritis and normal FLS (HFLS).

METHODS: The capacities of cell migration and invasion were evaluated by Transwell cell migration and invasion assays. The primers of the indicated microRNAs were designed and synthesized, and the expression levels of miRNAs were determined by real-time PCR according to the SYBR®PrimeScript™miRNA RT-PCR Kit instruction.

RESULTS AND CONCLUSION: MH7A possessed stronger migration and invasion abilities than HFLS. Compared with HFLS, obviously upregulated miR-132, -155, -203, -223 and -124, and significantly downregulated miR-15a, -16, 18a, -19a, -26a and -146a were found in MH7A. These findings suggest that the differentially expressed 11 kinds of rheumatoid arthritis-associated miRNAs participate in the pathogenesis of rheumatoid arthritis probably by enhancing the migration and invasion capacities of MH7A.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Arthritis Rheumatoid, Cell Movement, MicroRNAs, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

胡君，汤自征，张育，沈维干，柳桂萍，王雯雯，刘家欢. 正常和类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞迁移、侵袭能力的差异[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3870-3874.

Hu Jun, Tang Zi-zheng, Zhang Yu, Shen Wei-gan, Liu Gui-ping, Wang Wen-wen, Liu Jia-huan. Migration and invasion abilities of normal fibroblast-like synoviocytes versus fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(24): 3870-3874.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 对比观察细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年6月至2016年1月在扬州大学医学院完成。

1.3 材料 类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞(MH7A)细胞株购自广州吉妮欧生物有限公司，正常关节成纤维样滑膜细胞(HFLS)购自江苏无锡菩禾生物技术有限公司。细胞培养于含体积分数15%胎牛血清DMEM培养基中，体积分数5%CO₂、37 ℃、饱和湿度培养箱中常规培养。

1.4 实验方法

1.4.1 Transwell细胞迁移和侵袭实验 取对数生长期的细胞，无血清DMEM培养基培养过夜。制备细胞悬液，调整细胞浓度为2.5×10⁸L^-1，取200 μL细胞悬液接种于Transwell小室(8 μm pore size；Costar，USA)的上室，下室加入含LPS(1 mg/L)的完全培养基600 μL，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养24 h。取出小室，去除未贴壁的细胞，用棉签轻柔擦去小室膜上室面的细胞，固定、染色后置于显微镜下计数迁移的细胞，随机选取5个视野，每个视野细胞计数3次，求平均值。Transwell细胞侵袭实验步骤与迁移实验相似，只是上室预先用100 mg/L的Matrigel基质(BD Biosciences)包被，37 ℃孵育过夜；加样后培养时间为48 h。

1.4.2 RNA提取和RT-qPCR检测 引物的设计与合成选择涉及类风湿关节炎发病过程，如迁移、侵袭、增殖、破骨作用、抗炎、促炎等相关的11种miRNAs，包括miR-155、-146a、-203、-223、-15a、-16、18a、-19a、-124、-132和-26a作为研究对象，选定内参为U6。登陆数据库(http://www. mirbase.org)，分别查找选定的miRNAs的前体序列，按照引物设计原则设计相应的引物。实验所需引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，合成的引物序列见表1。

Real-Time PCR反应：细胞内总RNA的提取将汇合度达80%-90%的HFLS及MH7A细胞分别用RNA提取试剂盒(VAZYME，Nanjing，China)按说明书操作提取细胞内总RNA。RNA的Poly(A)加尾和反转录成cDNA miRNAs不具有Poly(A)序列，需对样品中的miRNAs进行Poly(A)加尾反应，然后利用非特异性引物(试剂盒提供)将经过Poly(A)加尾的RNA进行反转录得到cDNA。采用SYBR^® PrimeScript^TMmiRNA RT-PCR Kit (Takara)，按说明书进行加尾反应和反转录，反应体系见表2，反应混合物置于37 ℃恒温水浴60 min后，于85 ℃继续孵育5 s，使酶灭活。

RT-qPCR检测：实验分2组，一组为HFLS(对照组)，一组为MH7A(实验组)，每组均设置U6为内参，PCR反应体系的配制见附表3，按SYBR^®PrimeScript^TM miRNA RT-PCR Kit (Takara)说明书检测11种miRNA水平。miRNA相对表达水平用2^-^??Ct方法计算。

1.5 主要观察指标 ①MH7A与HFLS细胞形态观察结果；②MH7A与HFLS细胞迁移、侵袭能力；③Real- TimePCR检测miRNAs在两种细胞中的相对表达。

1.6 统计学分析 所有统计学处理在SPSS19.0及Excel2003软件中完成。分析数据用x(_)±s表示，组间比较用单因素方差分析进行统计学处理。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

类风湿关节炎是一种多系统、炎症性疾病，可引起自身免疫系统失调，导致关节破坏和多系统并发症。类风湿关节炎的病理过程主要是关节炎症细胞的浸润和滑膜细胞增殖和侵袭，形成侵袭性血管翳，导致骨和软骨破坏。滑膜衬里层的成纤维样滑膜细胞的迁移和侵袭是其发病过程中的重要环节。类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞在多种炎症因子及其他机制作用下，迁移到软骨表面，通过蛋白水解酶的产生，对软骨和骨侵蚀，继而导致关节破坏。一旦成纤维样滑膜细胞迁移到骨，还可活化破骨细胞，增强软骨和骨质侵蚀。活化的成纤维样滑膜细胞的迁移对远处关节炎症部位的的破坏也有一定的影响，体内研究发现活化的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的远距离迁移可能介导不同部位关节损伤的蔓延^[5]。研究通过Transwell细胞迁移和侵袭实验，证实MH7A迁移和侵袭能力明显提高。

前期实验研究已证实，基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质，促进细胞的迁移、侵袭，如基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9^[6]。近年来的研究显示，miRNAs可以通过调控炎性细胞因子分泌及基质金属蛋白酶的表达，提示miRNAs可能在类风湿关节炎疾病发生、发展过程中起作用^[7]。

实验使用RT-qPCR法检测了HFLS与MH7A的11种类风湿关节炎相关miRNAs，发现2种细胞miRNAs的表达有所不同。与HFLS相比，MH7A细胞内miR-155和miR-203表达上调(P < 0.05)，RT-qPCR检测发现，MH7A细胞中miR-155表达水平为HFLS细胞表达量的3.882倍，数据分析后差异有显著性意义(P < 0.05)。有体外试验发现miR-155的过表达间接抑制基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶3的产生^[8]，miR-155可能通过该作用抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的迁移和侵袭。作者的研究结果显示MH7A细胞株的miR-203的表达为HFLS的6.020倍，差异有统计学意义(P < 0.05)。miR-203在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的过表达可导致基质金属蛋白酶1的释放和核因子κB通路介导的白细胞介素6的分泌，从而触发类风湿关节炎炎症反应和骨破坏机制^[9]。相较于HFLS，MH7A的miR-18a和miR-19a则出现表达下调。miR-18a涉及核因子κB活化后肿瘤坏死因子α的分泌以及肿瘤坏死因子α诱导的基质金属蛋白酶1的产生和炎性细胞因子和趋化因子的产生，并借助肿瘤坏死因子α增强了类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的趋化潜能，对细胞迁移、侵袭有间接促进作用。肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP-3)是miR-18a的一个新的直接作用靶点，通过抑制该靶点的表达，miR-18a可促进类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中核因子κB信号通路转导^[10]。miR-18a在MH7A细胞中显示出明显的表达下调(相较于HFLS，P < 0.05)，有可能使得炎症反应中的负性调节因子释放，TLR2活化减少，从而控制细胞因子释放，对迁移、侵袭有抑制作用。miR-19的直接作用靶点为TLR2，且与白细胞介素6和基质金属蛋白酶3增多也有关，上述机制可能对细胞迁移、侵袭产生影响^[11]。作者的研究发现MH7A的miR-19a表现出下调(相较于HFLS)，这可能成为减少细胞迁移、侵袭的因素。

miRNAs对类风湿关节炎炎症反应的精细调节是一个复杂的过程，涉及诸多炎性细胞因子。miR-146a由某些炎性介质介导，如肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β，使得它在类风湿关节炎滑膜组织中衬里层和衬里层下层表达^[12]。本研究中，MH7A细胞miR-146a的表达较HFLS低(P < 0.05)，其原因一方面可能与细胞所处的时期和单细胞环境有关，另一方面，miR-146是炎症反应的负性调节因子，类风湿关节炎活动期炎症反应及细胞迁移、侵袭被激活，miR-146a产生可能被负反馈抑制，导致其在MH7A细胞中表达有所减少。

另外，实验对涉及类风湿关节炎其他机制的miRNAs进行了检测，如miR-15a，miR-16、miR-26a、miR-124、miR-132和miR-223。体内试验中miR-15a的下调伴随着抗凋亡分子2(Bcl-2)的上调^[13]，实验中，MH7A细胞所表现出的miR-15a较HFLS表达量低，约为其0.625(P < 0.05)，考虑与其抗凋亡作用有关。miR-124参与调节细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK-2)的产生和细胞周期的进程^[14]，同时促进炎症细胞向滑膜组织的迁移、血管新生^[15-17]。实验中MH7A细胞中miR-124表达较HFLS增多，差异有统计学意义(P < 0.05)。miR-223与类风湿关节炎骨破坏有关^[18]，作者研究显示出MH7A中miR-223的过表达，可能导致类风湿关节炎骨代谢平衡失调。实验中显示MH7A细胞株的miR-132表现出表达上调，miR-16、miR-26a表达下调，其作用机制可能与细胞所处的单细胞环境及增殖状态有关，不同miRNAs表达及相关作用机制有待进一步探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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