白细胞介素1β预处理骨髓间充质干细胞可影响骨髓瘤细胞株干细胞基因及趋化因子受体基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 54-59.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.010

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白细胞介素1β预处理骨髓间充质干细胞可影响骨髓瘤细胞株干细胞基因及趋化因子受体基因的表达

吴玉姣¹，费小明¹，叶炜¹，汤郁²，雷芳¹，朱彦¹

江苏大学附属医院，¹血液科，²风湿科，江苏省镇江市 212001

修回日期:2016-11-04 出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
通讯作者: 费小明，博士，副主任医师，江苏大学附属医院血液科，江苏省镇江市 212001
作者简介:吴玉姣，女，1989 年生，江苏省无锡市人，汉族，在读硕士，主要从事多发性骨髓瘤及骨髓间充质干细胞研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81202358；81571582)；江苏省卫生计生科研项目(Z201512)

Interleukin-1beta regulates stem cell gene and chemokine receptor gene expression of myeloma cell lines via pretreatment on bone marrow mesenchymal stem cells

Wu Yu-jiao¹, Fei Xiao-ming¹, Ye Wei¹, Tang Yu², Lei Fang¹, Zhu Yan¹

¹Department of Hematology, ²Department of Rheumatism, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China

Revised:2016-11-04 Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
Contact: Fei Xiao-ming, M.D., Associate chief physician, Department of Hematology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
About author:Wu Yu-jiao, Studying for master’s degree, Department of Hematology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81202358, 81571582; Jiangsu Provincial Health Planning and Research Project, No. Z201512

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨髓瘤细胞：具有无限分裂能力，由于该细胞并非高度分化细胞，因此分裂能力较强，而其它肿瘤细胞分裂能力较弱，因此多在制备单克隆抗体时与B淋巴细胞融合，使单克隆抗体迅速大量增殖。
多发性骨髓瘤患者骨髓微环境的异常：骨髓间充质干细胞作为骨髓微环境重要组成部分一员。骨髓瘤患者骨髓微环境中往往存在着白细胞介素1β、白细胞介素6等炎性因子水平的异常增高，这些异常水平的炎性因子不但直接作用于骨髓瘤细胞，而且还可以间接通过间充质干细胞等微环境中其他细胞，调节骨髓瘤细胞功能。但这些细胞因子短期或长期异常对骨髓瘤细胞的影响，目前尚不清楚。

摘要
背景：既往多项研究提示多发性骨髓瘤患者间充质干细胞的细胞因子分泌、免疫调节、成骨分化等生物功能异常。
目的：观察白细胞介素1β单次或多次预处理的正常间充质干细胞后，其再与多发性骨髓瘤细胞株共培养，对骨髓瘤细胞干细胞相关基因、趋化相关受体等表达的影响。
方法：实验分为无白细胞介素1β预处理的骨髓间充质干细胞对照组、白细胞介素1β 预刺激 1 d及白细胞介素1β预刺激 7 d 组，各组分别培养7 d后，均加入骨髓瘤细胞株H929直接接触共培养。3 d后收集各组中骨髓瘤细胞株H929细胞，分别采用 Western blot方法检测各组细胞NANOG、SOX2 和OCT-4 蛋白的表达水平，RT-PCR 方法检测各组细胞趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR6和CXCR4的基因表达水平。
结果与结论：①与对照组比较，H929细胞株和单次白细胞介素1β处理组及多次白细胞介素1β处理组共培养后，SOX2蛋白表达水平升高(P < 0.05)；②与对照组、单次白细胞介素1β处理组比较，多次白细胞介素1β处理组CCR1和CCR2基因的表达水平均增高(P < 0.05)；③实验结果显示，正常骨髓间充质干细胞经炎症因子白细胞介素1β单次或多次刺激后，在与骨髓瘤细胞的相互作用中，对骨髓瘤细胞的干细胞基因表达、细胞趋化因子受体表达等均产生影响。这提示骨髓微环境中异常水平炎性因子，除了直接作用于骨髓瘤细胞之外，很可能通过影响间充质干细胞等非骨髓瘤细胞后，间接参与骨髓瘤疾病的发生和发展，并且其对骨髓瘤细胞的影响效果与白细胞介素1β作用间充质干细胞的时间长短有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0818-6001(吴玉姣)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 多发性骨髓瘤, 间充质干细胞, 炎症因子, 骨髓微环境, ；直接共培养, NANOG, SOX2, OCT-4, 趋化因子受体, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Many studies have showed that mesenchymal stem cells derived from multiple myeloma patients display a wide range of abnormal biological features, including cytokine secretion, immune regulation and osteogenic differentiation.
OBJECTIVE: To investigate the expression of stem cell-associated proteins and chemotaxis-related receptors genes in myeloma cells when co-cultured with pulsed or sustained interleukin-1β treated bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: There were three groups in the experiment: untreated normal bone marrow mesenchymal stem cells as control, bone marrow mesenchymal stem cells only treated with interleukin-1β for 1 day as 1-day group or once a day for 7 days as 7-day group. After 7 days of culture, treated or untreated bone marrow mesenchymal stem cells were employed as coating feeder for the direct co-culture with H929 cells for 3 days. At the end of co-culture, H929 myeloma cells were harvested, the expression of NANOG, SOX2 and OCT-4 was measured by western blot, and mRNA levels of CCR1, CCR2, CCR6 and CXCR4 were detected by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The SOX2 protein levels in H929 cells were significantly higher in both 1-day and 7-day groups than that of control group (P < 0.05). In the respective of chemotaxis-related receptors, the mRNA levels of CCR1 and CCR2 in myeloma cells in 7-day group were significantly higher than those in both control and 1-day groups (P < 0.05). Our in vitro results impose inflammatory cytokine interleukin-1β in bone marrow microenvironment has direct effect on myeloma cells, but also regulates myeloma cells indirectly via non-myeloma cells such as mesenchymal stem cells; besides, sustained elevated interleukin-1β level in the bone marrow has more profound effects on myeloma cells through mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cells act an important cellular component involved in myeloma progression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Multiple Myeloma, Mesenchymal Stem Cells, Tumor Microenvironment, Interleukin-1beta

中图分类号:

R394.2

吴玉姣，费小明，叶炜，汤郁，雷芳，朱彦. 白细胞介素1β预处理骨髓间充质干细胞可影响骨髓瘤细胞株干细胞基因及趋化因子受体基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 54-59.

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图/表（结果） 2

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引言

多发性骨髓瘤是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中克隆性浆细胞的异常扩增^[1-3]。多发性骨髓瘤患者的临床表现包括骨疼痛、高钙血症、肾功能不全、造血功能抑制、多克隆免疫球蛋白的减少及骨髓血管的生成增加，尽管随着蛋白酶抑制剂和免疫调节性药物等新药的出现，多发性骨髓瘤的治疗效果较以往有明显的提高，但目前多发性骨髓瘤仍然是一种不可治愈的血液系统肿瘤^[4]。

现在已经广泛认可，多发性骨髓瘤细胞的恶性行为不仅与自身基因的异常有关，与此同时，骨髓瘤细胞与周围骨髓微环境复杂的相互作用，也在骨髓瘤疾病的发生和发展中起着重要的作用^[5-6]。多发性骨髓瘤在疾病大部分时间内定植于骨髓中，这说明骨髓微环境为多发性骨髓瘤细胞生长和存活提供必不可少的支持作用，此外，骨髓微环境在多发性骨髓瘤的耐药中也起着重要作用^[7-10]。

骨髓微环境主要由各种非骨髓瘤细胞成分及非细胞成分如细胞外基质、血管、神经等组成^[11-12]。骨髓间充质干细胞是骨髓微环境的重要细胞成分之一。最近许多研究表明，与健康供者的间充质干细胞比较，多发性骨髓瘤患者的间充质干细胞存在多种的缺陷^[13]，例如缺乏增殖能力和增殖潜能^[14-16]。在健康供者的间充质干细胞与多发性骨髓瘤患者的间充质干细胞的基因表达比较中，发现140个基因的表达存在差异表达，并且其中几乎一半的基因与恶性肿瘤调节有关^[17]。

在骨髓瘤患者的骨髓微环境中，白细胞介素1β、白细胞介素6和DKK1等往往异常增高，这被认为与多发性骨髓瘤发生、发展和耐药等密切相关^[18]。既往的大部分研究集中在这些可溶性因子对多发性骨髓瘤细胞本身上，但骨髓微环境是一个复杂的网络，这些可溶性因子不但可以作用于多发性骨髓瘤细胞，它们还可以作用于除多发性骨髓瘤细胞之外的其他非骨髓瘤细胞成分。此外，骨髓微环境中这些可溶性因子短期或长期水平异常，对多发性骨髓瘤细胞的影响有无差异，目前尚不清楚。为此，实验将观察白细胞介素1β单次或多次预处理间充质干细胞后，再在体外与骨髓瘤细胞株 H929共培养，研究对H929的干细胞基因NANOG、SOX2和OCT-4蛋白的表达以及细胞趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR6和CXCR4表达的影响。

材料方法

1.1 设计 随机对照实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年12月至2015年7月在江苏大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

骨髓间充质干细胞来源：骨髓均来自江苏大学附属医院正常供者，所有供者采集骨髓前均获得知情同意，所有协议均按照道德标准并获得伦理委员会批准。

骨髓瘤细胞株和实验用试剂：骨髓瘤细胞株H929来自ATCC由本实验室传代和保存；低糖DMEM培养液、RPMI1640培养液、胎牛血清、小牛血清(美国Gibco公司)；白细胞介素1β(美国Peprotech公司)；TRIzol试剂(美国Invitorgen公司)；反转录试剂盒(南京诺唯赞生物有限公司)；real-time PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；NANOG、SOX2抗体(美国Cell Signaling)；OCT-4抗体(美国Epitomics)。

引物：实验过程中所需引物均为广州易锦生物技术有限公司设计合成。货号：CCR1(HQP 002198)、CCR2 (HQP 054686)、CCR6(HQP056043)、CXCR4 (HQP018802)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定 参照文献[1]的方法进行。骨髓先用人淋巴细胞分离液Ficoll分离骨髓单个核细胞后，按2×10⁹ L^-¹细胞浓度接种于含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM中。24 h后细胞贴壁全换液，以后每两三天半量换液，待细胞生长至80%-90%融合，用0.25%胰蛋白酶消化，按2×10⁷ L^-¹传代培养，采用流式细胞仪技术对培养的细胞进行表型鉴定，收集第3-6代细胞用于实验。

1.4.2 实验分组

各组间充质干细胞培养7 d后，加入骨髓瘤细胞H929直接接触共培养3 d。

1.4.3 骨髓瘤细胞与骨髓间充质干细胞共培养 3组分别培养7 d后，每皿分别加入5×10⁶个的骨髓瘤细胞株H929直接接触共培养。共培养3 d后，小心吸出悬浮的H929细胞以供后续实验。

1.4.4 蛋白印迹法 收取共培养后的各组H929细胞，离心后用细胞裂解液将细胞裂解，分别收集各组细胞的蛋白，并用紫外分光光度仪测取蛋白浓度。用5%的压缩胶及12%的分离胶分离蛋白，80 V电压电泳30 min，再将电压调为 100 V，电泳90-120 min。然后用350 mA恒定电流，转膜2 h至PVDF膜上，用TBST配置5%的牛奶封闭1 h，最后分别用一抗NANOG(1∶500)、SOX2(1∶1 000)、OCT-4(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)孵育过夜。TBST洗膜3次后，二抗孵育1 h，再洗膜3次，曝光。

1.4.5 RNA的提取和RT反应 收取各组H929细胞，分别加入1 mL RNA提取液Trizol，并充分震荡混匀，裂解细胞。提取裂解液加入氯仿，震荡离心后收取上清液，再加入异丙醇混匀，静置离心后弃上清，加入体积分数75%乙醇混匀，离心弃上清，晾干，用DEPC水收取RNA。提取各组H929细胞总RNA后，所得的RNA样本经分光光度计检测，A₂₆₀/A₂₈₀比值均在1.8-2.0。cDNA合成按反转录试剂盒操作说明，反应体系通常为20 μL，取总量1μg的RNA于65 ℃反应5 min后，42 ℃放置1 h。

1.4.6 趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR6、CXCR4的real-timePCR PCR反应体系为TAKARA推荐使用的25 μL体系，实时荧光定量PCR反应体系在Mx3000P^TM扩增仪上进行扩增。两步法PCR扩增标准程序：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 30 s，40个循环，每个标本重复3次，所得的Ct值代入公式2^-^??Ct计算mRNA表达水平。

1.5 主要观察指标 ①体外培养的骨髓间充质干细胞形态结果；②蛋白印迹法检测H929中NANOG、SOX2和OCT-4的表达；③real-time RT-PCR检测H929中趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR6、CXCR4的表达。

1.6 统计学分析 采用 SPSS 18.0统计软件处理。计量资料均用x(_)±s表示，组间比较用配对t 检验，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 骨髓微环境 目前已经有许多研究表明，骨髓微环境在支持骨髓瘤的发生和发展中起着至关重要的作用^[19-23]。骨髓瘤细胞通过细胞与细胞、细胞与细胞外基质蛋白或可溶性调节因子，如细胞因子、趋化因子和生长因子，与骨髓微环境产生沟通和联系^[22^，^24]；也可以通过与间充质干细胞来源的外泌体与骨髓微环境交换蛋白、mRNA和miRNA^[25]。在骨髓微环境中，无论是直接通过细胞间相互黏附，或者通过细胞因子或生长因子引起的信号通路的激活，都能促进多发性骨髓瘤细胞增殖、生存、耐药性和多发性骨髓瘤细胞的迁移，以及破骨细胞和血管生成^[26]。

3.2 骨髓间充质干细胞 间充质干细胞是参与生物细胞、组织修复的重要细胞，其具有自我更新、多系分化细胞、诱导肿瘤及创伤归巢和免疫调节等多种作用^[27-28]。间充质干细胞可以在特定条件分化为软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和肌细胞^[24^，^29]。一些研究表明，多发性骨髓瘤患者的间充质干细胞具有异常的基因表达谱，细胞表面表型和免疫调节等功能特性，此外，多发性骨髓瘤患者的间充质干细胞还有成骨分化功能的异常，这被认为与骨髓瘤患者的骨骼病变相关^[30]。

多发性骨髓瘤的间充质干细胞高表达一些独特的基因和细胞因子，如白细胞介素6、白细胞介素1β、DKK1和基质细胞衍生因子1等，这些因子均有利于肿瘤细胞的存活及扩增^[31-33]。其中白细胞介素6已被证明是一个至关重要的骨髓瘤细胞生长因子^[34-37]。虽然许多细胞因子能刺激白细胞介素6的产生，但在多发性骨髓瘤中，白细胞介素1β可能是刺激骨髓基质细胞分泌白细胞介素6的的主要的细胞因子^[38]。白细胞介素1β是一个强有力的破骨细胞激活因子，在溶骨性病变的发展中起主要作用^[33^，^39-40]。但在体外研究发现，适当剂量的白细胞介素1β，可诱导间充质干细胞分化为成骨细胞^[41]。

3.3 转录因子Nanog、Oct4、Sox2 转录因子SOX2与POU结构域转录因子Oct4和同源转录因子Nanog形成调控核心，保持胚胎内细胞群和胚胎干细胞的自我更新及多能性^[42-44]。Yamanaka等^[45-46]证明，Nanog、Oct4、SOX2三个转录因子，在许多类胚胎干细胞中，是维持多能性的必不可少的因素。特别是Sox2在胚胎发育过程中的表达是必不可少的，Sox2基因纯合缺失的胚胎着床不久后就会死亡，而且它是内细胞群形成前，内细胞最早的标记，在胚胎早期分化间就可以被检测到^[47-48]。有研究证明，转录因子Sox2可以激活Akt，从而参与胚胎干细胞的多能性和自我更新并诱导多能干细胞^[46-47^，^49]。而且，Sox2在意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)过渡为多发性骨髓瘤期间表达明显增加，一部分CD138⁺的多发性骨髓瘤患者细胞可检测到Sox2的表达^[50]。还有研究显示，来源于多发性骨髓瘤患者间充质干细胞的GDF15，可通过增加SOX2的表达来提高多发性骨髓瘤细胞的自我更新能力^[51]。结果提示，多发性骨髓瘤细胞与经炎性因子白细胞介素1β预处理的间充质干细胞相互作用后，上调多发性骨髓瘤的SOX2水平，这可能与骨髓微环境中异常炎症水平及间充质干细胞影响多发性骨髓瘤细胞自我更新有关。

3.4 趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR6和CXCR4 趋化因子是细胞活素类超家族蛋白，在选择性招募和趋化白细胞归巢中，发挥关键作用^[52]。基于半胱氨酸残基的数量和排列，趋化因子可分为C、CC、CXC、C(x)3C四个亚科^[53]。多发性骨髓瘤细胞表达多种趋化因子受体，并分泌多种趋化因子，参与细胞的归巢、肿瘤的生长和发展。浆细胞在骨髓中的迁移，以及在骨髓微环境中的趋化，是由趋化因子受体及其配体的相互作用的结果^[54]。研究发现，多发性骨髓瘤中趋化因子受体CCR1、CCR2、CCR6、和CXCR4可与趋化因子MIP-1α、基质细胞衍生因子1等结合，从而参与P13-K/AKT、MAPK通路的激活，促使多发性骨髓瘤细胞DNA合成，调节瘤细胞增殖、分化、迁移，阻止多发性骨髓瘤细胞凋亡的^[55-57]。CCR1、CCR2也可由破骨细胞产生，并可促进破骨细胞的趋化活性，表达CCR1的多发性骨髓瘤细胞可以招募产生MIP-1α的各种细胞，表达CCR2的骨髓瘤细胞，可特别招募破骨细胞^[58-59]。

骨髓微环境中的各种细胞和非细胞成分组成一个复杂的网络，这一网络中每一成分对另一成分既能直接影响，也可以间接影响。实验结果提示骨髓微环境的异常水平细胞因子白细胞介素1β，可以先通过作用于骨髓间充质干细胞后，再通过间充质干细胞与多发性骨髓瘤细胞的直接/间接接触后，影响多发性骨髓瘤细胞的多种基因的表达。此外，短期和长期白细胞介素1β水平增高，对间充质干细胞以及最终对多发性骨髓瘤细胞的影响也有区别。结果提示，骨髓微环境中炎性因子如白细胞介素1β水平等长期异常，通过骨髓微环境中的非骨髓瘤细胞如间充质干细胞等，来最终影响骨髓瘤的功能。所以，在今后骨髓瘤治疗的研究中，不但要注意这些炎性因子对骨髓瘤细胞的直接作用，还要研究如何阻断炎性因子通过间充质干细胞等其他细胞成分，间接影响骨髓瘤细胞的方法。

白细胞介素1β预处理骨髓间充质干细胞可影响骨髓瘤细胞株干细胞基因及趋化因子受体基因的表达

Interleukin-1beta regulates stem cell gene and chemokine receptor gene expression of myeloma cell lines via pretreatment on bone marrow mesenchymal stem cells

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