骨髓间充质干细胞移植对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 49-53.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.009

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骨髓间充质干细胞移植对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响

陈光华，黄贵芝，林颢，吴浩俊，陈航

广东医学院附属医院骨外科，广东省湛江市 524001

修回日期:2016-11-02 出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
通讯作者: 陈航，主任医师，广东医学院附属医院骨外科，广东省湛江市 524001
作者简介:陈光华，男，1980年生，广东省湛江市人，2015年广东医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事创伤骨科、骨质疏松方面的研究。
基金资助:
广东省湛江市2015科技计划项目(2015A01018)

Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation increases bone mineral density of an ovariectomized rat model of osteoporosis

Chen Guang-hua, Huang Gui-zhi, Lin Hao, Wu Hao-jun, Chen Hang

Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China

Revised:2016-11-02 Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
Contact: Chen Hang, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China
About author:Chen Guang-hua, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang 524001, Guangdong Province, China
Supported by:
the 2015 Scientific Research Plan of Zhanjiang in Guangdong Province, No. 2015A01018

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨钙素：又称骨γ-羧谷氨酸包含蛋白。该蛋白在骨矿化峰期之后才出现积聚。通过血清骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态。骨钙素值随年龄的变化以及骨更新率的变化而不同。骨更新率越快，骨钙素值越高，反之降低。
骨密度：全称是骨骼矿物质密度，是骨骼强度的一个重要指标，是一个绝对值。在临床通常使用T值判断骨密度是否正常。T值是一个相对值，正常参考值在-1和+1之间。当T值低于-2.5时为不正常。骨密度是反映骨质疏松程度，预测骨折危险性的重要依据。

摘要
背景：骨髓间质干细胞可向成骨细胞分化，移植后可向病变部位迁移等特性，使其在骨质疏松中的研究受到越来越多的关注和重视。
目的：观察骨髓间质干细胞移植对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响及其可能的作用机制。
方法：①采用全骨髓贴壁培养法，从幼年SD大鼠股骨和胫骨骨髓中分离培养骨髓间质干细胞；②将成年雌性大鼠30只随机分为3组：假手术组、卵巢切除组、卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组，每组10只。待骨质疏松模型建立成功后，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠经尾静脉注射含3.5×10⁹ L^-1骨髓间质干细胞的PBS溶液(80 μL/kg)，其他2组注射等量的PBS溶液；③细胞移植第2周，采用双能X射线骨密度仪测量各组大鼠股骨骨密度、腰椎骨密度及全身骨密度，并测定血清钙、磷、碱性磷酸酶及骨钙素水平，micro-CT扫描进行胫骨组织微结构形态计量学分析。
结果与结论：①卵巢切除组大鼠股骨骨密度、腰椎骨密度及全身骨密度显著低于假手术组；卵巢切除组大鼠血清中钙、骨钙素水平也显著低于假手术组，而磷、碱性磷酸酶水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，以上表明骨质疏松大鼠模型成功制备；②与卵巢切除组大鼠相比，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠股骨、腰椎及全身骨密度均明显增加，血清中钙、骨钙素水平亦显著升高，而血清磷、碱性磷酸酶水平下降，差异均有显著性意义(P < 0.05)；③与卵巢切除组比较，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠的骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，骨髓间质干细胞移植能够提高卵巢切除骨质疏松大鼠骨密度，促进骨形成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5519-9369(陈光华)

关键词: 干细胞, 移植, 骨质疏松, 骨髓间质干细胞, 骨密度, 动物模型, 细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can be differentiated into osteoblasts, and migrate to lesion sites after transplantation, which have attracted more and more attentions in the research of osteoporosis.
OBJECTIVE: To study the effect of BMSCs transplantation on bone mineral density in an ovariectomized rat model of osteoporosis and its possible mechanism of action.
METHODS: Using the whole bone marrow culture method, BMSCs were isolated from the femur and tibia of juvenile Sprague-Dawley rats. Thirty adult female rats were randomly divided into three groups: control group, ovariectomized group, and cell transplantation group, with 10 rats in each group. Osteoporosis models were made in ovariectomized and cell transplantation group. Then, PBS solution containing 3.5×10⁹/L BMSCs at a dose of 80 μL/kg was injected via the tail vein into the rats in the cell transplantation group, while the same volume of PBS solution was injected in the other two groups. Two weeks later, dual-energy X-ray absorptiometry was used to measure bone mineral density of the femur, lumbar spine and whole body. Serum levels of calcium, phosphorus, alkaline phosphatase and osteocalcin were determined. Micro-CT was used for morphometric analysis of the tibial microstructure.
RESULTS AND CONCLUSION: After ovariectomy, there was a significant reduction in the bone mineral density of the rat femur, lumbar spine and whole body as well as the levels of serum calcium and osteocalcin; however, the phosphorus and alkaline phosphatase levels were increased significantly (P < 0.05 or P < 0.01). These findings indicate the successful preparation of the osteoporosis rat model. Compared with the ovariectomized group, the bone mineral density of the rat femur, lumbar spine or whole body was significantly higher in the cell transplantation group, and significantly increased serum calcium and osteocalcin and significantly decreased phosphorus and alkaline phosphatase levels were also found in the cell transplantation group (P < 0.05). Additionally, the bone volume fraction, number of trabeculae and thickness of trabecular bone were significantly increased in the cell transplantation group compared with the ovariectomized group (P < 0.05). To conclude, our results show that BMSCs can improve the bone mineral density of osteoporosis rats induced by ovariotomy, and thereby promote new bone formation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Osteoporosis, Postmenopausal, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Bone Density, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈光华，黄贵芝，林颢，吴浩俊，陈航. 骨髓间充质干细胞移植对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 49-53.

Chen Guang-hua, Huang Gui-zhi, Lin Hao, Wu Hao-jun, Chen Hang. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation increases bone mineral density of an ovariectomized rat model of osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 49-53.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间质干细胞形态 原代细胞接种12 h后，见少量贴壁细胞。传至第2代时，贴壁细胞明显增多，成簇状生长。传至第4代时，细胞胞膜清晰、形态均一，折光性强，呈长梭形或多角形，见图1。

2.2 骨髓间质干细胞表面标记物表达采用流式细胞仪对骨髓间质干细胞表面标记抗原进行鉴定，结果发现CD44表达为阳性，CD45表达为阴性，见图2。

2.3 各组大鼠骨密度变化 与假手术组相比，卵巢切除组大鼠的腰椎、股骨及全身骨密度均显著降低，差异有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)；与卵巢切除组相比，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠的腰椎、股骨及全身骨密度显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 血清中骨性标志物检测结果 卵巢切除组大鼠血清中钙、骨钙素水平显著低于假手术组，而磷、碱性磷酸酶水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)。与卵巢切除组相比，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠血清中钙、骨钙素水平显著升高，而血清磷、碱性磷酸酶水平下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组血清钙、骨钙素水平仍低于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.5 骨组织微结构micro-CT检测结果 与假手术组比较，卵巢切除组大鼠的骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均显著降低，骨小梁分离度显著增高，差异有显著性意义(P < 0.05)。与卵巢切除组比较，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠的骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组骨小梁数量、骨小梁分离度、骨体积分数与假手术组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

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引言

骨质疏松是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病。骨密度是检测骨质疏松的重要指标，在医学上认为是人体重骨盐，其组成部分包括钙和磷两种元素，以高度结晶形成的羟磷灰石为存在形式。骨密度与骨质疏松密不可分，如何精准的测量骨密度对骨质疏松的早期诊断、及时治疗及评价骨质流失起着至关重要的作用^[1-3]。世界卫生组织将骨质疏松的概念定义为：以骨量减少、骨微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病^[4-6]。早在1981年，Mazess 提出双能X射线骨密度测量法，被用来诊断骨质疏松^[7-8]。双能X射线骨密度测量一般倾向于选择全身、股骨及腰椎骨这3个代谢活跃部位，也是骨密度测量的重要部位^[9]。随着老龄化社会的到来，2013年中国骨质疏松症患者已经超过8 800万，并伴有年轻化趋势^[10]。目前治疗骨质疏松主要以药物方法为主，但是这种治疗方法花费高，需要长时间治疗并且存在药物毒副作用，同时疗效并不理想，因此需要寻求更理想的方法。骨髓间质干细胞是一类来自成体骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，对其在骨质疏松中的研究也受到越来越多的关注和重视。骨髓间质干细胞所具备的特征包括增殖能力强、低免疫原性、可向成骨细胞分化、移植后可向病变部位迁移等^[11]。

实验采用全骨髓贴壁培养法，从幼年SD大鼠股骨和胫骨骨髓中分离培养出骨髓间质干细胞，并通过双侧卵巢切除的方法建立大鼠骨质疏松模型，然后经尾静脉植入骨髓间质干细胞治疗，测定大鼠股骨骨密度、腰椎密度及全身骨密度，血清中钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶、骨钙素水平以及胫骨组织微观结构，研究骨髓间质干细胞治疗骨质疏松大鼠的可能机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照，动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年1月至2015年10月在广东医学院附属医院临床医学研究中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，选取体质量120-180 g、4周龄雌性大鼠5只用作分离骨髓间质干细胞；选取体质量180-220 g、7周龄雌性大鼠30只用作动物体内实验。所有大鼠均购于广西医科大学实验动物中心，大鼠饲养环境为SPF级，自由饮水。

1.3.2 主要试剂 胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素(Gibco公司)；胰蛋白酶(含EDTA)(Hyclone公司)；二甲基亚砜(Sigma公司)；戊巴比妥钠(德国MERCK公司)；小鼠单克隆抗大鼠CD45(Biolegend公司，美国)；小鼠单克隆抗兔CD44(英国 AbD Serotec公司)。

1.3.3 主要仪器 OSTEOCORE Station型双能X射线骨密度测量仪(法国MEDI LINK公司)；HMIAS-2000型医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限责任公司)；MCV-16BSU超净工作台(Sanyo公司，德国)；CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)；实验动物手术包(南京军区福州总医院比较医学科)；Milli-Q labconco纯水仪(美国Millipore公司)；普通光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；BL12型电子分析天平(德国FISHER SCIENIFIC公司)；冻存管、培养瓶、培养板(美国Corning公司)；低温离心机(Sigma，美国)；电热恒温水浴槽(中国森信DK-8D)；血球计数板(江玉环县求精医用仪器厂)；微量加样器(德国 GILSON公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间质干细胞的分离与原代培养^[12-13] ①取健康4周龄SD大鼠，以2 mL/kg剂量注射戊巴比妥钠麻醉，再脱颈处死；②用体积分数为75%乙醇消毒大鼠腹股沟部位，浸泡10 min；③在无菌条件下，取出股骨和胫骨，用体积分数为75%乙醇浸泡2 min，置于PBS中；④用骨剪将股骨和胫骨两端小心剪断，暴露出骨髓腔；⑤用2.5 mL无菌注射器抽取适量PBS，冲洗骨髓腔两三次，直至冲出的液体变清澈，收集到无菌离心管中，将骨髓冲洗液反复吹打，形成细胞悬液；⑥离心后(1 500 r/min，6 min)以含体积分数为10%胎牛血清、1%的双抗的DMEM全培养基重悬细胞，制成骨髓间质干细胞悬液；⑦以适当密度接种于25 cm培养瓶中，置于37%、体积分数为5%CO₂培养箱中培养；⑧培养72 h后换液，倒去未贴壁细胞；⑨当细胞长满80%左右时，用含EDTA的胰酶消化传代；⑩收集第3代较为纯质的骨髓间质干细胞，进行细胞鉴定和移植实验。

1.4.2 骨髓间质干细胞的形态学观察及鉴定^[14] 在倒置相差显微镜下对第3代骨髓间质干细胞进行观察。采用流式细胞仪对骨髓间质干细胞表面标记抗原进行鉴定。收集生长良好的第3代骨髓间质干细胞，胰酶消化，1 500 r/min离心 6 min，用全培养基重悬，分别加入荧光标记的小鼠单克隆抗大鼠一抗CD44-PE(1∶1 000)和CD45-FITC(1∶1 000)20 μL，室温下孵育20 min，加入适量PBS，混匀，1 500 r/min离心6 min，弃上清后再次加入PBS重悬，上流式细胞仪检测。

1.4.3 双侧卵巢切除法建立大鼠骨质疏松模型^[15] 将SD大鼠以2%戊巴比妥钠(2 mL/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧，固定四肢于手术台上，以体积分数为75%乙醇及碘酊消毒，在其下腹正中部取纵切口2.5 cm，逐层切开皮肤、筋膜、肌肉，进入腹腔，以小镊子将白色发亮脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，沿输卵管找到卵巢，用手术线将其周围相连的血管及输卵管结扎，并切除双侧卵巢，然后逐层缝合切口，给予青霉素预防感染。假手术组在卵巢附近切除一小部分脂肪组织，但不伤及血管。

1.4.4 骨髓间质干细胞移植 将成年雌性大鼠30只随机分为3组：假手术组、卵巢切除组、卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组，每组10只。待骨质疏松模型建立后2个月，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠经尾静脉注射含3.5×10⁹ L^-¹骨髓间质干细胞的PBS溶液80 μL/kg，其他2组注射等量的PBS溶液，自由饮水，常规饲养。

1.4.5 骨性标志物检测 于移植2周后，各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，置于OSTEOCORE双能X射线骨密度测量仪上，通过计算机医学图文分析系统软件测量每只大鼠的股骨骨密度、腰椎骨密度及全身骨密度。然后脱颈处死大鼠，留取全血，静置1 h，以3 500 r/min离心15 min，取血清，进行钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素含量的测定。

1.4.6 骨组织微结构micro-CT检测 上述大鼠处死后，取各组大鼠左侧胫骨组织，micro-CT扫描，进行骨组织微结构形态计量学分析。

1.5 主要观察指标 ①股骨骨密度、腰椎骨密度及全身骨密度；②血清中钙、磷、碱性磷酸酶、骨钙素的含量；③骨组织微结构形态计量学分析。

1.6 统计学分析 数据均以x(_)±s表示，用SPSS 20.0软件包进行统计学处理，组间比较采用t 检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松归属中医学中“骨痿”、“骨痹”、“骨蚀”等范畴。总体认为肾藏精，主骨髓，骨得到髓的滋养则坚固有力，骨不得髓则骨枯不坚，从而引发骨质疏松。从根本上来讲，骨质疏松常可导致骨量流失、骨密度降低，骨强度受损^[16]。骨质疏松症大致分为3种，分别是绝经后骨质疏松症、衰老性骨质疏松症和某些继发性骨质疏松症，临床主要是以长期药物治疗为主，疗效缓慢，且无针对性^[17-19]。骨质疏松的发病机制至今尚不完全清楚，从根本上来讲认为是成骨细胞和破骨细胞在骨重塑过程中的失衡。近年来越来越多的科研人员希望通过促进干细胞向成骨细胞分化来治疗骨质疏松。目前用于治疗骨质疏松的干细胞主要包括脂肪源干细胞、骨髓间质干细胞等。由于人骨髓间充质干细胞具有良好的成骨细胞分化潜能和成骨活性，被认为是骨组织工程中种子细胞的最佳选择^[20-22]。研究表明骨髓间质干细胞有直接的成骨作用，可以使成骨因子和血管生长因子水平升高^[23]。

根据Friedenstein等^[13]提出的骨髓间质干细胞具有黏附贴壁生长的特性，实验采用全骨髓贴壁培养法进行常规培养得到纯度较高的骨髓间质干细胞，经流式细胞仪检测CD44表达阳性，CD45表达阴性。骨髓间质干细胞移植2周后，卵巢切除组大鼠股骨骨密度、腰椎骨密度及全身骨密度显著低于假手术组；卵巢切除组大鼠血清钙、骨钙素水平也显著低于假手术组，而磷、碱性磷酸酶水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，以上表明骨质疏松大鼠模型成功制备。与卵巢切除组大鼠相比，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠股骨、腰椎及全身骨密度均明显增加，血清中钙、骨钙素水平亦显著升高，而血清磷、碱性磷酸酶水平下降，差异均有显著性意义(P < 0.05)。骨组织微结构micro-CT检测结果计量学分析显示，与假手术组比较，卵巢切除组大鼠的骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均显著降低，骨小梁分离度显著增高，差异有显著性意义(P < 0.05)。与卵巢切除组比较，卵巢切除+骨髓间质干细胞移植组大鼠的骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度均显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。

目前已经证实干细胞移植可以用于治疗骨质疏松。越来越多的研究表明干细胞还可以治疗骨不连、骨缺损等疾病^[24-26]。但是目前开展干细胞移植还存在许多问题如干细胞的获取、体外培养、诱导干细胞分化的最佳条件等都有待于进一步解决。

骨髓间充质干细胞移植对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响

Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation increases bone mineral density of an ovariectomized rat model of osteoporosis

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