转化生长因子β1基因沉默脂肪干细胞移植治疗血小板减少性紫癜

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
血小板减少性紫癜：是血液科常见的疾病，通常采用激素、美罗华、切脾或者中药等进行治疗。对于难治复发的血小板减少性紫癜的治疗目前仍无有效方法。文章选择临床上这一常见病为研究内容，以实验室干预方式进行探讨和研究，为希望能临床上该病的治疗提供新的方法。
基因沉默：自在转基因植物中发现转基因沉默现象以来，很多学者对该现象进行了广泛的研究，认为其作用机制有3种：位置依赖性基因沉默、转录水平基因沉默、转录后水平基因沉默。目前主要集中于转录后水平基因沉默的研究，通过研究发现它具有广泛性、可传导性及特异性的特点，并对其机制提出了一些假说。

摘要
背景：有研究表明干细胞治疗为血小板减少性紫癜的治疗带来了新的希望，但对于此病的完美的治疗仍存在困难。
目的：探讨转化生长因子β1基因沉默脂肪干细胞移植对血小板减少紫癜小鼠疗效的影响。
方法：将构建的转化生长因子β1-siRNA质粒转染至小鼠脂肪干细胞中，使其低表达转化生长因子β1。用豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)腹腔注射构建血小板减少性紫癜模型小鼠，建模后随机分为4组，血小板减少性紫癜模型组尾静脉注射生理盐水20 μL，脂肪干细胞组和转化生长因子β1沉默组分别尾静脉注射2×10⁶ L^-1的CM-Dil标记的脂肪干细胞，转化生长因子β1沉默脂肪干细胞悬液20 μL，泼尼松组按泼尼松5 mg/kg灌胃，连续治疗14 d。
结果与结论：①免疫荧光染色及EILSA检测：与其他3组比较，转化生长因子β1沉默组CM-Dil标记的阳性细胞数目，血小板计数，产板型巨核细胞比例均升高，骨髓巨核细胞总数、PAIgG及转化生长因子β1水平下降(P < 0.05)；②结果说明，转化生长因子β1基因沉默脂肪干细胞移植能有效降低血小板减少性紫癜小鼠转化生长因子β1及PAIgG水平，促进骨髓巨核细胞分化成熟，从而有效提高血小板计数，对治疗血小板减少性紫癜有效果较好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0002-3236-5704(尹婉宜)

关键词: 干细胞, 移植, 脂肪干细胞, 转化生长因子β1, 基因, 沉默, 脂肪干细胞, 血小板, 减少, 紫癜, 小鼠, 疗效

Abstract:

BACKGROUND: Some studies have shown that stem cell therapy offers new promise for the treatment of thrombocytopenic purpura, but there are still difficulties in the perfect treatment for thrombocytopenic purpura.
OBJECTIVE: To investigate the effect of transplantation of transforming growth factor beta1 (TGF-β1) gene silenced mouse adipose-derived stem cells (ADSCs) in mice with thrombocytopenic purpura.
METHODS: The mouse ADSCs were cultured in vitro and transfected by the siRNA expression plasmids containing TGF-β1 (TGF-β1-siRNA). Mouse model of thrombocytopenic purpura were made by guinea pig anti-mouse platelet serum intraperitoneally injected. Then, model mice were randomly assigned into model, ADSCs, TGF-β1 silenced ADSCs, or prednisone group, followed by intravenous injection of 20 μL normal saline, 2×10⁶/L CM-Dil-labeled ADSCs, 20 μL TGF-β1 silenced ADSCs suspension via the tail vein, or intragastrical administration of 5 mg/kg prednisone, respectively. The mice in each group were sacrificed after 14 days of treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the other three groups, the TGF-β1 silenced ADSCs group showed a significant increase in the number of CM-Dil positive cells, blood platelet count, and proportion of thromocytogenic megakaryocytes, while a marked decrease in the total number of megakaryocytes, PAIgG values and TGF-β1 level (P < 0.05). To conclude, TGF-β1 gene silenced ADSCs transplantation can effectively reduce the TGF-β1 and PAIgG values in ITP mice, and promote the differentiation and maturation of megakaryocytes in the bone marrow, which can effectively improve the number of platelets, playing a role in the treatment of ITP.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Transforming Growth Factor beta, Blood Platelets

中图分类号:

R394.2

尹婉宜，沈扬，刘清池，贾晓辉，张丽红. 转化生长因子β1基因沉默脂肪干细胞移植治疗血小板减少性紫癜[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 60-65.

Yin Wan-yi, Shen Yang, Liu Qing-chi, Jia Xiao-hui, Zhang Li-hong. Transforming growth factor beta1 gene silenced adipose-derived stem cell transplantation reduces thrombocytopenic purpura[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 60-65.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验共纳入小鼠80只，均造模成功并进入结果分析，期间无死亡、感染及补充和缺失等情况发生。

2.2 动物一般情况 各实验组在造模后的第2天均出现明显的皮下出血和紫癜，以注射部位、四肢、腹部、尾部多见，注射后短时间内小鼠精神萎靡、活动量少、行动迟缓、喜扎堆。各组予不同方式干预后，脂肪干细胞组出血明显减轻，泼尼松组及转化生长因子β1沉默组紫癜明显减退、活动量增加；而模型组小鼠的紫癜情况无显著变化。

2.3 脂肪干细胞的形态观察 分别在显微镜下观察P4代和M-Dil标记的脂肪干细胞。传3代后的脂肪干细胞，生长旺盛，形态渐趋一致、愈趋向长梭形，以一点为中心向两头呈放射状。细胞呈复层生长，胞膜完整、细胞状态良好，细胞间联系紧密，见图1A。经过CM-Dil标记的脂肪干细胞细胞，荧光显微镜观察，可见红色荧光细胞，标记率达98%，见图1B。

2.4 转染后脂肪干细胞中转化生长因子β1蛋白的表达 应用Western blot法于TGF-β沉默脂肪干细胞转染后3 d对各组转化生长因子β1蛋白表达量比较发现，转化生长因子β1呈现低表达，第14天再次对各组转化生长因子β1表达量进行比较，蛋白仍呈现低表达水平(图2)。

2.5 CM-Dil标记转染后脂肪干细胞情况 荧光显微镜下，经CM-Dil标记的脂肪干细胞呈现红色荧光。血小板减少性紫癜模型组及泼尼松组未见CM-Dil阳性细胞，脂肪干细胞组较多[(16.69±3.17)%]，转化生长因子β1沉默组[(22.98± 4.06)%]明显增多(P < 0.05，图3)。

2.6 血小板、骨髓巨核细胞计数、比例变化 对各组血小板计数进行比较发现：与血小板减少性紫癜模型组比较，脂肪干细胞组、泼尼松组及转化生长因子β1沉默组血小板计数均较高；且转化生长因子β1沉默组最高(P < 0.05)，这提示脂肪干细胞、转化生长因子β1与泼尼松相类似，均能够提升血小板数，对血小板减少性紫癜小鼠的治疗其积极作用(表1)。
各组巨核细胞计数进行比较发现，脂肪干细胞组、泼尼松组及转化生长因子β1沉默组计数均较血小板减少性紫癜模型组低，且转化生长因子β1沉默组最低(转化生长因子β1沉默<泼尼松组<脂肪干细胞组)，差异有显著性意义(P < 0.05)。进一步行细胞比例的比较，各治疗组产板巨核细胞均较血小板减少性紫癜模型组增加，且经转化生长因子β1 沉默治疗组增加更明显(转化生长因子β1沉默组>泼尼松组>脂肪干细胞组)(P < 0.05)，见表1，2。说明泼尼松、脂肪干细胞及转化生长因子β1均能够使骨髓巨核细胞分化增加，且产板比例增加，进而提升外周血小板数，对血小板减少性紫癜小鼠进行治疗。

2.7 各组血清PAIgG及骨髓转化生长因子β1水平变化 由表3可以看出，血小板减少性紫癜模型组PAIgG水平较脂肪干细胞组、泼尼松组及转化生长因子β1沉默组明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，且脂肪干细胞组>泼尼松组>转化生长因子β1沉默组(P < 0.05)。各组骨髓转化生长因子β1进行比较发现：血小板减少性紫癜、泼尼松和脂肪干细胞组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；而转化生长因子β1沉默组与血小板减少性紫癜模型组相比，转化生长因子β1水平显著下降(P < 0.05)。

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引言

近年来，免疫性血小板减少性紫癜发病率升高，其发病与免疫功能异常有非常重要的联系，但导致免疫功能异常的调控因素有待进一步深入研究。目前临床上常采用的治疗方案包括脾切除或激素等，虽然能够提升血小板数量，防止严重的出血，对疾病的治疗起到一定作用，但该方案容易产生一些不良反应，影响患者的预后。近年来，干细胞治疗成为血小板减少性紫癜的治疗中的一个极有前途的治疗方法。

干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞，在组织的损伤修复方面有极大的潜力。哺乳动物的干细胞包括2大类：胚胎干细胞及成体干细胞。前者为多能型干细胞；后者为多向潜能型细胞，在骨髓、肌肉、脂肪等多种组织等广泛存在，当给予不同的诱导时，可向不同的方向进行分化。近年来，脂肪来源的干细胞已成为组织工程和再生医学最受欢迎的干细胞之一。脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种有多向分化潜能的干细胞。研究发现，脂肪干细胞无论是在体内还是在体外特定的诱导条件下，能够向多种组织细胞进行分化，连续传代或冷冻保存后仍保持其多向分化潜能。除此之外，脂肪干细胞较其他来源的干细胞还有增殖能力强、丰富的自体来源、对供者伤害小等优点。因此，目前将脂肪干细胞作为理想的种子细胞，用于组织器官的修复工作。

转化生长因子β1是一种具有多种生物学功能的蛋白，在血小板及巨核细胞中含量较高，在细胞的增殖、分化中担当关键角色^[1-3]，其在免疫调节和耐受中的作用也逐渐被人们所发现。因此实验通过腹腔注射豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)进行血小板减少性紫癜模型的制作，并给予转化生长因子β1沉默的脂肪干细胞进行干预，进而探讨其对血小板减少性紫癜小鼠疗效的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年4月至2016年7月在河北省实验动物中心完成。

1.3 材料

实验动物：健康8周龄雌性Balb/c小鼠，SPF级，体质量18-22 g，由河北省实验动物中心提供，实验动物质量合格证号080373，实验动物许可证号：SCXK(冀)2013-1007；使用许可证号：SYXK(冀)2013-0005。

细胞：河北省实验动物中心实验室冻存的小鼠+脂肪干细胞。

1.4 实验方法

1.4.1 体外复苏并培养和标记脂肪干细胞 取出实验室保存的脂肪干细胞，以防冷冻管爆裂，置于37 ℃水浴，不间歇、轻轻摇动冷冻管，迫使其充分融化时间1 min，融解后，放置于无菌操作台(SCW-CJ型超净工作台，苏州宏瑞净化科技有限公司)中，吸取定量解冻完成的细胞悬浮液，加至预先配置好的1∶10倍稀释的L-DMEM培养基。于培养瓶中接种细胞，并静置于37 ℃、体积分数5%CO₂的饱和湿度培养箱(3111型恒温培养箱，美国Forma公司)中培养。每隔2 d更换新鲜培养液，除去未贴壁细胞，至细胞融合85%时，去除培养基，吸取贴壁细胞，加至培养皿中，质量浓度3 g/L胰酶消化5 min，用已配置的等体积分数10%胎牛血清低糖培养基终止消化，细胞吹打到成悬液，进行离心(L-530离心机，湖南赛特湘仪离心机有限责任公司)，1 500 r/min，离心5 min，弃去上清非贴壁细胞，在新配置的无菌培养基中调节浓度，依照上述方法进行培养。两三天更换新鲜培养基，第4代(P4代)供于该研究，吸取CM-Dil液5 µL至1.5 mL的EP管中，加入1 mL完全培养液，吹打均匀，即得CM-Dil标记液。取贴壁达90%融合的细胞，吸弃培养液，PBS洗3次，加入上述标记液40 µL/cm²，于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度恒温培养箱中孵育20 min，吸弃标记液，加入37 ℃的完全培养液5 mL，孵育，10 min后吸弃，继续加入培养液重复清洗2次。培养24 h后在倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)下观察CM-Dil标记效果和细胞形态变化。随机选取5个视野，计数CM-Dil阳性细胞数及细胞总数，计算标记率。标记率=(视野内阳性细胞总数/视野内细胞总数)×100%。移植时用PBS洗涤细胞3次，将终细胞浓度调为1×10¹⁰ L^-¹备用。

1.4.2 基因转染 取生长状态良好的P4代脂肪干细胞，更换新的培养基。按照文献[4]设计靶向转化生长因子β1基因的转化生长因子β1-siRNA序列，针对转化生长因子β1 siRNA的特异性靶序列：上游引物：5’-GAT CCG GGC AGC TGT ACA TTG ACT TTT CAA GAG AAA GTC AAT GTA CAG CTG CCC TTT TTT G-3’，下游引物：5’-AAT TGA AAA AAG GGC AGC TGT ACA TTG ACT TTC TCT TGA AAA GTC AAT GTA CAG CTG CCC G-3’，片段长度573 bp，所有序列及腺病毒载体均由珠海英平生物技术有限公司合成。将带有转化生长因子β1基因的腺病毒添加到培养基中，将其放于恒温培养箱中，8 h后将含有病毒的培养基除去，并用PBS对其进行彻底洗涤，共2次。毕后向其中添加完全培养基，并培养72 h。随后将其替换成质量浓度1 mg/L嘌呤霉素的完全培养基。每天固定时间将未转染成功的细胞去除，并更换液体，将其放于显微镜下进行观察，直至死亡细胞不再增加。向其中添加完全培养基继续进行培养，直至实验所需时间为止，对其进行后续相关指标的检测。依据干预方式的不同，分为3组：空白组(未经任何特殊处理的脂肪干细胞)、对照组(转染对照腺病毒的脂肪干细胞)、转化生长因子β1-siRNA转染组(转染转化生长因子β1-siRNA腺病毒的脂肪干细胞)。

1.4.3 Western blot检测脂肪干细胞被转染后第3，14天的转化生长因子β1 蛋白的表达分别于转染后的第3，14天，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-¹，随后进行接种，1 mL/孔，培养24 h，随后饥饿12 h。参照说明书对蛋白进行收集。对蛋白样品依据BCA蛋白浓度检测法进行定量。清洗玻璃板，进行灌胶上样，并进行电泳，取50 μg收集的蛋白，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳跑胶分离。取纤维膜用半干式电印迹将蛋白进行转膜，室温封闭1 h，向其中添加转化生长因子β1、GAPDH一抗4 ℃过夜，次日洗膜，后添加二抗，1 h后再次进行上述温育及洗膜处理。ECL化学发光法暗室曝光。重复以上操作步骤3次。用Quantity one软件(北京航空航天大学)分析各条带，结果以目的蛋白条带与GAPDH的吸光度值比值表示其表达水平。

1.4.4 CM-Dil标记脂肪干细胞 将5 μL的CM-Dil及1 mL完全培养基加入到1.5 mL的EP管中，将其反复吹打直至混匀，得到CM-Dil标记液。当细胞贴壁浓度达90%时，将其中的培养液丢弃，用PBS反复进行冲洗，共计3次，吸去表面的液体，向其中添加上述配置液体，进行培养，20 min后将其中的液体丢弃，并添加5 mL的完全培养基，并进行温育，10 min后将其丢弃，再次向其中添加培养基，反复清洗2次。连续培养30 d，每天对标记效果和形态进行记录。

1.4.5 GP-APS腹腔注射建立免疫性血小板减少性紫癜模型及其实验分组

制备豚鼠抗小鼠血小板抗血清(GP-APS)：参照文献[2-4]方法，应用乙醚将BALB/C鼠麻醉，用摘除眼球法进行采血，添加抗凝剂EDTA-Na2(西安舟鼎生物技术有限责任公司)。离心进行血小板的分离并洗涤，向其中添加生理盐水对血小板浓度进行调整。将制备好的血小板分别与等量不完全弗氏佐剂(FICA)及完全弗氏佐剂(FCA)混合制成抗原，随后将含FCA的抗原在0周于豚鼠的背、腹、后足掌和腹股沟等至少4点进行皮下注射；将含FICA的抗原分别在第1，2，4周于豚鼠的上述部位进行注射。第5周时于心脏采血，不进行抗凝，1 500 r/min离心10 min，其上层液体即GP-APS。将其放在-20 ℃冰箱中待后续实验用。

建立血小板减少性紫癜模型：参考以住文献方法^[2-3]，将80只Balb/c小鼠进行血小板减少性紫癜模型的制作。将上述GP-APS取出，放在56 ℃条件下静置30 min。用生理盐水按1︰4比例将GP-APS进行稀释，以腹腔注射的方式于1，3，5，7，9，11，13 d向上述小鼠体内注射100 μL GP-APS稀释液，使血小板处于持续降低的状态，通过血常规检测血小板，血小板减少性紫癜模型制作成功。

分组干预：将制备好的血小板减少性紫癜模型小鼠80只随机平分为4组，每组20只。血小板减少性紫癜模型组：尾静脉注射生理盐水20 μL；脂肪干细胞组：尾静脉注射细胞浓度为2×10⁶ L^-¹的CM-Dil标记的脂肪干细胞20 μL；转化生长因子β1沉默组：尾静脉注射细胞浓度为2×10⁶ L^-¹的CM-Dil标记的转化生长因子β1沉默脂肪干细胞20 μL；泼尼松组：泼尼松5 mg/kg进行灌胃。均1次/d，连续治疗14 d后麻醉处死小鼠。

1.4.6 观察血小板、骨髓巨核细胞计数、比例变化

血小板变化情况：准备添加有EDTA-Na2抗凝剂的试管。将经不同方式干预14 d后的各组小鼠均处死，并经尾静脉进行取血，添加至上述试管中，使血液和EDTA-Na2充分进行混合，随后用BC-3000 Plus全自动血液分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)行血小板计数。

巨核细胞总数及分类：对干预14 d后小鼠的股骨进行分离，应用PBS对骨髓细胞进行冲洗，离心并制作图片标本，待自然风干，行瑞氏染色(瑞氏染色液、瑞氏缓冲液，温州市康泰生物技术有限公司)，应用光学显微镜观察巨核细胞总数并进行记录。

对小鼠的胸骨进行分离，将取得的胸髓添加至25 μL的小牛血清中，混匀，进行标本制作，风干，行瑞氏染色，光学显微镜对巨核细胞中产板巨核细胞形态的比例进行观察。

1.4.7 血清PAIgG水平及骨髓转化生长因子β1水平变化 实验结束时(各组干预治疗14 d后)，取血，添加抗凝剂，分离血清，并放于-20 ℃条件保存。ELISA法测定各组小鼠血清PAIgG与转化生长因子β1水平(ELISA Kit for Mouse PAIgG，上海西塘科技生物有限公司；ELISA Kit for Mouse 转化生长因子β1武汉博士德生物工程)。操作步骤如下：①加样：分别将配置好的标准品液、样本稀释液、待测样品添加到反应板，随后将其在37 ℃条件下放置120 min；②洗板：洗液进行冲洗5次，每次3 min；③添加一抗：向每孔中添加一抗(生物素化的抗小鼠PAIgG)100 μL。37 ℃孵育60 min；④洗板：同前；⑤添加二抗：每孔添加酶标抗体100 μL，37 ℃ 30 min；⑥洗板：同前；⑦添加终止液：每孔添加终止液100 μL，反应片刻。采用酶标仪(美国Bio-Rad公司)进行吸光度值的测定，计算PAIgG含量。

1.5 主要观察指标 各组CM-Dil标记的阳性细胞数目，血小板计数，产板型巨核细胞比例，骨髓巨核细胞总数、PAIgG及转化生长因子β1水平变化。

1.6 统计学分析 计量资料采用x(_)±s表示，采用SPSS 17.0进行数据分析，采用单因素方差分析进行不同组之间差异的比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来，干细胞治疗为血小板减少性紫癜的治疗带来了新的希望。其中，间充质干细胞是主要来源，在一定条件下能够向肌肉细胞、成骨细胞及脂肪细胞等分化^[5-7]。Zuk等^[8]于2001年从脂肪组织中分离出的脂肪干细胞，后经证实得出在特定的环境中，亦能够向多个方向分化^[9-10]。且脂肪干细胞等具有来源广泛、易于获取、对机体影响小等优点。

课题组以往研究从Balb/c小鼠双侧腹股沟处脂肪组织中获得的原代细胞进行流式细胞仪进行检测，结果发现细胞表面表达CD29、CD44均超过95%，仅有5%表达CD34，从而初步认定培养细胞为间充质干细胞。因此实验将转化生长因子β1基因沉默并经腺病毒转染至ADSC细胞，采用Western blot对干扰后的细胞进行观察发现，转化生长因子β1可出现持续的低表达，据此猜测移植经转化生长因子β1 转染的脂肪干细胞后，在诱导多向分化的同时，亦能够减低因自身免疫造成的破坏。对各组骨髓巨核细胞总数及比例进行比较，转化生长因子β1沉默组巨核细胞数明显下降，而产板比例明显升高，这说明给予血小板减少性紫癜小鼠转化生长因子β1沉默的脂肪干细胞干预后，通过促进骨髓巨核细胞分化，增加产板巨细胞形成，进而提升血小板数量，对血小板减少性紫癜小鼠进行治疗。由于血小板减少性紫癜为一种自身免疫性疾病，转化生长因子β1及PAIgG水平较健康人有所升高，实验用ELISA法对PAIgG及转化生长因子β1水平进行测定提示血小板减少性紫癜患者两者均升高，而经干预处理后水平明显下降。这说明转化生长因子β1基因沉默脂肪干细胞移植能有效降低血小板减少性紫癜小鼠转化生长因子β1及PAIgG值。

实验中采用免疫法造模的小鼠具有外周血小板减少、骨髓巨核细胞增多、产板巨核细胞减少等特点，与人类血小板减少性紫癜发病的临床特点相符^[11]，且实验复制的血小板减少性紫癜小鼠模型与文献报道的基本一致^[12]。有研究显示，利用免疫法造模初期(约3 d)呈现急性血小板减少性紫癜症状特点，血小板明显减少，血呈鲜红色(有严重的出血倾向)^[13]。随着造模时间的延长，出血程度减轻，血呈暗红色，与慢性血小板减少性紫癜症状基本一致，在造模14 d时停止注射抗血清后，血小板低水平维持的时间最长(72 h)，随着机体的免疫耐受维持时间逐渐缩短。随着造模时间的延长，2周后表现出明显的行动减少、精神萎靡等症状，因此实验选用2周后作为最佳观测时间。实验选用血小板减少性紫癜治疗的首选药物泼尼松作为对照。结果证实，转化生长因子β1沉默的脂肪干细胞对血小板减少性紫癜有良好的治疗效果。主要表现在：①能够提升血小板计数，降低PAIgG水平。血小板减少性紫癜发病的主要机制为自身抗体介导的血小板破坏增加，及血小板膜表面糖蛋白(GP)成为自身抗原，刺激机体产生特异性的自身抗体，通过其Fab段与自身抗原结合，使得与自身抗体相结合的血小板非常容易被内质网内皮系统清除，从而导致血小板减少^[14]。进一步研究发现，自身抗体还影响骨髓中巨核细胞的生成及成熟过程，抑制血小板的产生，而且血小板膜抗原特异性自身抗体检测的测定可作为血小板减少性紫癜的辅助诊断工具^[15-16]。因此，血小板数目和PAIgG能够作为血小板减少性紫癜重要的诊断依据和疗效评价指标。本研究发现，转化生长因子β1沉默脂肪干细胞能够提升血小板数并降低PAIgG水平，与模型组比较有明显差异，与既往研究结果相一致^[17-18]。由此推测其可能是通过清除体内的抗体并对抗外源性抗体，从而使体内的免疫复合物减少，来减轻血小板清除循环免疫复合物的负担，减少血小板被吞噬破坏的作用，从而起到提升血小板的作用。②能够促进骨髓巨核细胞的分化成熟。血小板减少性紫癜的骨髓象表现为巨核细胞数正常或升高，同时伴随产板巨核细胞数量的减少。实验中，转化生长因子β1沉默脂肪干细胞能够明显提升产板巨核细胞数，且疗效优于泼尼松，这提示转化生长因子β1沉默脂肪干细胞有促进血小板减少性紫癜小鼠骨髓巨核细胞向成熟方向分化的作用。

综上所述，对于血小板减少性紫癜的完美的治疗尽管仍存在困难，但通过实验发现转化生长因子β1沉默脂肪干细胞能够有效降低血小板减少性紫癜小鼠转化生长因子β1 及PAIgG水平，并能促进骨髓巨核细胞分化成熟，从而使外周血小板数明显提高，进而治疗血小板减少性紫癜，为临床该病的治疗提供了一种新的思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程