一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51.010

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (51): 7666-7671.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.51.010

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一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法

张作慧1，陈晨2，陈浩1，崔桂云1，花放1

1徐州医科大学附属医院神经内科，徐州医科大学神经病学教研室，江苏省徐州市 221002；2徐州医科大学附属医院神经外科，徐州医科大学神经外科学教研室，江苏省徐州市 221002

收稿日期:2016-11-04 出版日期:2016-12-09 发布日期:2016-12-09
通讯作者: 花放，教授，主任医师，徐州医科大学附属医院神经内科，江苏省徐州市 221002
作者简介:张作慧，女，1980年生，汉族，2014年南京大学毕业，博士，副主任医师，曾于美国NIA阿尔茨海默病研究中心(Sanders- Brown Center on Aging)接受博士后训练，主要从事阿尔茨海默病的临床及基础研究
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(81501095)；江苏省六大人才高峰资助项目(2014-WSN-034)

Isolation and culture of primary microvascular endothelial cells from mouse brains

Zhang Zuo-hui1, Chen Chen2, Chen Hao1, Cui Gui-yun1, Hua Fang1

1Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Department of Neurology of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China; 2Department of Neurosurgery, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Department of Neurosurgery of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China

Received:2016-11-04 Online:2016-12-09 Published:2016-12-09
Contact: Hua Fang, Professor, Chief physician, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Department of Neurology of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Zuo-hui, M.D., Associate chief physician, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Department of Neurology of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 81501095; the Six Talent Peak Project of Jiangsu Province, No. 2014-WSN-034

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人脑微血管内皮细胞：是血脑屏障的主要组成成分，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。大脑微血管内皮细胞与外周内皮细胞相比具有一些相同特性。
紧密连接：由分支状封闭索网络组成，每条封闭索独立于其他封闭索作用。因而，紧密连接防止离子通过的能力随封闭索的数目指数式增长。每条封闭索由一列嵌入两个原生质膜的跨膜蛋白构成，蛋白的胞外结构域使其彼此间一个个直接相联。尽管还有其他蛋白存在，两种主要类型的蛋白是密封蛋白和闭合蛋白，它们与位于细胞膜内侧的不同的把封闭索锚定到肌动蛋白细胞骨架的外周膜蛋白相联。因此，紧密连接连起了相邻细胞的细胞骨架。

摘要
背景：脑微血管内皮细胞是神经科学研究领域的重要工具细胞，如何获得高纯度的脑微血管内皮细胞一直是体外研究的关键和难点。
目的：探索一种简便易操作，高纯度的原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法。
方法：使用6-8周龄C57BL/6小鼠，经酶消化及梯度离心法获得微血管段，使用药物进一步纯化内皮细胞，利用CD31和GFAP免疫荧光染色鉴定内皮细胞纯度。使用Claudin-5免疫荧光染色鉴定紧密连接蛋白的表达情况。
结果与结论：①细胞呈旋涡状或铺路石样排列、生长；②免疫荧光显示内皮细胞纯度达99%以上，并广泛表达紧密连接蛋白；③结果表明，实验建立了一种简便、易操作的，可以获得大量高纯度的原代小鼠脑微血管内皮细胞的培养方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8486-4767(张作慧)

关键词: 组织构建, 血管内皮细胞, 脑微血管内皮细胞, 小鼠, 原代培养, 形态学, 细胞免疫荧光, CD31, Claudin-5, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Brain microvascular endothelial cells (BMECs) are important tools in the field of neuroscience research; therefore, how to obtain highly purified BMECs is a key and difficulty in vitro.
OBJECTIVE: To develop a simple method of isolating and culturing highly purified BMECs.
METHODS: C57BL/6 mice aged 6-8 weeks old were selected, and microvessels were obtained using enzyme digestion and gradient centrifugation. Further, endothelia cells were purified by certain drugs, followed by identified by CD31 and GFAP immunofluorescence staining. The expression of Claudin-5 was detected using immunofluorescence staining with anti-Claudin-5 antibody.
RESULTS AND CONCLUSION: Mouse BMECs grew and arranged in spiral or cobblestone-like. Immunofluorescence staining showed that the purity of BMECs reached above 99% and Claudin-5 was highly expressed. In conclusion, a simple method of easy accessibility is developed to obtain highly purified primary mouse BMECs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Endothelial Cells, Cells, Cultured, Fluoroimunoassay, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

张作慧，陈晨，陈浩，崔桂云，花放. 一种高纯度小鼠原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(51): 7666-7671.

Zhang Zuo-hui, Chen Chen, Chen Hao, Cui Gui-yun, Hua Fang. Isolation and culture of primary microvascular endothelial cells from mouse brains[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(51): 7666-7671.

图/表（结果） 2

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引言

脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障、血脑脊液屏障以及神经血管单元的重要组成部分。内皮细胞通过紧密连接，形成完整的内皮层，保护脑和脊髓不易受到内、外界环境中各种物理、化学因素的影响，而维持相对稳定的状态。内皮细胞可以表达多种转运体(Transporters)^[1-4]，如营养物质的转运体——葡萄糖转运体、氨基酸转运体和寡肽转运体等^[5-7]；药物的转运体——多药耐药蛋白等^[8-9]，这些转运体可以把药物或者大分子的营养物从内皮细胞的管腔侧或脑组织侧转移至另一侧，起到控制物质交换和药物代谢的作用。如转运体渗透性糖蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白1可以把β淀粉样蛋白从脑组织中转运至血液中^[10-16]；P-糖蛋白转运体把多种抗癫痫药物主动泵出脑组织是药物难治性癫痫的主要原因之一^[17-20]。因此，在多种神经系统疾病中，如阿尔茨海默病、脑血管淀粉样变性以及癫痫等疾病的研究领域中，内皮细胞的转运功能是研究热点。其次，内皮细胞还具有神经营养作用，可以分泌脑源性神经生长因子、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子，促进神经发生、增加突触可塑性、促进胶质细胞增生、神经修复^[21-23]。再次，内皮细胞还可以通过表达分泌细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子、单核细胞趋化蛋白，调节炎症反应^[24-27]。

因此，脑微血管内皮细胞在神经科学研究中，是一个重要的工具细胞。目前，对于原代脑微血管内皮细胞的分离培养，国内外通常采用酶消化法、筛网法结合免疫磁珠分选法或药物纯化法^[28-29]，但是一直存在纯度不高、产量低、操作步骤繁琐、费时、费力等问题。而不同种系来源的脑血管内皮细胞系，虽然容易获得，但由于其经过遗传改造，在某些生物学性状和表型上，有别于原代内皮细胞，无法完全模拟血脑屏障中内皮细胞的形态结构和功能。实验在总结借鉴现有原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法的基础上，探索出了一种简便易操作的高纯度、高产量原代脑微血管内皮细胞的分离培养方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点实验于2015年10至12月在徐州医科大学神经病学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：6只6-8周龄C57BL/6小鼠，雌雄各半，由徐州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2012-0001。

试剂和仪器：100x青-链霉素(Corning，30-004)；IMEM (Gibco，21056)；内皮细胞生长补充物(Millipore， 02-102)；谷氨酰胺(Lonza，17-605F)；抗坏血酸(Sigma，A4403)；肝素(Sigma，H3393)；木瓜蛋白酶(Worthington，LS003119)；乙二胺四乙酸二钠EDTA(Sigma，E5134)；β二巯基乙醇(Sigma， M3148)；L-半胱氨酸(Sigma，168149)；牛血清白蛋白(Fisher Scientific，9048-46-8)；鼠尾Ⅰ型胶原(Corning，354236)；嘌呤霉素(Thermo Fisher，A1113802)；0.05%胰蛋白酶(Corning，25-051)；多聚甲醛(Sigma， P6148)；大鼠源Anti-CD31抗体(Millipore，CBL1337)；兔源Anti-GFAP 抗体(Life technologies，180063)；兔源Anti-claudin-5(Abcam，ab15106)、Alexa Fluor488羊抗大鼠荧光二抗(Life technologies，A11006)；Alexa Fluor568羊抗大鼠荧光二抗(Life technologies，A11077)；Alexa Fluor488羊抗兔荧光二抗(Life technologies，A31566)；含DAPI的荧光封片剂(Vector，H-1200)；MTT(Sigma，M2128)；DMSO(Sigma，156914)；激光共聚焦显微镜(Olympus，FV-10i)。

1.4 实验方法

1.4.1 包被细胞培养板、配制内皮细胞培养基配制Ⅰ型胶原溶液(801 μL Ⅰ型鼠尾胶原、57 μL乙酸溶于50 mL PBS)，0.22 μm滤器过滤除菌。6孔板每孔加入1.5 mL Ⅰ型胶原溶液，37 ℃孵育2 h。使用前，用PBS冲洗培养板3次。

50 mL内皮细胞培养基：F12培养基44 mL，FBS 5 mL，100x青-链霉素500 μL，内皮细胞生长补充物1.5 mg，肝素250 U，抗坏血酸125 μg，谷氨酰胺500 μL。

1.4.2 激活木瓜蛋白酶由于木瓜蛋白酶的活性容易受氧化剂和重金属的抑制，因此，在使用木瓜蛋白酶之前，需要使用还原剂二巯基乙醇和重金属螯合剂EDTA将其完全激活。具体配制方法如下，25 mL木瓜蛋白酶激活溶液：含有青-链霉素的MEM 25 mL，BME 0.12 μL， L-半胱氨酸 15.145 mg，EDTA 10.235 mg。木瓜蛋白酶工作浓度为100 U/mL。使用前用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌。

1.4.3 脑微血管内皮细胞的分离培养用乙醇喷洒消毒C57BL/6小鼠头部，颈椎脱臼法处死小鼠，断头取脑，置于装有预冷的Hank’s液的10 cm培养皿中。余下步骤在生物安全柜中操作，以Hank’s液冲洗鼠脑3遍，用无菌刀片将脑组织切成小块，加入IMDM培养基，将脑组织混悬液转移至15 mL离心管中，1 200 r/min，离心5 min。弃去上清液，向脑组织中加入5 mL木瓜蛋白酶，混合均匀后，放入37 ℃培养箱中，孵育70 min。孵育结束后，将脑组织混悬液转移至10 cm培养皿中，先以19号针头对组织进行匀浆研磨5-7次，然后再以21号针头进一步研磨。注意在每一次研磨操作时，确保将组织完全吸入注射器，然后再完全挤出，以避免组织研磨不均和研磨过度。研磨后，组织悬液呈粉红色匀浆。将脑组织匀浆转移至15 mL离心管中，再加入22%BSA，混合均匀。 2 600 r/min，离心10 min。离心后，离心管上部的粉黄色部分为髓鞘组织，而微血管段和分离的细胞位于离心管底部，中层为BSA。倾斜离心管，小心吸出髓鞘组织和中层的BSA。以1 mL ECGM重悬微血管段和细胞，将其转移至15 mL离心管中，加入1 mL ECGM，1 200 r/min离心洗涤5 min。重复洗涤1次。加入8 mL ECGM重悬细胞，接种于预先使用Ⅰ型胶原包被过的细胞培养板中，每孔2 mL。第2天，使用F12冲洗细胞3-6次，以除去组织和细胞碎片，加入ECGM培养基继续培养。

1.4.4 脑微血管内皮细胞的纯化第2天光镜下观察细胞贴壁良好，加入嘌呤霉素，使其终浓度分别为2 mg/L和4 mg/L，保留嘌呤霉素60 h，然后更换为常规ECGM培养基。

1.4.5 脑微血管内皮细胞纯度鉴定血管内皮细胞在分离培养的过程中，容易混杂有星形胶质细胞。因此使用免疫荧光检测内皮细胞标志物CD31以及星形胶质细胞标志物GFAP，来鉴定原代细胞培养中内皮细胞的纯度。高压灭菌细胞爬片，置于24孔培养板中，Ⅰ型胶原包被爬片37 ℃孵育2 h，PBS洗涤3次，将原代细胞以5×10⁴/孔的浓度接种于爬片上。培养2 d后，吸尽培养基，PBS冲洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定5 min。PBS洗3次，每次5 min。以含有0.1%Triton、5%BSA的PBS室温封闭1 h，以含有0.05% Triton、2.5%BSA的PBS稀释一抗anti-CD31抗体、anti-GFAP，抗体稀释浓度1∶250，加于玻片上，4 ℃过夜。第2天，以PBS洗3遍，每遍5min。以含有0.05% Triton、2.5%BSA的PBS稀释荧光二抗，二抗稀释浓度1∶500，加于玻片上，室温避光孵育1 h。PBS洗3遍，每遍5 min。在载玻片上滴加20 μL 含有DAPI的荧光封片剂，小心夹出细胞爬片，倒扣于载玻片上。荧光显微镜下观察。

1.4.6 脑微血管内皮细胞紧密连接蛋白鉴定内皮细胞表达紧密连接是构成完整血脑屏障的前提，因此，实验使用细胞免疫荧光检测紧密连接蛋白Claudin-5的表达。在细胞长满培养器皿底部的80%-90%时，使用一抗anti-Claudin-5(稀释浓度为1∶200)，Alexa Fluor 488羊抗兔荧光二抗(稀释浓度为1∶500)鉴定细胞紧密连接的表达。

1.4.7 MTT法监测细胞生长增殖速度取P3代的脑微血管内皮细胞接种于96孔板，细胞密度为每孔5 000个细胞，每隔24h，选取3孔细胞，测定细胞活力。每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，37 ℃孵育4 h，吸取培养基，加入100 μL DMSO振荡10 min，于490 nm检测各孔的吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①光镜下细胞形态；②细胞纯度鉴定；③紧密连接鉴定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

由于培养方法复杂、纯度低、产量少，原代脑血管内皮细胞的分离培养一直是一个制约体外实验的关键因素。实验采用的分离培养方法，操作步骤相对简单，所获得的原代脑血管内皮细胞纯度高、生长增殖能力强，且广泛表达紧密连接蛋白，具有良好的屏障功能。

实验方案中的几点注意事项：①动物年龄的选择：实验选择的是6-8周的小鼠，作者曾尝试选用月龄较大的小鼠，发现其细胞增殖活力相对下降，细胞在体外生长、增殖缓慢。亦尝试使用新生鼠，其增殖活力和6-8周的相似，但因其脑体积相对较小，获得细胞数相对较少。②细胞冲洗的时机：细胞接种于培养板后，细胞及血管段逐渐贴壁，但是仍有部分组织和细胞碎片悬浮于培养液中，这些不能贴壁的细胞和组织将趋于死亡、崩解，释放一些酶类以及炎性产物，损伤存活细胞。因此适时将其清除，有利于维持良好的细胞生长环境。但若冲洗过早，将会丢失未贴壁的内皮细胞和微血管段。本实验观察发现，在细胞培养的第２天内皮细胞和微血管段已经基本贴壁，因此培养次日进行细胞冲洗。③吹打研磨：在使用不同口径的注射器针头进行研磨、匀浆时，需避免吹打、匀浆过度，以降低细胞产量。④实验中使用22%BSA的目的为替代Percoll离心分离内皮细胞，简便、快捷、易操作。⑤嘌呤霉素的浓度和时间：嘌呤霉素具有抑制蛋白质合成的作用，内皮细胞因表达多耐药蛋白1(Multidrug resistance protein，MDR1)，可以有效地将嘌呤霉素泵出细胞外，得以存活生长。其他细胞会因嘌呤霉素的抑制蛋白质合成作用，而逐渐死亡，因此，在细胞培养基中添加嘌呤霉素，起到纯化内皮细胞的作用。以往文献中多采用4 mg/L的浓度^[30]，本实验中观察到此浓度的嘌呤霉素可以纯化内皮细胞，但是会影响内皮细胞的增殖活力，导致细胞增殖缓慢、产量下降。而2 mg/L的嘌呤霉素对内皮细胞的纯化能力与 4 mg/L嘌呤霉素相当，但对细胞的增殖活力影响较小。其次，嘌呤霉素的加入时机也至关重要。本实验曾尝试在P1代(第１次传代后的细胞)细胞中加入嘌呤霉素，结果发现，所有细胞均漂浮死亡。这提示原代内皮细胞在体外培养的过程中，MDR1表达降低^[31]。

本文提供了一种分离培养脑微血管内皮细胞的方法，步骤详尽、可操作性强、重复性好，为更好的建立、模拟体外血脑屏障模型打下良好的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Isolation and culture of primary microvascular endothelial cells from mouse brains

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