Fe3O4纳米粒子的组织相容性及组织分布研究

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.52.017

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文题释义：
Fe₃O₄纳米粒子：Fe₃O₄纳米粒子表面偶联亲水性材料(如聚乙二醇，聚氧乙烯，聚山梨酯80，西曲溴铵，泊洛沙姆，油酸钠等)进行修饰便于偶联化疗药物，同时可形成一层动态的亲水性物，以抵制血浆蛋白的结合。静脉注射后不易被单核巨噬细胞系统识别吞噬，可在血液循环系统中维持较长半衰期，使药物有选择性地渗入病灶，能够直接靶向于单核巨噬细胞系统之外的大多数肿瘤。
靶向：对特定目标(分子、细胞、个体等)采取的行动。如外源基因在宿主细胞基因组DNA预期位置上的定向插入；药物分子对效应靶组织或细胞的定向传送或作用。

背景：Fe₃O₄纳米粒子是目前研究较多的靶向性纳米药物递呈系统，它可与抗肿瘤药物结合在一起，在外界磁场作用下，运载抗肿瘤药物靶向性到达肿瘤部位发挥抗肿瘤作用，其亚微粒可以到达远离磁源数厘米的肿瘤部位。
目的：分析Fe₃O₄纳米粒子的组织相容性及在机体内的药物分布，及其在骨肉瘤化疗中作为药物载体的应用前景和存在问题。
方法：使用Wistar大鼠，按10.0 mg/kg剂量，Fe₃O₄纳米粒子经鼠尾静脉推注后15，60，120 min处死，取各组织(肺、脑、心、肝脏、肾脏、后肢骨、骨骼肌)，采用原子吸收光谱仪分析各组织单位质量的铁离子含量。将各时间点的各种组织作苏木精-伊红染色以观察组织形态变化。
结果与结论：①在肝和肾组织Fe₃O₄纳米粒子浓度于15 min时达到峰值，给药后60 min和120 min检测到的肝和肾组织纳米粒子浓度虽呈下降趋势但仍然维持在较高水平，3个时间点Fe₃O₄纳米粒子浓度与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，提示Fe₃O₄纳米粒子在肝和肾中快速浓集并能较长时间存留；②在心、肺、骨骼肌和骨组织中Fe₃O₄纳米粒子浓度于15 min时达到峰值，但随后迅速下降。15 min时Fe₃O₄纳米粒子浓度与对照组比较差异有显著性意义 (P < 0.05)，仅在骨组织代谢较慢，在60 min时与对照组比较差异仍有显著性意义 (P < 0.05)，表明Fe3O4纳米粒子在这些血流灌注高的组织中虽能达到高浓度但存留时间短。唯有骨组织可以较长时间的维持Fe₃O₄纳米粒子的高浓度；③在脑组织中各时间点Fe₃O₄纳米粒子浓度与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，提示Wistar大鼠的血脑屏障可能对Fe₃O₄纳米粒子的穿透具有阻碍作用；④所有的组织通过苏木精-伊红染色后均未发现明显的改变；⑤结果表明，偶联油酸钠Fe₃O₄纳米粒子在机体组织中的分布受组织血流灌注和单核巨噬细胞系统的影响，且不能穿透血脑屏障。对各种组织均未发现有显著的影响。偶联油酸钠Fe₃O₄纳米粒子在肝、肾和骨组织内可以维持较长较高浓度，作为磁靶向热化疗载体治疗上述脏器的恶性肿瘤有重要的理论意义。

ORCID: 0000-0003-1534-8600(龚君佐)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 材料相容性, Fe₃O₄纳米粒子, 组织相容性, 化疗

Abstract:

BACKGROUND: Ferroferric oxide (Fe₃O₄) nanoparticles are a research hotspot in drug delivery system, which can transport antineoplastic drugs to the lesion under external magnetic field. Additionally, its submicrons even can reach the tumor site several centimeters far away from the magnetic source.
OBJECTIVE: To investigate the histocompatibility and in vivo distribution of Fe₃O₄ nanoparticles and to explore its application prospect and limitations as a drug carrier in the chemotherapy of osteosarcoma.
METHODS: 10.0 mg/kg Fe₃O₄ nanoparticles were administrated into Wistar rats via tail vein, then the rats were executed at 15, 60 and 120 minutes, respectively, and the rat lung, brain, heart, liver, kidney, hind limb and skeletal muscle were removed. The ferric ion content in each tissue was determined by atomic absorption spectrometer, and the morphological changes of different tissues were observed by hematoxylin-eosin staining at each time point.
RESULTS AND CONCLUSION: After administrated for 15 minutes, the concentration of Fe₃O₄ nanoparticles in the liver and kidney reached peak, followed by a decrease at 60 and 120 minutes, but still remained a high level. The concentration of Fe₃O₄ nanoparticles at three time points showed significant difference compared with the control group (P < 0.05), demonstrating that the nanoparticles can be quickly enriched and long-term persistent in the liver and kidney. After administrated for 15 minutes, the concentration of Fe₃O₄ nanoparticles in the heart, lung, skeletal muscle and bone reached peak, which had significant difference compared with the control group (P < 0.05), and significantly decreased subsequently except that in the bone. This significant difference still displayed at 60 minutes between groups (P < 0.05), indicating that the nanoparticle can reach a high concentration but persist short time in the high blood perfused tissues. Compared with the control group, the concentration of Fe₃O₄ nanoparticles in the brain tissue showed no significant difference at each time point (P > 0.05), suggesting that the blood-brain barrier can inhibit the nanoparticle penetration. No overt morphological changes were found in each tissue after hematoxylin-eosin staining. In conclusion, the distribution of Fe₃O₄ nanoparticles conjugate sodium oleate in organism is influenced by the blood perfusion and mononuclear phagocyte system, and they cannot penetrate the blood-brain barrier and make no significant effect on tissues, but maintain a high level in the liver kidney and bone for a long-term, thus providing a theoretical basis for the drug delivery system in the magenetic hyperthermia therapy of malignant tumors.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Ferrosoferric Oxide, Nanoparticles, Histocompatible Materials, Drug Therapy, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

龚君佐，屠重棋，段宏，周绍兵. Fe₃O₄纳米粒子的组织相容性及组织分布研究[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(52): 7872-7877.

Gong Jun-zuo1, Tu Zhong-qi2, Duan Hong2, Zhou Shao-bing3. Histocompatibility and distribution of ferroferric oxide nanoparticles

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(52): 7872-7877.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠16只，分为4组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 铁元素在Wistar大鼠各脏器的动态分布见表1，图1。

2.3 Fe₃O₄纳米粒子经鼠尾静脉推注后各组织形态学观察

2.3.1 肝在肝组织切片中，肝中央静脉均清晰可见，肝细胞以中央静脉为中心，向周围呈放射状排列；肝细胞的胞质均被苏木精染成蓝紫色，并有散在大小不等的颗粒淡红色物质，细胞核呈椭圆形，位居中央，着色浅，核仁明显。部分肝细胞可见双核(见图2)。

2.3.2 肾在肾组织切片中，可见许多弯曲的小管，肾小球均清晰可见，呈球形，细胞核较小，染色深(图3)。

2.3.3 肺在肺组织切片中，肺的终末细支气管或呼吸性细支气管均清晰可见，其内的单层柱状纤维上皮可见，肺泡为多面体形，肺泡壁由单层肺泡上皮组成。相邻肺泡间有少量结缔组织(图4)。

2.3.4 心肌在心肌组织切片中，心肌纤维均呈短圆柱状，有分支相互连接成网，闰盘清晰可见，细胞核呈卵圆形，位居中央，多为单核，可见少量双核(图5)。

2.3.5 脑在脑组织切片中，可见锥体细胞，颗粒细胞和梭形细胞成层排列，其间可见少量毛细血管。细胞形态相比未见变化(图6)。

2.3.6 骨骼肌在骨骼肌组织切片中，骨骼肌细胞内可见多个细胞核，呈扁椭圆形，染色较浅，均位于肌膜下方；细胞质丰富；细胞内可见大量与长径平行排列的肌原纤维，呈细丝状，在横切面上呈点状(图7)。

2.3.7 骨在骨组织切片中，骨陷窝清晰可见，其中可见骨细胞，其细胞质呈弱碱性，骨胶纤维规律排列，并可见分支(图8)。

2.4 铁在wistar大鼠各脏器含量 ①在肝和肾组织Fe₃O₄纳米粒子浓度在15 min达到峰值，给药后60 min和120 min检测到的肝和肾组织纳米粒子浓度虽呈下降趋势但仍然维持在较高水平，3个时间点Fe₃O₄纳米粒子浓度与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，提示纳米粒子在肝和肾中快速浓集并能较长时间存留；②在心、肺、骨骼肌、骨组织中Fe₃O₄纳米粒子浓度在15 min也迅速达到峰值，但随后显著下降，15 min时Fe₃O₄纳米粒子浓度与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，仅在骨组织代谢较慢，在60 min时对照组比较仍有显著性差异(P < 0.05)，心、肺、骨骼肌等组织于60 min、120 min和骨组织于120 min与空白对照组比较差异无显著性意义，表明Fe₃O₄纳米粒子在这些血流灌注高的组织中虽能达到高浓度但存留时间短；③在脑组织中各时间点Fe₃O₄纳米粒子浓度与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，提示Wistar大鼠的血脑屏障可能对Fe₃O₄纳米粒子的穿透具有阻碍作用。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10至12月在华西医学中心移植免疫实验室和组织工程实验室内完成，其中在移植免疫实验室完成动物实验，切片及组织形态学观察在组织工程实验室内完成。

1.3 材料

1.3.1 Fe₃O₄纳米粒子偶联油酸钠Fe₃O₄纳米粒子，相对分子质量536，粒子直径均为为20-30 nm，由西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室提供。

1.3.2 实验动物 Wistar大鼠16只，雌雄各半，鼠龄七八周，体质量(200±30) g。由四川大学华西医学中心动物实验中心提供。

1.3.3 主要仪器超声乳化仪(BRANSON 3510，美国Branson公司)；康氏震荡器(恒温水浴HES-H，金坛市城东科辉仪器厂)；电子天平(LS200，OHAUS公司)；高温炉(KAX-5-12A，中国上海科析实验仪器厂)；原子吸收光谱仪(AA-7003，北京东西分析仪器有限公司)；石蜡组织切片机(202ALLL型，美国Leica公司)；荧光生物显微镜 (E600 Nikon公司)；照相机(dxm1200型，Nikon公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 ①实验组：按各时相点(经鼠尾静脉给药后15 min、60 min、120 min时间点)Wistar大鼠随机被分为3组，每组4只，共12只，雌雄各半；②对照组4只，雌雄各半，不给任何药物。

1.4.2 实验步骤 ①使用生理盐水500 mL，加入偶联油酸钠Fe₃O₄纳米粒子250 mg，使用超声乳化仪乳化溶解后配制成浓度为0.5 g/L的胶体溶液，再使用针孔式过滤头过滤做灭菌处理；②Wistar大鼠实验前禁食12 h，称质量后按10.0 mg/kg剂量，使用偶联油酸钠Fe₃0₄纳米粒子经Wistar大鼠尾静脉推注；③于推注Fe₃0₄纳米粒子后15，60，120 min处死，解剖，取各组织标本(肺、脑、心、肝脏、肾脏、后肢骨和后肢骨骼肌)。组织用生理盐水冲净表面血液和内容物，滤纸吸干后使用电子天平称质量并记录组织质量，-20 ℃保存；④将一部分标本进行烘干后在750 ℃下高温灰化，灰化后用体积分数37% HCl 3 mL溶解灰分后定容至25 mL，再采用原子吸收光谱仪在温度17 ℃，相对湿度71%条件下分析各组织单位质量的铁离子含量(检测标准GB/T15337-94, 检测方法为空气荧光火焰法，最低检出限为0.01 μg/g)；⑤将另一部分样本使用10%甲醛固定，再使用二甲苯和梯度乙醇脱水和透明后，用熔化的石蜡浸透、包埋。用石蜡组织切片机切成5-10 μm厚的组织切片，贴于载玻片上，再用苏木精和伊红染色后用二甲苯和梯度乙醇脱水和透明，用树胶和盖玻片封固。用荧光生物显微镜观察和照相；⑥取空白对照组的Wistar大鼠，禁食12 h后不给任何药物处死。以下处理同实验组。

1.5 主要观察指标 ①铁元素在Wistar大鼠各脏器的动态分布；②Fe₃O₄纳米粒子经鼠尾静脉推注后各组织形态学观察；③铁在Wistar大鼠各脏器含量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨肉瘤是最常见的恶性原发性骨肿瘤，预后较差。近25年来，随着新辅助化疗广泛应用，骨肉瘤的5年生存率虽已达60%^[6]，但是治疗效果仍然令人不满意，甚至有学者认为尽管新辅助化疗对于骨肉瘤的保肢手术有明显的疗效，但尚无证据表明可以改善或延长患者的生存时间^[7]，加大给药剂量又使患者发生毒副作用的风险增大。种种原因促使学者们致力于寻找新的化疗方法以改善治疗效果。药物的磁靶向治疗是近年来医学研究的热点，体现了医学界所追求的高效低毒甚至无毒的目标^[8-9]。

纳米技术是当今极具活力、极具前途的研究领域；随着纳米粒子与恶性肿瘤的治疗相结合的不断深入，越来越多的纳米粒子将被应用于恶性肿瘤诊断和治疗的研究中。但纳米技术治疗恶性肿瘤的研究目前还处于初始阶段，诸如纳米粒子在体内的降解性、组织相容性、毒性、靶向性、不同药物纳米颗粒的制备、靶向物质与药物载体结合的稳定性等问题都在进一步深入研究中^[10-11]。Fe₃O₄纳米粒子是目前研究较多的靶向性纳米药物递呈系统，它可与抗肿瘤药物结合在一起，在外界磁场作用下，运载抗肿瘤药物靶向性到达肿瘤部位发挥抗肿瘤作用，其亚微粒可以到达远离磁源数厘米的肿瘤部位^[12]。并且Fe₃O₄纳米粒子表面偶联亲水性材料(如聚乙二醇，聚氧乙烯，聚山梨酯80，西曲溴铵，泊洛沙姆，油酸钠等)进行修饰便于偶联化疗药物，同时可形成一层动态的亲水性物，以抵制血浆蛋白的结合。静脉注射后不易被单核巨噬细胞系统识别吞噬，可在血液循环系统中维持较长半衰期，使药物有选择性地渗入病灶，能够直接靶向于单核巨噬细胞系统之外的大多数肿瘤^[13]。油酸钠因为其性质稳定、生物相容性良好而在生物医药中作为表面活性剂而广泛使用^[14]。

动物实验表明，从Wistar大鼠尾静脉注射偶联油酸钠Fe₃O₄纳米粒子后不同时相点和对照组的苏木精-伊红染色图像未发现肝、肾、心、肺、脑、骨骼肌、后肢骨等组织有明显的改变^[15-16]，说明了油酸钠Fe₃O₄纳米粒子的生物相容性良好。

Fe₃O₄纳米粒子在体内的浓度分布从高到低依次为：肝、骨、肾、心、肺和骨骼肌，在脑组织中未见明显的分布。主要是肝脏和骨等是网状内皮细胞和吞噬细胞较多的脏器，推测这可能和Fe₃O₄进入机体体内被网状内皮细胞和吞噬细胞吞噬有关。同时也表明Fe₃O₄纳米粒子的分布受组织的血流动力学的影响，但不能穿透血脑屏障。

结论：结果表明，偶联油酸钠Fe₃O₄纳米粒子在机体组织中的分布受单核巨噬细胞系统和组织血流灌注的影响，在肝、肾和骨组织内可以维持较长较高浓度，且不能穿透血脑屏障。主要脏器的病理检查亦未见明显改变，表明其生物相容性良好。对肝、肾和骨组织恶性肿瘤的治疗作为磁靶向载体有重要的理论意义。

药物的靶向治疗是近年来医学研究的热点，体现了医学界所追求的高效低毒甚至无毒的目标。用磁流体载附药物的方法也越来越受到人们的重视。寻求一种载药率高，生物相容性好、安全性高的磁性物质也就成了医务工作者的目标。实验表明偶联油酸钠Fe₃O₄纳米粒子生物相容性较好，急性毒性低，可考虑作为载附药物的基质。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Histocompatibility and distribution of ferroferric oxide nanoparticles

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