聚四氟乙烯人工血管对血小板聚集的影响及细胞相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.010

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (47): 7064-7069.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.010

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聚四氟乙烯人工血管对血小板聚集的影响及细胞相容性

姜正明，陈魁，胡彩娜

郑州大学第一附属医院心血管内科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2016-08-22 出版日期:2016-11-18 发布日期:2016-11-18
通讯作者: 胡彩娜，郑州大学第一附属医院心血管内科，河南省郑州市 450000
作者简介:姜正明，男，1978年生，湖北省武汉市人，汉族，硕士，主治医师，主要从事心血管病介入及起搏治疗研究。
基金资助:
河南省教育厅项目(142300410356)

Effect of polytetrafluoroethylene artificial blood vessels on platelet aggregation and its cytocompatibility

Jiang Zheng-ming, Chen Kui, Hu Cai-na

Department of Cardiovasology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2016-08-22 Online:2016-11-18 Published:2016-11-18
Contact: Hu Cai-na, Department of Cardiovasology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Jiang Zheng-ming, Master, Attending physician, Department of Cardiovasology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
the Project of Henan Province Department of Education, No. 142300410356

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人工血管：是许多严重狭窄或闭塞性血管的替代品，多是以尼龙、涤纶、聚四氟乙稀等合成材料人工制造的，适用于全身各处的血管转流术，大、中口径人工血管应用于临床已取得满意的效果。
复钙时间：即血浆再钙化时间，是去掉钙的血浆中重新加入钙，使内源性凝血过程重现，标本与正常对照相差大于正常对照的40%，即可认为异常，是测定内源凝血系统缺陷的一种实验检查。用草酸钠抗凝的血浆，使抗凝剂与血浆中的钙离子结合而凝血过程中断，这种血浆加入适当的钙溶液后，血液的凝固过程则继续进行钙化。正常人血浆再钙化时间在3 min以内。

背景：聚四氟乙烯人工血管是临床常用的医用材料，但其具体的基础研究内容尚未完善。
目的：观察聚四氟乙烯人工血管对血小板聚集的作用及细胞相容性。
方法：①对血小板聚集的作用：检测聚四氟乙烯人工血管的凝血时间、复钙时间。将生理盐水、蒸馏水及聚四氟乙烯人工血管分别加入兔红细胞悬液中，计算溶血率；②细胞生物相容性：将SD大鼠原代心肌细胞分别接种于普通玻璃爬片与聚四氟乙烯人工血管片上，3 d后，检测细胞乳酸脱氢酶释放；5 d后，检测细胞增殖。
结果与结论：①聚四氟乙烯人工血管对兔血的动态凝血时间、复钙时间没有影响；聚四氟乙烯人工血管的溶血率为2.3%；②与接种于普通玻璃爬片上的心肌细胞相比，接种于聚四氟乙烯人工血管片上的心肌细胞增殖及乳酸脱氢酶释放无明显变化；③结果表明，聚四氟乙烯人工血管血小板聚集无影响，具有良好的血液相容性与细胞相容性。

ORCID: 0000-0003-3597-0296(姜正明)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 聚四氟乙烯, 人工血管, 血小板聚集, 溶血实验, 复钙时间, 大鼠心肌细胞, 乳酸脱氢酶

Abstract:

BACKGROUND: Polytetrafluoroethylene artificial blood vessels have been extensively used in clinic. However, there is still a lack of basic study on it.
OBJECTIVE: To observe the effect of polytetrafluoroethylene artificial blood vessels on platelet aggregation and its cytocompatibility.
METHODS: Effect on platelet aggregation: Dynamic platelet clotting time and plasma recalcification time were detected. Normal saline, distilled water and polytetrafluoroethylene artificial blood vessels were added into the rabbit red cell suspensions, respectively, to count the hemolysis ratio. Cytocompatibility: Primary myocardial cells from Sprague-Dawley rats were respectively seeded onto the common round coverslip and polytetrafluoroethylene artificial blood vessels, and the lactate deshydrogenase release and cell proliferation were detected at 3 and 5 days, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Polytetrafluoroethylene artificial blood vessels made no effects on the platelet clotting time and plasma recalcification time and 2.3% hemolysis ratio was observed. Compared with the common round coverslip, the myocardial cell proliferation and lactate deshydrogenase release showed no significant changes on the polytetrafluoroethylene artificial blood vessels. These results suggest that the polytetrafluoroethylene artificial blood vessel makes no effect on platelet aggregation and holds good hemocompatibility and cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Polytetrafluoroethylene, Blood Vessels Prosthesis, Platelet Aggregation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

姜正明，陈魁，胡彩娜. 聚四氟乙烯人工血管对血小板聚集的影响及细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(47): 7064-7069.

Jiang Zheng-ming, Chen Kui, Hu Cai-na.

Effect of polytetrafluoroethylene artificial blood vessels on platelet aggregation and its cytocompatibility

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(47): 7064-7069.

图/表（结果） 2

2.1 聚四氟乙烯人工血管对血小板聚集作用的影响

2.1.1 动态凝血时间实验结果实验组各个时间的吸光度值与对照组相比无差异，说明聚四氟乙烯材料没有明显促进动态凝血的作用，见表1。

2.1.2 复钙时间实验结果实验组的复钙时间为(513.93±41.20) s，对照组复钙时间为(499±44.38) s，两组间复钙时间比较无差异，说明聚四氟乙烯材料对正常血液的复钙时间无影响。

2.1.3 溶血实验结果实验组的吸光度值为0.057 3± 0.007 8，阳性对照组的吸光度值为0.653 8±0.083 6，阴性对照组的吸光度值为0.027 6±0.003 8。按照公式计算可得聚四氟乙烯材料的溶血率为2.3%，符合溶血率<5%的要求，说明聚四氟乙烯材料不会对正常血液产生溶血。

2.2 聚四氟乙烯人工血管与大鼠心肌细胞的生物相容性分析

2.2.1 体外分离培养的成熟大鼠心肌细胞细胞呈现长棒状，细胞生长相对稀疏，生长相对缓慢，见图1，实验过程中需要加入青链霉素以避免污染。

2.2.2 聚四氟乙烯材料对心肌细胞增殖的影响聚四氟乙烯人工血管组细胞量为378 000±110，硅硼酸盐细胞爬片组为383 000±50，两组间细胞量比较差异无显著性意义，说明聚四氟乙烯材料对大鼠心肌细胞增殖无明显影响。

2.2.3 聚四氟乙烯材料对心肌细胞乳酸脱氢酶释放的影响聚四氟乙烯人工血管组乳酸脱氢酶释放量为(121.84±14.47) U/L，硅硼酸盐细胞爬片组乳酸脱氢酶释放量为(125.73±12.35) U/L，两组间乳酸脱氢酶释放量比较差异无显著性意义，说明聚四氟乙烯材料对大鼠心肌细胞无明显毒性。

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引言

改革开放以来，中国国民生活水平不断提高，各类型饮食满足了人们的日常生活，同时也让心血管疾病的发病率显著提高^[1-2]，青少年也是如此^[3]。此外，人口老龄化的进程，也加速了中国心血管疾病的出现^[4-5]。心血管疾病已经成为中国的“第一杀手”。血管移植是治疗血管类疾病的重要手段之一，通常使用自体移植的方法，但自体血管的量有限很难满足临床需求，人造血管就成为了重要的代替品^[6-8]。

国外绝大多数研究采取医用高分子材料编织人工血管。中国在20世纪50年代末60年代初才开始进行相关研究，起初是用尼龙织成，后因尼龙降解，在生体内置入后发生破裂而被淘汰，现在多采用聚四氟乙烯人工血管，但其具体的基础研究内容尚未完善。

心肌细胞是心血管相关疾病研究的重要细胞之一，由于心肌细胞是一种高分化的细胞，分离难度较高，暂无使用该类型细胞进行材料相容性分析的实验^[9-11]。为得到具有较好分离增殖能力的心肌细胞，实验多采用乳鼠进行分离，但乳鼠心肌细胞与成年大鼠的心肌细胞相比，其本身的功能与结构都存在着极大差异^[12]。实验为模拟心血管疾病发生人群特性，采用成年SD大鼠作为细胞来源，进行实验。聚四氟乙烯人工血管是临床较为常用的几类人工血管的材料之一，作为一种较好的大动脉血管代替材料，早在20世纪50年代，该类型血管就已被应用于临床^[13-15]。

实验通过原代分离技术得到高质量的成熟SD大鼠心肌细胞，研究临床常用的聚四氟乙烯血管对血小板聚集的影响及对大鼠心肌细胞相容性，完善心肌细胞与该类型材料的基础研究部分。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机分组观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2014年11月至2015年9月在郑州大学实验中心进行。

1.3 材料

实验动物：七八周龄SPF雄性SD大鼠10只，体质量(200±20) g，用于分离培养原代心肌细胞；2 kg清洁级雄性新西兰兔1只，用于分离血液进行血小板聚集实验，均采购于河南省实验动物中心，合格证书号为：SYXK(豫)2005-0012，购回后在郑州大学实验中心于(25±2)℃、湿度(50±5)%下适应性喂养1周。整个过程对动物的处置均符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

主要试剂及设备：DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶(美国sigma公司)；胎牛血清(天津四季生物研究所)；PBS(广州赛业生物技术有限公司)；青霉素、链霉素(沈阳东药集团公司)；肝素钠(Sigma)；硅硼酸盐细胞爬片、聚四氟乙烯人工血管及相关材料(德国贝朗医疗公司)；乳酸脱氢酶测试试剂盒(南京建成)；纯水仪(MILIPORE 公司)；电子天平(Mettler Toledo公司)，20，4 ℃冰箱(海尔)；电热恒温水槽(上海精宏公司)；微量加样器(Eppendorf 公司)；电热干燥箱(上海医疗器械总厂)；微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；手揿计数器(绍兴市医疗器械一厂)；TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)；pH计(美国Thermo Fisher公司)；超净工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司)；37 ℃恒温CO₂孵箱(德国Heraeus公司)；冻存管、培养瓶、培养板(美国Corning公司)；血球计数板(浙江玉环县求精医用仪器厂)，磁力搅拌器(常州国华)。

1.4 实验方法

1.4.1 聚四氟乙烯材料对血小板聚集的影响

新西兰兔血液处理：取2 kg新西兰兔，使用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉后，固定于兔子固定器上，头朝上。于兔颈部正中处切口，钝性分离肌肉组织，找到气管后于气管偏下方分离兔颈总动脉。使用动脉止血夹加紧兔心脏近心端，以0号线结扎远心端。于2个位置之间插入肝素钠浸泡后的动脉导血管，使用手术线固定后，放开近心端动脉止血夹，收集兔血。收集完成后，迅速加入枸橼酸钠，缓慢搅拌，混匀血液，以制备脱纤维兔血，用于实验。

动态凝血时间实验：实验组将购买的聚四氟乙烯人工血管剪成小条装，约为0.5 cm×0.5 cm，置于试管内，加入生理盐水；对照组试管内加入等体积的生理盐水，于37 ℃水浴锅内温浴30 min，温浴期间使用保鲜膜封口，保持无菌状态。于超净工作台内分别加入0.5 mL无菌脱纤维兔血，37 ℃水浴恒温10 min。加入配置好的0.2 mol/L的CaCl₂溶液40 µL后开始计时，分别于实验开始的5，10，20，40，60，80 min取出试管，加入50 mL灭菌蒸馏水。离心去上清于540 nm处测定其吸光度并记录数据，实验重复3次，取平均值。

复钙时间实验：取新鲜制备的脱纤维兔血，离心后去上清液备用。将聚四氟乙烯材料剪成小条装，约为 0.5 cm×0.5 cm，共准备10份同样大小的血管条，实验于无菌环境的超净台内操作。

实验组将处理好的人工血管置于足够量的37 ℃恒温生理盐水中(生理盐水没过材料即可)浸泡过夜；对照组仅加入等量生理盐水。第2天，分别加入0.5 mL准备好的血液上清液，于37 ℃水浴中温浴5 min。加入适量体积的CaCl₂溶液使得液体终浓度为0.002 5 mmol/L。记录试管中出现白色絮状物或者白色沉淀的时间，实验平行操作10次，取平均值。

溶血实验：实验以生理盐水作为阴性对照组，无菌蒸馏水为阳性对照组，聚四氟乙烯人工血管作为实验组。实验组将完整的聚四氟乙烯人工血管(约5 cm)置于生理盐水中浸泡，3组都于37 ℃水浴中孵育1 h。取枸橼酸钠抗凝兔血数毫升，加入生理盐水约1.25倍量，摇匀，制备成红细胞混悬液。在3组样品中均加入10 mL制备好的红细胞悬液，37 ℃温浴1 h后，间断离心，取上清液于540 nm处测定其吸光度。据临床标准判断，溶血率小于5%为安全。实验共设10个样品进行，取平均值。溶血率=(实验组A值-阴性对照组A值)/(阳性对照组A值-阴性对照组A值)×100%。

1.4.2 聚四氟乙烯材料与大鼠心肌细胞的生物相容性分析

大鼠原代心肌细胞的制备：实验参照文献进行^[9-10]。取SD大鼠，腹腔注射1 000 U/kg肝素钠，1 h后戊巴比妥钠注射麻醉，同时使用体积分数75%乙醇湿润大鼠，进行手术。开胸后使用无钙台式液灌流心脏3 min，后使用 35 mL酶溶液1进行灌流，随后使用15 mL酶溶液2进行灌流。直至心肌组织消化变软后，将组织剪下至于酶溶液3中剪碎消化。组织过200目网筛，静置10 min后加入无钙台式液，自然沉降10 min后，加入CaCl₂复钙。具体实验用品配置见参考文献。样品离心后加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基内培养培养，备用。

聚四氟乙烯材料对心肌细胞增殖的影响：将体外分离培养获得的大鼠原代心肌细胞置于细胞培养瓶内，每日更换新鲜的含体积分数10%胎牛血清的DMED高糖培养基，以保持心肌细胞活性。3 d后，待心肌细胞生长成熟后，使用胰酶稍微消化，即吹打下来，以1×10⁸L^-1的细胞浓度接种于6孔板中，在6孔板分别加入硅硼酸盐细胞爬片及与细胞爬片等大的聚四氟乙烯材料片，每日更换培养液。5 d后，去除爬片及材料片，使用胰酶稍微消化后冲洗细胞，使用锥虫蓝染色细胞后光学显微镜计数。实验在2块6孔板上进行，即同一组有6个重复样品。

聚四氟乙烯材料对心肌细胞乳酸脱氢酶释放的影响：将体外分离培养获得的大鼠原代心肌细胞置于细胞培养瓶内，每日更换新鲜的含有体积分数10%胎牛血清的DMED高糖培养基，以保持心肌细胞活性。3 d后，待心肌细胞生长成熟后，使用胰酶稍微消化，即吹打下来，使得细胞处于较高的浓度，接种于6孔板中。在6孔板分别加入硅硼酸盐细胞爬片及与细胞爬片等大的聚四氟乙烯材料片。2 d后吸取细胞上清液，检测细胞经聚四氟乙烯材料处理后乳酸脱氢酶的释放量。

1.5 主要观察指标聚四氟乙烯人工血管对血小板聚集的作用及细胞相容性。

1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，三者或三者以上检测采用单因素的方差分析，两组组间比较釆用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

在中国对人工材料中的规定中，凝血、血小板、血栓形成、免疫学和血液学相关指标都是评价人工生物材料的方法，但是目前为止没有统一的标准对材料的具体指标进行规定，这与人工生物材料的多样性与多功能性有关。有研究对这种情况进行了分析，并提出多种指标符合且权重分明的方式对结果进行分析^[16]，最重要的几个就是血小板的黏附、凝血因子及复钙时间，这3者相加占总权重的70%^[17]。

动态凝血实验是为了检测当血小板内或机体内各类型凝血因子被激活时，凝血时间的差异^[18-21]。在这个实验中，聚四氟乙烯人工血管作为第3方材料参与实验，与普通生理盐水进行对比，机体内的内源性凝血因子被激活，一系列的生化反应最终导致血液的凝固。由于肉眼判断误差较大，因此实验采用分光光度计进行实验，确保实验数据的最客观可靠。新鲜制备的抗凝血由于加入了钙离子的刺激，凝血过程开始逐步反应，随着整体实验的逐步进行，血栓形成的量会越多，与此相对应的，体系内未参与反应的红细胞数量逐步减少，加入了蒸馏水后，产生破坏释放红色素的红细胞就会越少。因此，血栓越强吸光度会越低，凝血性能越好的第3方刺激，导致吸光度越低。从实验来看，加入了聚四氟乙烯人工血管的实验组与加入了生理盐水的对照组相比没有太大变化，具有优良的特性。复钙实验与凝血实验代表的指标基本一致^[22-25]，由于加入了枸橼酸钠抗凝，原来血液中的钙离子已全部被结合，血液处于流动状态无法凝固。而所谓的复钙实验，即是在这个没有钙离子的体系中重新加入钙离子，计算系统开始反应出现絮状沉淀的时间。各体系要求高度的一致，因为钙离子只是凝血过程中的一环，其他体系成分如纤维蛋白原、凝血酶原的不同均会导致复钙时间的延长。在实验中，加入了聚四氟乙烯人工血管的体系，复钙时间与生理盐水相比没有明显的改变。而实验进行的溶血实验是对该材料安全性的探讨^[26-27]，溶血率代表的是这一类型材料对于机体红细胞的破坏程度，这个值越小越好，而从医用材料的角度来说，只要材料的溶血性<5%，即可认为材料是安全的。影响溶血的因素十分多，除了材料本身的生物学特性外，其物理学特性包括做工、形状和样品表面处理等都会对其溶血度有影响。在实验中，聚四氟乙烯人工血管的溶血率2.3%，符号溶血率<5%的要求。

而在实验的第2部分中，进行了聚四氟乙烯材料对大鼠心肌细胞生物相容性的分析，血管的主要功能除了为血液流动提供支持以外，还需要有很好的生物相容性，使其能够与周围的细胞“和谐共存”，只有满足这个条件的血管材料才能够应用于临床^[28]。心肌细胞的增殖分化能力相对于其他许多机体细胞而言，都是十分弱小的^[29-31]。得到具有较好增殖能力的大鼠原代心肌细胞需要合适的方法，实验通过参考文献中介绍的方法，成功获得了有较好活性的心肌细胞，从而完成了实验。在这一原代分离的心肌细胞中，实验检测了聚四氟乙烯人工材料对于细胞增殖率和乳酸脱氢酶释放的影响。结果发现，与目前常用的细胞爬片材料相比，该类人工血管的材料对细胞的增殖和没有太大影响，细胞可以在这一类材料制备的薄片上存活和运动。锥虫蓝是一种只会染色存活细胞的活性染料。如果细胞数量总体偏少，MTT等方法并不敏感，而锥虫蓝作为传统的存活率计数方法可以很好地解决这个问题^[32-34]。

乳酸脱氢酶分布有明显的组织特异性，所以可根据其组织特异性来协用诊断疾病，利用此指标可观察诊断心肌疾病。实验进行的乳酸脱氢酶实验，是为了探讨聚四氟乙烯材料是否会对血管产生伤害作用，乳酸脱氢酶是一种存在于细胞胞浆内的生物活性物质，正常情况下都存在于细胞内部，只有当细胞受到外界刺激被破坏时，乳酸脱氢酶才会释放^[35-37]。同时，检测乳酸脱氢酶只需要取上清液进行实验，方法可靠易行。实验中同样与市售成品的细胞爬片相比，细胞在聚四氟乙烯材料上释放的乳酸脱氢酶量没有显著性的变化，但人造血管与心肌的生物相容性还需要进一步实验研究。

心血管疾病是当今世界的第一大杀手，在疾病排行榜上始终保持在头名的位置。血管移植是治疗该类型疾病的重要手段之一，聚四氟乙烯类材料作为常用的代替人工血管材料之一。实验对其与血小板聚集作用的关系和对大鼠心肌细胞相容性的关系进行探讨，实验证实聚四氟乙烯类材料是一种安全可靠的人工血管材料。对其的进一步研究和包装，可以改良其性能，使其逐步满足适应临床治疗小血管的需要。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚四氟乙烯人工血管对血小板聚集的影响及细胞相容性

Effect of polytetrafluoroethylene artificial blood vessels on platelet aggregation and its cytocompatibility

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