羟基乙酸负载软骨细胞组织工程软骨修复喉软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.47.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
羟基乙酸：是一种简单的聚酯,它具有优异的可生物降解性和生物相容性，其最终降解产物为二氧化碳和水，通过机体正常的新陈代谢排出体外，是一类较重要的医用高分子材料，被广泛应用于人体或动物骨折的内固定、骨缺损的修复、肌腱的修补及人体或动物血管、肌肉及其他组织缝合等方面。
软骨组织工程：是将软骨种子种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，然后再把该复合物植入软骨缺损处，生物材料自行降解的过程中，种植的细胞形成新的软骨来填充缺损。

背景：三维可降解生物支架材料的选择对组织工程软骨的构建十分重要，它能为细胞生长提供依附的支架及增殖空间。
目的：观察羟基乙酸负载软骨细胞修复喉软骨缺损的效果。
方法：取新西兰白兔60只，随机分为2组，对照组、实验组建立喉软骨缺损模型，实验组于缺损处植入负载软骨细胞的羟基乙酸，对照组缺损处植入羟基乙酸，植入后4，8周进行大体与组织学观察。
结果与结论：①大体观察结果：植入后4周，对照组缺损部位色泽暗红，创面明显，与周围组织界限清晰；实验组缺损部位色泽暗红，表面光滑，与周围软骨平齐；②甲苯胺蓝染色结果：植入后8周，实验组喉软组织缺损部位未见明显炎症反应，缺损部位无明显软骨陷窝，有大量软骨细胞生成；对照组缺损部位存在轻微炎症反应，缺损部位存在轻微陷窝，有少许软骨细胞生成；③糖胺聚糖及Ⅱ型胶原蛋白阳性面积：实验组植入4，8周的糖胺聚糖及Ⅱ型胶原蛋白阳性面积大于对照组(P < 0.05)；④结果表明：羟基乙酸负载软骨细胞的组织工程软骨可促进喉软骨缺损的修复。

ORCID: 0000-0002-1507-6388(袁琨)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 羟基乙酸, 软骨细胞, 喉软骨缺损, 喉软骨缺损模型, 胶原蛋白, 甲苯胺蓝染色

Abstract:

BACKGROUND: A three-dimensional biodegradable scaffold is important for tissue-engineered cartilage construction, and it that can provide conditions for cell attachment and proliferation.
OBJECTIVE: To observe the treatment outcomes of glycolic acid loaded with chondrocytes in laryngeal cartilage repair.
METHODS: Sixty New Zealand white rabbits were enrolled and randomly divided into control and experimental groups. Laryngeal cartilage defect models were established in each group, followed by implanted with glycolic acid loaded with chondrocytes and glycolic acid, respectively. Gross and histological observations were conducted at 4 and 8 weeks after implantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Gross observation showed that at 4 weeks after implantation, a deep red wound with an obvious boundary was seen in the control group; the dark red and smooth defect parallel to the surrounding tissue was found in the experimental group. Toluidine blue staining revealed that at 8 weeks after implantation, the laryngeal defect site showed no obvious inflammation and cartilage collapse, with numerous newly-formed chondrocytes in the experimental group; in contrast, mild inflammation and cartilage collapse were found in the defect region of the control group, and few newly-formed chondrocytes appeared. The positive areas of glycosaminoglycan and type II collagen in the experimental group were significantly larger than those in the control group at 4 and 8 weeks after implantation (P < 0.05). These results indicate that glycolic acid loaded with chondrocytes contributes to the repair of laryngeal cartilage defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Chondrocytes, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

贾敏，袁琨. 羟基乙酸负载软骨细胞组织工程软骨修复喉软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(47): 7051-7056.

Jia Min, Yuan Kun . Glycolic acid loaded with chondrocytes repairs laryngeal cartilage defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(47): 7051-7056.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2014年12月至2015年6月在华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院完成。

1.3 材料

实验动物：四五月龄新西兰白兔65只，体质量2.0-3.5 kg，平均(2.5±0.5) kg，雌雄随机，由中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院院动物实验中心提供。实验过程中对新西兰白兔饲养、处理均符合《关于善待实验动物的指导性意见》相关规则^[12-13]。将60只兔随机分为对照组、实验组，每组30只。

主要仪器和试剂：羟基乙酸(美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；CO₂培养箱(Queue，美国)；Ham-F12培养基(Gibco，美国)；Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma，美国)；胎牛血清(浙江四季青生物制品公司)；常规手术器械(上海医疗器械厂)；专业动物实验台(中科院上海细胞所)。

1.4 实验方法

1.4.1 羟基乙酸负载软骨细胞

软骨种植获取：选5只新西兰白兔，取肋骨及关节软骨，并将其切成1.0-2.0 mm³大小的碎块，加入Ⅱ型胶原酶消化8 h，采用150目尼龙筛选软骨细胞， 1 000 r/min离心10 min，去除上层清液，加入新鲜培养液重悬细胞，细胞计数后将其接种在培养瓶内进行培养，2 d换液1次，获取第3代细胞备用^[14-15]。

羟基乙酸处理：羟基乙酸直径15 μm，纤维平均间距为100-150 μm，厚度1.0 mm，孔隙率为97%，将羟基乙酸剪成1.2 cm×1.5 cm片状，采用体积分数75%乙醇消毒，加入PBS冲洗、干燥，干燥后备用^[16-17]。

羟基乙酸负载软骨细胞：将第3代5×10¹⁰ L^-1的软骨细胞接种在羟基乙酸支架上，放置在37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度培养箱中培养4 h，加入2 mL培养液，每2 d换液1次，采用倒置显微镜进行观察^[18-19]。

采用体外共培养1周的细胞支架复合物进行体内实验。

1.4.2 兔喉软骨缺损模型的建立及分组处理对照组、实验组新西兰白兔均禁食12 h，术前肌肉注射0.5 g阿托品，采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾，将动物固定在手术台上，颈部剃毛，手术过程中从颈前正中做一个纵行切口，分离皮下及基层，充分暴露软骨，做一个大小为0.5 cm×0.5 cm的全层喉软骨缺损，且不穿透喉黏膜，建立新西兰白兔喉软骨缺损动物模型^[20-21]。

对照组于缺损处植入羟基乙酸材料，实验组缺损处植入负载软骨细胞的羟基乙酸，创面缝合后采用油纱、无菌纱布双层敷料覆盖创面、包扎，根据新西兰白兔情况给予抗生素预防感染，待家兔清醒后，送回笼中饲养^[22-23]。

1.5 主要观察指标采用倒置显微镜观察羟基乙酸负载软骨细胞情况；新西兰白兔术后一般情况；植入后4周，各组处死6只兔，观察缺损部位大体情况；植入后8周，观察3组兔组织片情况(采用甲苯胺蓝染色)^[24-25]；植入后4，8周，各组处死6只兔，取软骨缺损部位组织，采用免疫组织化学方法测定糖胺聚糖阳性面积及Ⅱ型胶原蛋白阳性面积。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05提示经比较组间数据存在统计学差异。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

三维可降解生物支架材料的选择对组织工程软骨的构建十分重要，它能为细胞生长提供依附的支架及增殖空间^[26-27]。理想的支架应具有良好的生物相容性，并且能够随着细胞的增殖进行相应的降解，即当移植的细胞形成与所需组织相类似的形态时再逐步降解^[28-29]。

组织工程技术的发展为喉软骨组织缺损修复提供了方法，但组织工程化软骨的形成需要大量的种子细胞，自体软骨取材相对有限，而体外扩增则容易导致细胞的“去分化”而失去原有表性^[30-31]。因此，目前难以从少量自体软骨中获取更多的软骨种子细胞。软骨组织和其他组织相比结构相对单一，无血管和淋巴管，细胞被包埋在软骨基质内而形成陷窝，避免了与免疫细胞的直接接触^[32-33]。

目前，软骨组织中使用的生物材料主要有4种，即天天材料、人工合成材料、微生物合成新型材料及复合材料等，这些材料的生物相容性、降解性、内部微结构等各有优缺点^[34-35]。羟基乙酸是软骨组织工程中使用较多的支架材料，该材料属于是微生物合成的天然物质，不含有有害物质，该材料具有高熔点、高结晶度、高相对分子质量且具有良好的生物相容性^[36-37]。负载软骨细胞边缘纤维上存在单个、串珠细胞附着在纤维表面，培养1周后软骨细胞在羟基乙酸支架上呈蜘蛛网分布。相关研究显示，随着单体碳数的增加，羟基乙酸的力学性能也会从脆性到黏性的转变，能获得更高的强度、韧性^[38-39]。

此次研究中，将羟基乙酸负载软骨细胞运用于喉软骨缺损中，术后呼吸和进食等均未受到明显影响，新西兰白兔喉缺损部位修复良好^[40]。实验中，对照组缺损部位色泽暗红，创面明显且与周围组织界限清晰；实验组缺损部位色泽暗红，表面光滑，与周围软骨平齐。

组织工程支架的内部结构在一定程度上确定了选择材料的性能及体内外降解性。软组织工程研究显示新生软骨的形成需要6-8周。因此，支架材料的生物降解时间也应该设计在6周以后，由于羟基乙酸负载软骨细胞时限设定较宽，可根据需要设置相关参数^[41-48]。实验中，实验组植入后4，8周糖胺聚糖阳性面积及Ⅱ型胶原蛋白阳性面积显著大于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，由此看出，羟基乙酸负载软骨细胞植入8周后喉软骨缺损基本得到愈合。

综上所述，羟基乙酸负载软骨细胞修复喉软骨缺损效果理想，能修复正常免疫功能家兔的喉软骨缺损，新生的软骨与正常软骨不会存在明显的细胞区界面。

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