miR-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.001

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
微小RNA(miRNA)：是近几年来发现的一类长度为21-25 bp的内源性非编码小RNA，它们通过结合到目标靶mRNA上，降解mRNA或阻遏翻译功能，从而在多种生物学过程中发挥重要调控作用，例如细胞的增殖、凋亡、分化、衰老等。据预测，至少1 000个miRNAs存在于人类基因组中，调控上万个蛋白编码基因。生物信息学分析也表明每个miRNA调控成百上千个基因，这也从侧面反映了miRNAs几乎参与了每一个生物学过程。
萤光素酶：是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrali'的萤火虫体内的萤光素酶。在相应化学反应中，萤光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。没有萤光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应(与肌肉收缩的情况相似)。

摘要
背景：既往研究发现，miR-195在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中，表达量显著增加，但是其作用及其机制尚不明确。
目的：探索miR-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制。
方法：体外分离、培养人骨髓间充质干细胞，通过碱性磷酸酶活性测定试剂盒、蛋白免疫和实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测在人骨髓间充质干细胞诱导分化过程中，碱性磷酸酶活性和骨分化特异基因Runx2和osteopontin表达水平的变化，以及miR-195和它的潜在靶SMAD7表达量的变化；通过脂质体转染构建miR-195低表达的人骨髓间充质干细胞，研究miR-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。利用荧光素酶报告基因实验检测miR-195对SMAD7的靶向作用。
结果与结论：①分离培养的人骨髓间充质干细胞具有优良的体外成骨分化能力；②miR-195表达量随人骨髓间充质干细胞诱导分化时间的增加而升高，SMAD7则相反。③miR-195能够促进人骨髓间充质干细胞成骨分化；④荧光素酶实验证实SMAD7是miR-195的直接靶，SMAD7过表达抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化；⑤结果提示，miR-195通过靶向SMAD7促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7370-8200(宋鹏)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 成骨分化, miR-195, 人骨髓间充质干细胞, 骨质疏松, SMAD7

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that the expression level of miR-195 in differentiated human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMMSCs) is significantly higher than that in undifferentiated hBMMSCs. However, miR-195 effect during this differentiation process and possible mechanism remain unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of miR-195 on osteogenic differentiation of hBMMSCs and possible mechanism.
METHODS: hBMMSCs were isolated and cultured in vitro. Alkaline phosphatase activity, Runx2, osteopontin and SMAD7 protein expression and miR-195 expression level during osteogenic differentiation of hBMMSCs were determined by alkaline phosphatase kit, western blot and real-time PCR, respectively. miR-195-downexpressed hBMMSCs were constructed by lipofection transfection, and were used to investigate the effect of miR-195 was on osteogenic differentiation of hBMMSCs. Dual luciferase reporter assay was used to identify whether the 3’UTR of SMAD7 mRNA was a binding target of miR-195. In addition, we transfected hBMMSCs with SMAD7 cDNA (pcDNA-SMAD7), and investigated the effect of SMAD7 on osteogenic differentiation of hBMMSCs.
RESULTS AND CONCLUSION: The isolated and cultured hBMMSCs had good osteogenic differentiation ability in vitro. Expression level of miR-195 was increased with the increasing of induction time, and the expression level of SMAD7 was reversed. miR-195 promoted osteogenic differentiation of hBMMSCs. Luciferase assay confirmed that miR-195 targeted SMAD7 directly, and overexpression of SMAD7 inhibited the osteogenic differentiation of hBMMSCs. Taken together, miR-195 promotes osteogenic differentiation of hBMMSCs by targeting SMAD7.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Development, Mesenchymal Stem Cells, MicroRNAs, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

宋鹏，荆凯，薛建华，魏鹏飞. miR-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(45): 6693-6699.

Song Peng, Jing Kai, Xue Jian-hua, Wei Peng-fei. miR-195 effect on osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(45): 6693-6699.

图/表（结果） 1

2.1 人骨髓间充质干细胞成骨分化能力 通过检测碱性磷酸酶活性以及成骨分化特异基因Runx2和osteopontin表达水平来观察人骨髓间充质干细胞成骨分化能力，发现碱性磷酸酶活性以及Runx2和osteopontin的表达水平均随着诱导时间的增加而升高，但在第9天和12天各项指标的水平没有明显差异(图1)。这些结果表明分离培养的人骨髓间充质干细胞具有优良的体外成骨分化能力。

2.2 人骨髓间充质干细胞成骨分化miR-195和SMAD7表达 通过qRT-PCR和免疫印迹分别检测了miR-195以及它的一个潜在靶SMAD7在诱导过程中的表达水平变化，发现miR-195随诱导时间的增加而升高，SMAD7则相反，同样地，它们在第9天和12天的表达水平也无明显差异(图2)。

2.3 miR-195促进人骨髓间充质干细胞成骨分化 为了探究miR-195对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化影响，首先通过脂质体转染构建miR-195低表达的细胞和对照细胞，然后诱导其分化，在分化的第9天，检测碱性磷酸酶活性，发现miR-195低表达组相比于对照组，碱性磷酸酶活性明显降低(图3A)。此外，采用免疫印迹检测两组细胞中骨分化标志物Runx2和osteopontin蛋白的表达。结果显示miR-195低表达组相比于对照组有明显较低的Runx2和osteopontin蛋白表达水平(图3B)。这些结果表明了miR-195能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化进程。

2.4 miR-195直接靶向SMAD7 通过Targetscan和miRanda等在线软件预测miR-195靶基因，发现Smad7是它的一个潜在靶，SMAD7 mRNA的3’UTR与miR-195的种子区存在理论上的互补碱基配对序列(图4A)。进而执行了荧光素酶实验，结果显示共转染SMAD7野生型的实验组的荧光素酶活性明显低于对照组，而共转染SMAD7突变型的实验组与对照组的荧光素酶活性无显著差异，这证实miR-195可以直接作用于SMAD7(图4B)。又进一步实验，研究转染miR-195抑制剂和抑制剂对照对人骨髓间充质干细胞中SMAD7蛋白表达量的影响。结果显示转染miR-195抑制剂组相比于对照组有明显较高的SMAD7蛋白表达水平(图4C)。此外，又进一步探究miR-195是否通过靶向SMAD7促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，首先通过脂质体转染构建SMAD7高表达的细胞(pcDNA-SMAD7)和对照细胞(pcDNA-control)，然后诱导其分化，在分化的第9天，检测碱性磷酸酶活性，发现SMAD7高表达组的碱性磷酸酶活性明显低于对照组(图4D)。免疫印迹实验显示SMAD7高表达组相比于对照组有明显较低的Runx2和osteopontin蛋白表达水平(图4E)。以上结果表明，miR-195通过靶向SMAD7促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

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引言

间充质干细胞是位于中胚层的一类多能干细胞，在不同条件下可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞等多种细胞^[1-4]。它最初是由Friedenstein等从骨髓中分离鉴定的，后发现它广泛存在于脂肪、肌肉、血液等结缔组织中^[5]。它还能通过细胞间的相互作用以及产生的细胞因子来抑制B细胞、T细胞等的增殖，从而抑制免疫反应，因此在临床中不存在免疫排斥^[6]。由于人骨髓来源的间充质干细胞易于在体外培养，且可在成骨诱导条件下分化为成骨细胞，已成为目前较理想的骨组织工程种子细胞，在促进骨质疏松患者骨的修复和重建中发挥着巨大的作用^[7]。而提高人骨髓间充质干细胞成骨分化能力是骨再生的关键。

MicroRNAs(miRNA)是近几年来发现的一类长度为21-25 bp的内源性非编码小RNA，它们通过结合到目标靶mRNA上，降解mRNA或阻遏翻译功能，从而在细胞的多种生物学过程中发挥重要调控作用，例如细胞的增殖、凋亡、分化、衰老等^[8-9]。据预测，至少1 000个miRNAs存在于人类基因组中，调控上万个蛋白编码基因^[10-11]。生物信息学分析也表明每个miRNA调控成百上千个基因，这也从侧面反映了miRNAs几乎参与了每一个生物学过程^[9]。越来越多的研究表明，miRNAs能够调控间充质干细胞向成骨细胞分化，例如miR-346、miR-20a、miR-29b、miR-433等^[12-15]。近期研究发现miR-195在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中，表达量显著增加，但是其具体的作用和机制尚未有报道^[16]。作者通过Targetscan和miRanda等在线软件预测miR-195靶基因，发现Smad7是它的一个潜在靶。SMAD7是转化生长因子β信号通路的抑制剂，而转化生长因子?信号通路是骨形成最重要的一条信号通路^[17-20]。因此，猜测miR-195可能通过靶向抑制SMAD7表达促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

研究通过分离培养人骨髓间充质干细胞，采用成骨分化诱导培养体系诱导其向成骨细胞分化，通过执行实时定量PCR、免疫印迹、荧光素酶报告活性检测等实验探究miR-93在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用，以及是否通过靶向调控Smad7起作用。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年8月至2015年8月在河南省中医院病理实验室完成。

1.3 材料

试剂及仪器：MEM培养基，胎牛血清(FBS)，青霉素，链霉素(美国Gibco公司)；Percoll 分离液，RNAiso for small RNA(武汉科昊佳生物科技有限公司)；地塞米松，β-甘油磷酸钠，维生素C(美国Sigma 公司)；U6(上海诺伦生物医药技术有限公司)；Trizol试剂盒，One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit，Lipofectamine 2000转染试剂盒，Dual-Luciferase Reporter System (美国GeneCopoeia公司)；SYBR® Premix Ex Taq^TMⅡ，GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System试剂盒(美国Invitrogen 公司)；碱性磷酸酶活性测定试剂盒(南京建成生物制品有限公司)；miR-195模拟物和miRNA模拟物对照，miR-195抑制剂和抑制剂对照，pcDNA3.1载体(西安沃尔森生物技术有限公司)；Chromo4^TM实时定量PCR仪(上海智中实验室设备有限公司)；SMAD7抗体，Runx2抗体，osteopontin抗体，GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记二抗(英国Abcam公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞的分离、培养和成骨诱导 经伦理委员会批准，本人签署知情同意书后，抽取健康志愿者的骨髓，置于肝素抗凝管中。将骨髓与等体积无血清α-MEM培养基(含有青霉素钠和链霉素各100 U/mL)吹打混匀。室温800×g离心10 min，去除脂肪层，用α-MEM培养液重悬细胞，缓慢注入等体积的1.073 g/mL Percoll 分离液，400×g离心30 min，吸取中间的单个核细胞层，PBS清洗2次，重悬于含有体积分数10% FBS及青霉素钠和链霉素各100 U/mL的α-MEM培养液中，使细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于培养瓶中进行扩大培养。实验中所用到的间充质干细胞均为第4代。间充质干细胞经不同处理后接种于6孔板中，待细胞生长至60%-70%融合时，更换为成骨诱导培养基诱导其成骨分化，成骨诱导培养基为内含有体积分数10% FBS、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 mg/L维生素C的α-MEM培养液。

1.4.2 细胞转染 按照Trizol试剂盒使用说明提取人骨髓间充质干细胞的总RNA，然后依照One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit使用说明书反转录得到cDNA，通过PCR扩增SMAD7 cDNA，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中，构建pcDNA-SMAD7重组质粒。选取对数期生长状态良好的人骨髓间充质干细胞，以2×10⁵/孔的密度接种到6孔板中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的孵箱中培养。待细胞生长至约50%融合时，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染，将miR-195模拟物(miR-195 mimics)和miRNA模拟物对照(miR-control)、miR-195抑制剂(miR-195 inhibitors)和抑制剂对照(anti-miR-control)，pcDNA-SMAD7重组质粒(pcDNA- SMAD7)和对照(pcDNA-control)转染至人骨髓间充质干细胞，转染24 h后更换新鲜的培养液。待细胞融合度为60%-70%时，更换为成骨诱导培养基诱导其成骨分化。

1.4.3 实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-195表达 收集诱导0，3，6，9，12 d的细胞，用PBS清洗3次，加入RNAiso for small RNA提取总miRNA，用琼脂糖凝胶电泳测其质量，分光光度计测其浓度，无RNA酶水调整其质量浓度为1 g/L。然后按照One Step PrimeScript^® miRNA cDNA Synthesis Kit操作说明进行反转录得到cDNA，将得到的cDNA稀释4倍，加入SYBR^® Premix Ex Taq^TMⅡ，以U6为内参基因，在Chromo4^TM实时定量PCR仪上进行定量，采用Opticon-3软件对结果进行分析。

1.4.4 免疫印迹检测 用PBS清洗收集的细胞，用细胞裂解液、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂按体积配比为100∶1∶1配置的混合液裂解细胞，冰浴30 min 后收集上清，测定蛋白浓度，取等量的蛋白进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并转至硝酸纤维素膜，TBST洗涤，使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗孵育4 ℃过夜，TBST洗涤3次，二抗孵育2 h，TBST 洗涤3次后，于暗室中进行压片，然后ECL化学放光及显影。

1.4.5 碱性磷酸酶活性检测 根据碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书进行，采用ELISA方法，用碱性磷酸酶黄色液体底物系统对碱性磷酸酶活性进行定量。收集细胞，提取细胞的总蛋白，以总蛋白量对碱性磷酸酶活性进行标准化。使用紫外分光光度计测定波长 405 nm处的吸光度值，并依照下列公式计算碱性磷酸酶活性：

碱性磷酸酶活性(U/g)=[(测定管吸光度值/标准管吸光度值)×标准管对硝基酚量]/总蛋白克数

1.4.6 荧光素酶实验 将SMAD7 3’UTR片段的PCR扩增产物克隆到pGL3质粒Xbal I酶切位点，构建野生型pGL3-WT-SMAD7报告基因质粒。按照GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System试剂盒说明书突变SMAD7 3’UTR上miR-195结合位点，构建突变型pGL3-MUT-SMAD7真核表达载体。取人骨髓间充质干细胞分别转染为以下4组：①SMAD7野生型质粒：对照组(野生型SMAD7质粒和miRNA模拟物对照)，实验组(野生型SMAD7质粒和miR-195模拟物)；②SMAD7突变型质粒：对照组(突变型SMAD7质粒与miRNA模拟物对照)，实验组(突变型SMAD7质粒与miR-195模拟物)。转染24 h后，收集细胞，用Dual-Luciferase Reporter System检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.5 主要观察指标 miR-195、SMAD7、Runx2、osteopontin和碱性磷酸酶活性在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程的表达；Runx2、osteopontin和碱性磷酸酶活性在转染miR-195抑制剂与抑制剂对照的人骨髓间充质干细胞诱导分化后的细胞中的表达；miR-195对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可能影响机制。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验比较组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨是一个连续动态平衡组织，它主要包括2种细胞，成骨细胞和破骨细胞，前者促进骨形成，后者促进骨吸收。正常的骨组织中这2种细胞是平衡的，一旦打破这种平衡，就会引发各类骨代谢性疾病^[21]。中国是一个老龄化日趋严重的国家，骨质疏松、骨裂、骨折等多种骨代谢相关疾病已成为一个迫切需要解决的问题，必须尽快找到一个行之有效的治疗措施来治疗这类疾病。提高骨再生能力是治疗这类疾病的关键。人骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞，经不同条件诱导可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞。由于人骨髓间充质干细胞增殖能力强、分化潜力大、免疫原性低、体外易培养等一系列优点，已成为骨组织工程理想的种子细胞，在促进骨修复和重建方面具有重要的临床应用价值^[7^，^22-23]。提高人骨髓间充质干细胞成骨分化能力是骨再生的关键。

miRNA是近来发现的一类具有调控功能的小RNA，在多种生物学过程中发挥重要的调控作用^[8-9]。越来越多的miRNAs被报道能够调控人骨髓间充质干细胞成骨分化。Wang等^[12]报道过表达miR-346通过靶向GSK3b调控Wnt信号通路进而促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。Zhang等^[13]发现了miR-20a在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中，表达量逐渐升高。通过研究miR-20a调控成骨分化的分子机制发现，它通过靶向PPARγ，Bambi和Crim1调控BMP/Runx2信号通路进而促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。Li等^[14]报道了miR-29b通过直接下调成骨分化的抑制剂HDAC4、TGFβ3、ACVR2A、CTNNBIP1和DUSP2蛋白，从而促进成骨分化。一些miRNA也被报道能够抑制间充质干细胞成骨分化，例如，miR-145通过靶向Sp7抑制成骨分化，miR-433通过靶向Runx2抑制成骨分化^[15^，^24]。miR-195是一个近期受到广泛研究的miRNA，关于它的研究主要集中在肿瘤领域。很多研究报道了它的表达异常与多种肿瘤包括前列腺癌、肾上腺皮质癌、乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、肝癌、黑素瘤、膀胱癌等的发生、转移以及预后有关^[25-30]。但是，关于miR-195在正常组织中的功能研究较少。最新一个研究报道miR-195在小鼠骨骼肌生长过程中呈上调表达，qRT-PCR检测结果表明miR-195在出生后2 d的小鼠腿肌中表达相对较低，在出生后2周和4周的小鼠腿肌中的表达明显升高，在出生后6周的小鼠腿肌中表达最高，上调10.70倍，这暗示了miR-195参与了正常组织的生长发育^[31-32]。近期研究发现miR-195在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中，表达量显著增加^[16]。推测可能对人骨髓间充质干细胞成骨分化具有一定的促进作用，而且通过靶基因预测软件发现抑制骨分化蛋白SMAD7是它的一个潜在靶，因此推测miR-195可能通过靶向抑制Smad7蛋白表达促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

研究首先通过检测碱性磷酸酶活性以及成骨分化特异基因Runx2和osteoponti在诱导成骨分化过程中表达水平的变化，证实分离培养的人骨髓间充质干细胞具有优良的体外成骨分化能力。作者也检测了miR-195和SMAD7在诱导成骨分化过程中的表达水平变化，发现前者随诱导时间的增加而升高，后者则相反。接下来脂质体转染构建低表达的miR-195人骨髓间充质干细胞，诱导分化，通过检测碱性磷酸酶活性和骨分化标志物Runx2和osteopontin的表达，发现miR-195能够促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。随后通过荧光素酶实验证实了SMAD7的确是miR-195的一个直接靶。此外，还检测了miR-195抑制剂与抑制剂对照转染的人骨髓间充质干细胞中的SMAD7蛋白表达量，发现转染miR-195抑制剂明显提高了SMAD7蛋白表达水平，进一步证实了miR-195对SMAD7具有直接的作用。进一步实验探究miR-195促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化是否通过靶向SMAD7起作用。利用脂质体转染构建SMAD7过表达的人骨髓间充质干细胞，然后诱导其分化，发现SMAD7抑制人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这与miR-195低表达对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响一致。因此，得出结论，miR-195通过靶向SMAD7促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。

骨代谢相关疾病的发生是一个复杂的过程。通过对人骨髓间充质干细胞成骨分化进行研究，以期在细胞层面上获得miR-195在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用及其机制，为成骨发育以及骨代谢相关疾病的防治提供新的线索和理论依据。