构建糖尿病大鼠模型：Klotho基因导入对冠状动脉的保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：Klotho基因是一种与机体衰老、代谢以及疾病有重要关联的基因，并已在小鼠动物实验中证实可减缓和抑制动脉粥样硬化，其机制与参与脂类代谢有关。
目的：构建糖尿病大鼠模型，观察Klotho基因导入是否对糖尿病大鼠冠状动脉具有保护作用。
方法：由正常SD大鼠肾组织提取Klotho基因，对目的基因进行PCR扩增，以腺病毒作为载体。随机将SD大鼠分为模型组、对照组和治疗组，进行糖尿病造模；将Klotho基因导入治疗组，对照组导入普通腺病毒，模型组不作任何处理。造模成功后12周时处死模型动物，检测血清低密度脂蛋白、高密度脂蛋白浓度及冠状动脉内膜、中膜厚度比。
结果与结论：高密度脂蛋白浓度，治疗组高于模型组及对照组，治疗组与模型组、治疗组与对照组差异均有显著性意义(P < 0.05)，模型组与对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)。低密度脂蛋白浓度，各模型组均有明显升高，但差异无显著性意义(P > 0.05)。计算各组内膜厚度，治疗组显著小于模型组及对照组，差异均有显著性意义(P < 0.01)，而模型组与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)。各组间中膜厚度差异无显著性意义 (P > 0.05)。内膜、中膜厚度比，治疗组分别与模型组及对照组相比，差异均有显著性意义(P < 0.01)；治疗组与正常组差异无显著性意义(P > 0.05)，表明KL基因导入后内膜、中膜厚度比基本接近于正常水平，低于模型组及对照组，内膜增厚程度减小。提示Klotho基因导入糖尿病大鼠后对冠状动脉具有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 基因病毒载体及相关因子动物模型, 糖尿病, Klotho基因, 脂蛋白, 冠状动脉粥样硬化, 基因导入

Abstract:

BACKGROUND: Klotho gene has an important correlation with organism aging, metabolism and disease. It is confirmed by mouse experiments that Klotho gene can slow down and inhibit atherosclerosis, and its underlying mechanism is involved in lipid metabolism.
OBJECTIVE: To establish diabetic rat models and observe whether Klotho gene transfer has a protective effect on coronary artery of diabetic rats.
METHODS: Klotho gene was extracted from the kidney tissue of normal Sprague-Dawley rats. The target gene was amplified by polymerase chain reaction. Adenovirus was taken as a carrier. Sprague-Dawley rats were randomly divided into model, control and treatment groups to establish diabetic rat models. Klotho gene was transferred into the treatment group, and common adenovirus was transferred into the control group. Rats in model group did not receive any treatment. At the 12th week after modeling, the model animals were sacrificed. Serum low density lipoprotein, high density lipoprotein concentrations, coronary artery intima-media thickness ratio were determined.
RESULTS AND CONCLUSION: The high density lipoprotein concentration in treatment group was significantly higher than that in the model and control groups (P < 0.05). There was no significant difference in high density lipoprotein concentration between model and control groups. The low density lipoprotein in each group was significantly increased, but the differences were not significant (P > 0.05). The intima thickness in treatment group
was significantly smaller than that in model and control groups (P < 0.01), but the differences between model and control groups were not significant (P > 0.05). There was no significant difference in media thickness between each group (P > 0.05). The intima-media thickness ratio in the treatment group was significantly lower than that in the model and control groups (P < 0.01). There was no significant difference in the intima-media thickness ratio between treatment and normal groups (P > 0.05). These results showed that after Klotho gene transfer, the intima-media thickness ratio was substantially close to the normal level, and lower than that in the the model and control groups, and the degree of intimal thickening reduced. These results suggest that Klotho gene has a protective effect on coronary artery after being transferred into diabetic rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

中图分类号:

R318

舒礼良，陈茂林，苏刚，徐敬. 构建糖尿病大鼠模型：Klotho基因导入对冠状动脉的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 7958-7963.

Shu Li-liang, Chen Mao-lin, Su Gang, Xu Jing. Construction of diabetic rat models: protective effect of Klotho gene transfer on coronary artery[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 7958-7963.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析纳入SD大鼠共73只，以15只作为正常组，其余大鼠注射链脲佐菌素后死亡5只，造模成功53只，第3周因血糖恢复正常脱失1只，第8，11周因酮症酸中毒死亡2只，治疗组腺病毒转染失败1只，最后每组取15只进入最后各项结果检测。
大鼠造模流程图见图2。

2.2 造模方法的改进在糖尿病基础上制造高血脂的状态，一定程度上加快了动脉粥样硬化的过程，同时方便观察KL基因导入效果。
2.3 血糖检测造模后检测大鼠血糖浓度，正常组 5.7 mmol/L，糖尿病模型组17.3 mmol/L，对照组16.7 mmol/L，治疗组16.1 mmol/L，提示糖尿病大鼠造模成功，各模型组间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 Klotho蛋白表达水平比较造模后第12周，治疗组大鼠血清中的Klotho蛋白含量(0.618±0.081)g/L明显高于对照组(0.351±0.054) g/L和模型组(0.401±0.062) g/L，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 脂蛋白浓度比较见表1。

高密度脂蛋白浓度，治疗组高于模型组及对照组，两独立样本t 检验治疗组与模型组、治疗组与对照组差异均有显著性意义(P < 0.05)，模型组与对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)。
低密度脂蛋白浓度，各模型组均有明显升高，两独立样本t 检验显示各组间差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.6 冠状动脉内膜粥样斑块检测造模后第12周，经 Masson染色后胶原纤维呈蓝绿色指示外膜，平滑肌呈鲜红色指示中膜，内弹性膜呈白色或无色，为中膜、内膜的分界点，正常组及各造模组切片结果见图5。

各造模组大鼠均可见内皮细胞下有充满脂质的泡沫细胞，泡沫细胞体积较大，胞浆呈空泡状，泡沫细胞主要来源于迁入内膜的平滑肌细胞吞噬脂质形成，此外，内膜还可见少量淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞；动脉血管中膜中膜层结构变疏松，平滑肌细胞特性改变，多位合成型细胞，并出现细胞迁移，全层弹性纤维减少；外膜无明显病理性改变。正常组未见。
造模后第12周，计算各组内膜厚度，治疗组为(1.74±0.05) μm，模型组为(2.15±0.05) μm，对照组为(2.23±0.06) μm，治疗组显著小于模型组及对照组，经过两独立样本t 检验，差异均有显著性意义(P < 0.01)，而模型组与对照组，差异无显著性意义(P > 0.05)。各组间中膜厚度差异无显著性意义(P > 0.05)。
各组大鼠内膜、中膜厚度比见表2。
内膜、中膜厚度比，治疗组分别与模型组及对照组行t检验，差异均有显著性意义(P < 0.01)；治疗组与正常组差异无显著性意义(P > 0.05)，表明KL基因导入后内膜、中膜厚度比基本接近于正常水平，低于模型组及对照组，内膜增厚程度减小。

参考文献

[1] Ginsberg HN,Elam MB,Lovato LC,et al.Effects of combination lipid therapy in type 2 diabetes mellitus.N Engl J Med. 2010; 362(17):1563-1574.

[2] Kuro-o M,Matsumura Y,Ailawa H,et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. 1997;390(6655):45-51.

[3] Kumsu H, Yamamoto M, Clark JD, et al. Suppression of aging in mice by the hormone Klotho. Science. 2005;309(5742):1829-1833.

[4] Aizawa H,Saito Y,Nakamura T,et al.Downregulation of the klotho gene in the kidney under sustained circulatory stress in rats.Biochem Biophys Res Commun. 1998;249(3):865-871.

[5] Arking DE,Becker DM,Yanek LR,et al.KLOTHO allele status and risk of early-onset occult coronary artery disease. Am J Hum Genet. 2003;72(5):1154-1161.

[6] Matsumura Y, Aizawa H, Shiraki-Iida T, et al. Identification of the human klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted klotho protein．Biochem Biophys Res Commun. 1998;242(3): 626-630.

[7] Raekleum N, Rackietan ML, Nadkami MR. Studies on Diabetogenic action of astreptozotocin (NSC-37917). Cancer Chemother Rep. 1993;29:91.

[8] 王虎林,司良毅,孙兰英,等.Klotho基因G-395A多态性与动脉硬化的相关性研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2008,10(2): 96-98．

[9] Takeshita K,Yamamoto K,Ito M,et al. Increased expression of plasminogen activator inhibitor-1 wirh fibrin deposition in a murine model of aging,”Klotho” mouse. Semin Thromb Hemost. 2002;28(6):545-554.

[10] Biddinger SB,Hernandez-Ono A,Rask-Maden C,et al. Hepatic insulin resistance is sufficient to produce dyslipidemia and susceptibility to atherosclerosis. Cell Metab. 2008;7(2):125-134.

[11] Price MJ, Shah PK. New strategies in managing and preventing atherosclerosis: focus on HDL. Rev Cardiovasc Med. 2002;3(3):129-137.

[12] 房晨鹏,刘怡欣,田鹏,等.Klotho基因多态性与低密度脂蛋白水平的关系[J].现代预防医学, 2011,38(14):2818-2820.

[13] Arking DE, Becker DM, Yanek LR, et al. KLOTHO allele status and the risk of early-onset occult coronary artery disease. Am H Hum Genet. 2003;72:1154-1161.

[14] Arking DE,Atzmon G,Arking A,et al.Association between a funcitional variant of the KLOTHO gene and high-density lipoprotein cholesterol,blood pressure,stroke,and longevity. Circ Res. 2005;96:412-418.

[15] Wang HL, Xu Q, Wu Z, et al. A potential regulatory single nucleotide polymorphism in the promoter of the Klotho gene may be associated with essential hypertension in the Chinese Han population. Clinica Chimica Acta. 2010;411: 386-390.

[16] Shu L, Chen M, Wen M, et al. Study of klotho gene transfer for the protective effect of the coronary of diabetic rats. Pak J Pharm Sci. 2014;27(6 Suppl):2095-2099.

[17] Navarro-González JF, Donate-Correa J, de Fuentes M, et al. Reduced Klotho is associated with the presence and severity of coronary artery disease. Heart. 2014;100(1):34-40.

[18] Ko GJ, Lee YM, Lee EA, et al. The association of Klotho gene polymorphism with the mortality of patients on maintenance dialysis. Clin Nephrol. 2013;80(4):263-269.

[19] Tangri N, Alam A, Wooten EC, et al. Lack of association of Klotho gene variants with valvular and vascular calcification in Caucasians: a candidate gene study of the Framingham Offspring Cohort. Nephrol Dial Transplant. 2011;26(12): 3998-4002.

[20] Jo SH, Kim SG, Choi YJ, et al. KLOTHO gene polymorphism is associated with coronary artery stenosis but not with coronarycalcification in a Korean population. Int Heart J. 2009; 50(1):23-32.

[21] Rhee EJ, Oh KW, Lee WY, et al. The differential effects of age on the association of KLOTHO gene polymorphisms with coronary artery disease. Metabolism. 2006;55(10): 1344-1351.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，于2013年10月至2014年8月在杭州赫贝科技有限公司完成。
1.2 材料清洁级SD大鼠73只，体质量150-170 g，雄性，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2008-0016。
实验分组：将大鼠按随机数字表法分为正常组和糖尿病组，适应喂养1周后，正常组喂以普通饲料，糖尿病组喂以高脂饮食，一段时间后糖尿病组给予腹腔注射链脲佐菌素，正常组仅注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。尾静脉采血测饱腹血糖，以饱腹血糖> 16.7 mmol/L 作为糖尿病大鼠造模成功的标准。
将糖尿病大鼠随机分成3组，其中糖尿病模型组17只，糖尿病模型+病毒转染组(治疗组)18只，糖尿病模型+阴性载体组(对照组)18只。
1.3 造模方法

创建糖尿病大鼠模型：糖尿病组大鼠喂以高脂饮食，一段时间后以30 mg/kg的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素进行糖尿病造模。继续原饲料喂养12周，饱腹时尾静脉采血测饱腹血糖，以饱腹血糖> 16.7 mmol/L作为糖尿病成模标准。模型组不作处理，治疗组给予一次性尾静脉注射Ad-rklotho，对照组给予一次注射Ad-EGFP。平均每只大鼠腺病毒注射剂量为2×109 TU。
糖尿病大鼠模型造模成功标准：①常规观察：正常组动物皮毛光亮整洁，灵活好动，饮食正常，体质量持续增加，无死亡现象；糖尿病组、治疗组及对照组有不同程度的精神萎靡，活动减少，饮食减少，皮毛凌乱，体质量增长不明显或下降等表现。②以饱腹血糖> 16.7 mmol/L作为糖尿病大鼠造模成功的标准。
KL基因扩增及其载体构建：由正常SD大鼠肾组织提取Klotho基因。
目的基因的提取：取2 μL RNA溶液于高精度分光光度计检测吸光度值(A)，观察蛋白吸收峰值A260 nm/A280 nm、A260 nm/ A230 nm比值及连续波长吸收峰，并计算 RNA溶液浓度，以A260 nm/A280 nm> 2.0且< 2.3为标准。将提取出的RNA约 1 μg、Oligo(dT)18引物2 μL、焦碳酸二乙酯水10 μL放入离心管中，经离心处理后加入相关药品干浴得到cDNA。根据提取的目的基因序列设计扩增引物，通过PCR扩增体系进行KL基因扩增。
将KL基因克隆到pMD18-T载体，从37 ℃过夜培养平板上挑取白色克隆，接种于4 mL含有50 g/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 ℃ 220 r/min振荡培养过夜。用质粒提取试剂盒提取质粒，进行制粒制备并对重组质粒进行酶切鉴定。
腺病毒包装与载体构建：于液氮罐中取出冻存的293细胞，37 ℃水浴快速融化，然后将其接种于培养瓶中，加入DMEM 培养基(含体积分数10%胎牛血清)，待细胞生长成均匀单层细胞并达90%以上聚集度时传代。取4 μg DNA用培养基制成DNA 稀释液，将转染复合物加入到含有细胞和完全培养基的6孔板中，轻柔混匀，培养4-6 h后更换培养液，于37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中继续培养。待细胞长满培养皿，将细胞传代于25 cm2细胞培养皿中，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75 cm2细胞培养瓶中，观察出毒迹象。培养扩增 HEK293细胞，当细胞汇合度达到80%-90%时加入第1代病毒AD-rklotho，感染48 h后收集细胞，离心10 min收集病毒上清，病毒扩增至P3代后用腺病毒纯化试剂盒纯化P3代病毒。
病毒滴定可从AD- rklotho病毒样品中检测到3 405 bp的条带，表明目的基因已成功整合在病毒基因组中，见图1。

1.4 指标测定
样本采集：上述4组动物每周测1次血糖，造模后麻醉大鼠，每组取15只，打开腹腔, 腹主动脉采血，收集血清用于生化检测。取心脏组织，沿冠状沟向下将心脏分成两部分，上半部分浸泡于体积分数10%甲醛溶液中，下部分用液氮速冻，-80 ℃超低温冰箱内保存用于RT-PCR、Western Blot (免疫印迹试验)检测。
血清生化检测：使用血清脂蛋白试剂盒，血清分级沉淀后与相应试剂混合后离心，取上清液测定胆固醇。将RI用10 mL RII溶解，配成工作液，稳定10 min，96孔板中加入10 μL上清液再加入100 μL工作液，混匀后37 ℃反应 5 min，高密度脂蛋白酶标仪500 nm处测定A值，低密度脂蛋白520 nm处测定A值，计算高密度脂蛋白及低密度脂蛋白浓度。
冠状动脉切片染色：取大鼠冠状动脉进行切片，切片厚度为4 μm，经Masson染色后胶原纤维呈蓝绿色指示外膜，平滑肌呈鲜红色指示中膜，内弹性膜呈白色或无色，为中膜内膜的分界点；用测微尺计算各组内膜、中膜厚度。
1.5 主要观察指标造模后12周观察血清KL蛋白含量、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白浓度及冠状动脉内膜、中膜厚度比。
1.6 统计学分析数据采用x(_)±s标出，应用SPSS统计学软件进行处理(SPSS 19.0中文版)，对得到的数据进行两独立样本t 检验，设定P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

冠心病是动脉粥样硬化累及心脏动脉的结果，血管内膜增厚狭窄或阻塞，造成心肌供血不足而缺血缺氧或坏死，国内冠心病发病率逐年提高，现已成为城市及乡村人口重要死因之一^[6]。随着研究深入，冠心病的治疗手段不断创新，但冠心病的发病因素也日趋复杂，目前只能依靠终身服用药物对冠心病的发展进行遏制，新的治疗如基因治疗已成为当下研究的热门。
KL基因不仅是衰老相关性基因，与衰老相关病理改变有密切联系，同时也通过其分子机制对个体多种代谢进行干预，参与了冠心病、糖尿病的发生发展，使得KL基因的研究日趋受到重视。
大鼠KL基因与人类具有同源性(81%相似)，可以作为良好的实验素材，对临床具有相当指导性，SD大鼠又因具有较Wistar大鼠更强的抵抗力及短的生长周期而被应用于本实验。对大鼠进行实验性糖尿病造模，采用的是经典一次性大量腹腔注射链脲佐菌素的方式，因其对大鼠胰岛β细胞具有高度选择的毒性作用^[7]。一次性大量腹腔注射缩短了造模周期，较静脉注射有更高的安全性、较低的技术难度以及更低的副作用，较转基因及自发性糖尿病造模具有更好的稳定性，糖尿病自发缓解概率极低，实验中每组每周1次血糖检测，各组间血糖水平差异无显著性意义。与目前糖尿病大鼠造模不同的是，造模成功后各实验组继续给予高脂饮食，使大鼠形成高脂血症，采用含猪油、胆固醇、胆盐和丙基硫氧嘧啶的饲料，缩短了高脂血症形成的周期(10 d左右)，且稳定性较高，血脂水平稳定升高。这种糖尿病、高血脂的内环境，接近冠心病患者饮食习惯，同时使大鼠更易在短期(< 12周)内出现动脉粥样硬化。
KL基因对动脉粥样硬化具有抑制作用已在相关动物实验中得到体现^[8-11]，本实验中对照组和模型组大鼠与正常组大鼠的KL基因表达程度差异无显著性意义，但是出现了明显的冠状动脉粥样硬化，表明高血糖、高血脂对动脉粥样硬化有一定促进作用。治疗组大鼠KL蛋白相对其余各组有明显升高，动脉内膜却无统计学意义的增厚，可知在高血糖、高血脂的内环境下，KL基因仍能够正常表达，且表达增强可稳定发挥其抑制动脉粥样硬化的作用。
实验除了对各组KL蛋白量、冠状动脉中膜内膜厚度比对KL基因导入效果进行评估外，同时对动脉粥样硬化有重要影响作用的低密度脂蛋白、高密度脂蛋白进行检测。其中低密度脂蛋白结果可由以下两种因素产生：①糖尿病使血清低密度脂蛋白水平上升。②KL基因具有多态性^[12]，其G395A的3个位点表达强弱与低密度脂蛋白高低之间存在互为因果的关系。血清高密度脂蛋白在治疗组中显现出明显增高，根据外国学者Arking等^[13-14]研究指出，KL基因等位基因的FF位点表达增强可以带来高密度脂蛋白降低以及血压升高。
本实验中KL基因治疗组高密度脂蛋白水平高于阴性对照组及模型组，但与空白对照组相比升高幅度不大，这种结果也可能是阴性对照组及模型组高密度脂蛋白水平下降所致，已有研究证实在国内人口中，63%的冠状动脉粥样硬化患者同时存在低高密度脂蛋白血症^[15]。综上，KL基因对高密度脂蛋白血清水平有维持作用，对动脉粥样硬化有直接保护作用^[16-21]，但KL基因对低密度脂蛋白的影响尚未得到有统计学意义的结果，其对动脉粥样硬化的保护作用是否与影响低密度脂蛋白水平有关可进一步研究。
综上，KL基因导入大鼠取得的结果可为未来临床基因导入治疗提供支持，增加KL基因的表达也能够提供稳定、长期的保护效果，但对动脉粥样硬化形成的重要炎性介质方面的研究，也是KL基因下一步的研究重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程