人类软骨糖蛋白39诱导关节软骨祖母细胞的成软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.42.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明人类软骨糖蛋白39与骨关节软骨的退变与修复具有一定的关系，但其具体的作用机制并不十分明确。
目的：观察人类软骨糖蛋白39对成人膝关节软骨祖母细胞成软骨诱导分化的影响。
方法：取成人关节软骨，消化分离培养关节软骨祖母细胞；流式细胞仪检测传代细胞中能够表达CD105、CD166的细胞量并进行分离提纯。将分离的软骨祖母细胞采用单层培养法培养，传代培养至第2代后向分离培养所得的软骨祖母细胞中，分别经过含人类软骨糖蛋白39成软骨培养基及普通成软骨诱导培养基的诱导培养14 d后，通过免疫组织化学染色观察经诱导后细胞中Ⅱ型胶原的表达及通过大体组织学观察评估软骨的形成。
结果与结论：关节软骨组织中可以分离出能够表达CD105、CD166的关节软骨祖母细胞，软骨祖母细胞经过诱导分化后逐渐聚集并形成结节，经诱导后Ⅱ型胶原免疫细胞化学着色阳性，且经人类软骨糖蛋白39诱导细胞形成的结节更大，Ⅱ型胶原表达更多。结果表明，成人关节软骨中能够分离培养出具有成软骨分化能力的干细胞系细胞即软骨祖母细胞，且能够被定向诱导分化为软骨细胞，人类软骨糖蛋白39对其分化过程具有一定的促进作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 软骨祖母细胞, 人类软骨糖蛋白39, 成软骨分化

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that human cartilage glycoprotein-39 has a certain relationship to articular cartilage degeneration and repair, but the mechanism of action is not very clear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of human cartilage glycoprotein-39 on chondrogenesis of precartilaginous stem cells.
METHODS: Precartilaginous stem cells were isolated from the adult articular cartilage. Cells which could express CD105 and CD166 were detected using flow cytometry followed by isolation and purification. Isolated precartilaginous stem cells werecultured using monolayer method, and then, passage 2 cells were cultured in the medium containing human cartilage glycoprotein-39 and normal chondrogenic medium for 14 days, respectively. Immunohistochemical staining was used to observe expression of type II collagen and gross observation was
done for evaluation of cartilage formation.
RESULTS AND CONCLUSION: The precartilaginous stem cells isolated from the adult articular cartilage could express CD105 and CD166. After induction, differentiated precartilaginous stem cells gradually gathered and formed nudes. The induced cells were positive for type II collagen; after induction by human cartilage glycoprotein-39, the nodules became larger and the expression of type II collagen was increased. These findings indicate that precartilaginous stem cells with chondrogenic ability can be isolated from the adult articular cartilage, and can be induced to differentiate into chondrocytes, in which human cartilage glycoprotein-39 plays an important role.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Chondrocytes, Glycoproteins, Cartilage, Tissue Engineering

陈跃平，董盼锋，袁振中，饶毅，黎金焕，康杰，章晓云. 人类软骨糖蛋白39诱导关节软骨祖母细胞的成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(42): 6793-6797.

Chen Yue-ping, Dong Pan-feng, Yuan Zhen-zhong, Rao Yi, Li Jin-huan, Kang Jie, Zhang Xiao-yun. Human cartilage glycoprotein-39 induces chondrogenesis of precartilaginous stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(42): 6793-6797.

图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计单一样本观察。

1.2 时间及地点实验于2012年7月至2014年12月在广西大学生命科学实验中心实验室完成。

1.3 材料关节软骨标本取自1例因骨关节炎行关节置换的老年患者(女，61岁，左膝骨关节炎，行左膝人工关节置换)。供者对取材完全知情同意，在充分了解本治疗方案的前提下签署“知情同意书”，实验过程标本的取材同时受医院伦理委员的指导和监督。

1.4 方法

1.4.1 标本收集采集受试者股骨髁间窝非负重区的关节软骨标本，取得标本后即送往实验室，严格按照无菌要求剔除软骨组织上的软组织及血瘀块，并将其剪切成大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的软骨块，置于质量浓度为 40 g/L的多聚甲醛中固定5 d，再置于15%的EDTA溶液中脱钙4周。常规乙醇脱水，包埋，行厚度为5 μm的连续切片，通过苏木精-伊红染色与番红O染色。光镜下观察，每张切片选择3个不同视野，参照Mankin^[6-7]软骨病理评分标准进行评分。

1.4.2 软骨祖细胞的分离、培养与鉴定将软骨组织剪碎成2 mm×2 mm的小块，加入0.125%的胰酶消化，将消化处理后的软骨组织块重新剪碎成1 mm×1 mm的小块，平铺于含有H-DMEM培养基的培养瓶中，倒置培养4 h后翻瓶继续培养。

1.4.3 软骨祖母细胞的表型鉴定及分离培养将传至2代的细胞浓度调整为1×10¹¹L^-1进行培养，并行CD166和CD105抗原流式检测，确定软骨祖母细胞(CD166⁺和CD105⁺的细胞)的百分率后，对其再次进行扩大培养，细胞传至第3代时，采用流式分选的方法分离提取能够表达CD105/CD166的细胞(软骨祖母)并进行纯度检测。

1.4.4 成软骨诱导培养所得的软骨祖细胞采用单层培养法培养。传至第2代后，以2.5×10⁵细胞浓度分别接种于成软骨细胞诱导培养基和加入含500 μg/L的人类软骨糖蛋白39的成骨诱导培养基中培养。每2 d更换培养液1次。镜下观察细胞形态变化，诱导12 d后，重新胰酶消化、离心、计数，调整细胞浓度为2×10⁵ L^-1，吸取细胞悬液2 mL移置6孔培养板，孔底放置经多聚赖氨酸处理的载玻片1块，继续诱导培养行细胞爬片。

1.4.5 细胞免疫组织化学染色将传代细胞的细胞爬片取出后置于洁净培养皿中，PBS洗去培养液的细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min；PBS洗3次，5 min/次；0.2% Triton X-100处理5 min；PBS洗3次，5 min/次；体积分数10%正常山羊血清封闭30 min；一抗4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，5 min/次。HRP标记二抗(1∶200)室温湿盒避光孵育1 h；PBS洗3次，5 min/次；苏木青复染5 min；PBS洗1次，5 min，水洗2次，5 min/次；中性树脂封固。

1.5 主要观察指标 ①原代细胞及传代后形态观察。②软骨祖母细胞的流式分选及纯度检测结果。③免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达。④免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达。

讨论

干细胞或祖母细胞是一类特殊的细胞^[8-9]，是一群结构和功能未特化的原始细胞。是指那些具有长期更新和产生至少一种终末分化细胞能力的细胞。其主要的特点就是具有自我更新与多向分化潜能。自我更新指的是干细胞在细胞增殖过程中，细胞分裂后产生的细胞还保持原有干细胞的状态，且这种增殖能力保持长期存在；干细胞的另一个特点就是分化能力，即干细胞在特定条件下能够定向分化产生一种具有特殊结构及功能的终末细胞，如软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞和肌细胞等。间充质干细胞主要存在于骨髓和脐带血等组织中^[10]。但有研究发现在人类分化成熟的组织器官中同样存在间充质干细胞^[11]，这一发现也是对以往认为分化成熟的器官不可再生的颠覆。软骨细胞一直被认为关节软骨中仅存一种细胞类型，各种原因导致软骨损伤或缺损时都很难自然愈合。但研究表明在骨关节炎或类风湿性关节炎患者的关节滑液中含有未成熟间充质细胞的为特征性骨形态发生蛋白受体及typeI胶原的表达^[12]。同样有学者研究发现从人的关节滑膜中可以分离出具有成软骨分化潜能的细胞^[13]。当发生骨关节炎时，此类细胞的数量会有所增加，因此推测，这些具有分化潜能的细胞的存在对于软骨损伤的修复具有重要的作用。尤其是Alsalameh等^[14]的研究，首次证实了在成人的关节软骨中存在具有分化潜能的祖母细胞，且这些细胞在一定条件下可表达Ⅱ型胶原，说明这类细胞具有成软骨分化的能力，因而也被称为软骨祖细胞^[15]。

Ⅱ型胶原是由软骨细胞或类软骨细胞合成和分泌的，存在于胞浆和胞核，是生物体内透明软骨的主要结构组分，在软骨组织中，胶原占软骨质量的60%-80%，其中Ⅱ型胶原占胶原总量的90%，具有维持关节软骨的形态结构和抗张力强度的功能^[16-18]。Ⅱ型胶原的合成与分泌是软骨细胞维持其分化表型的特定指标，是评价人工培育的软骨组成结构和含量必不可少的重要指标，Ⅱ型胶原的表达正常与否亦是衡量软骨细胞去分化和表型异常的重要依据^[19-20]。

人类软骨糖蛋白39是壳质酶家族的一员。主要来源于关节软骨细胞、滑膜细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞，免疫组织化学表明人类软骨糖蛋白39(YKL-40)染色主要是在骨关节炎软骨的表层和中层，并不具备不具备壳质酶活性^[21]。有学者研究发现骨关节炎关节软骨细胞的凋亡程度与人类软骨糖蛋白39的表达呈正相关^[22]，在细胞培养中也发现人类软骨糖蛋白39对豚鼠软骨细胞和兔软骨细胞具有促有丝分裂作用，且具有剂量依赖性，说明人类软骨糖蛋白39在组织重塑过程中发挥一定的作用^[23]。

前期研究采用流式分选的方法对从成人关节软骨中分离提取的细胞进行检测^[5]，发现在成人的关节软骨中存在能够表达CD105及CD166的细胞，据此也进一步证实在成人的关节软骨中存在具有分化潜能的干细胞系即软骨祖母细胞的存在，并向软骨祖母细胞培养基中加入人类软骨糖蛋白39后，软骨祖母细胞的增殖明显增快，同样具有剂量依赖性。因此推测人类软骨糖蛋白39对于关节软骨来源的祖母细胞的分裂增殖具有一定的促进作用。

本研究在前期研究的基础上，向分离所得的软骨祖母细胞的培养基中加入特殊的成软骨诱导培养基，对其进行成软骨定向诱导培养，并对诱导后的软骨祖母细胞进行Ⅱ型胶原免疫组织化学检测时发现，经过诱导后的软骨细胞胞浆中Ⅱ型胶原的表达均为阳性，而经过人类软骨糖蛋白39作用后的Ⅱ型胶原表达更强。与单纯未加入人类软骨糖蛋白39的成软骨诱导培养基培养进行对比，软骨祖母细胞经成软骨诱导培养后的形态特征发生了改变，均可见细胞形态发生改变，呈聚集生长，并逐渐形成结节。但是经过人类软骨糖蛋白39诱导后的软骨祖母细胞培养基中形成的结节更大。这说明软骨组织来源的能够被诱导成软骨细胞，因此，推测人类软骨糖蛋白39对软骨祖母细胞的分化也具有一定的促进作用。

本课题的完成再次证实在成人关节软骨中存在一定的软骨祖母细胞，且软骨祖母细胞的成软骨分化能够受到人类软骨糖蛋白39的调节。这或许将为通过软骨移植来修复损伤的软骨提供可靠的种子细胞，且在移植同时加入一定量的人类软骨糖蛋白39，可能会增加软骨祖母细胞的成活及向软骨定向分化的概率，以更好的修复损伤的关节软骨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程