羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的体内生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.38.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：纯钛人工角膜支架在临床应用中的并发症发生率较高，因此寻找一种生物相容性高的人工角膜支架材料一直是国内外研究的重点和热点。

目的：观察羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的体内生物相容性。

方法：取新西兰白兔27只，制作右眼角膜碱烧伤模型，造模后立即均分为3组，实验组右眼植入经过羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架，对照组右眼植入人工角膜钛支架，空白对照组右眼仅制备囊袋而不植入支架。术后2，4，16周取兔右眼角膜组织，进行病理组织学观察及扫描电镜观察。

结果与结论：术后16周，3组间炎性细胞与纤维细胞数量比较差异均无显著性意义。随着时间的延长，实验组角膜组织逐渐增多，纤维组织逐渐增厚，细胞外基质附着逐渐增加，角膜组织贴附密集度、细胞外基质附着密集度及组织愈合度均优于对照组及空白对照组。表明羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架具有良好的生物相容性，可有效促进角膜细胞增生，有利于角膜血管化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 羟基磷灰石表面修饰法, 人工角膜, 钛支架, 生物相容性, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Artificial cornea titanium scaffold has a higher complication rate in clinical usage; therefore, to seek a kind of artificial corneal scaffold with high biocompatibility is a hot spot.

OBJECTIVE: To explore the biocompatibility of the artificial cornea titanium scaffold with hydroxyapatite surface modification.

METHODS: Twenty-seven New Zealand white rabbits were enrolled to make alkali burn models of the right cornea and then randomized into three groups: in experimental group, artificial cornea titanium scaffold with hydroxyapatite surface modification was implanted into the right eye; in control group, artificial cornea titanium scaffold was implanted into the right eye; in blank group, no scaffold was implanted into the right eye. At 2, 4, 16 weeks after implantation, the right corneas were taken out for pathological observation and scanning electron microscope observation.

RESULTS AND CONCLUSION: At 16 weeks after implantation, there was no difference in the number of inflammatory cells and fibroblasts among the three groups. Over time, in the experimental group, the corneal tissues, fibrous tissues and adhered extracellular matrices were increased gradually. In addition, the experimental group had more adherent corneal tissues, extracellular matrices and better tissue healing than the control and blank groups. These findings indicate that the artificial cornea titanium scaffold with hydroxyapatite surface modification had good biocompatibility that can effectively promote proliferation of corneal cells and corneal vascularization.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Durapatite, Cornea, Biocompatible Materials

中图分类号:

R318

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Wang Xue-mei, Zhao Qiu-fang, Wu Xiao-rong. Hydroxyapatite surface modification of artificial cornea titanium scaffold: in vivo biocompatibility[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(38): 6104-6108.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 27只兔均进入结果分析。
2.2 各组兔术后2周内的症状表现实验组、对照组兔在1周时均出现畏光、充血症状，饮食、活动均受到一定的影响；2周时两组畏光、结膜出血症状均消失，并且饮食和活动均恢复正常。空白对照组兔术后2周内的畏光、结膜充血症状不明显。
实验组水肿消退时间明显低于对照组和空白对照组 (P < 0.05)，对照组和空白对照组水肿消退时间差异不明显，见表1。
2.3 各组兔术后不同时间点的炎性细胞和纤维细胞数量比较术后2周时，实验组和对照组角膜炎性细胞浸润明显多于空白对照组(P < 0.05)，3组术后4，16周的角膜炎性细胞浸润两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明3组间的炎症反应无明显差异；术后2，4周时，实验组纤维细胞数量明显多于对照组、空白对照组(P < 0.05)，术后16周时3组间纤维细胞数量两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明各组纤维细胞增生差异不明显，见表2。

2.4 各组兔术后不同时间点的支架黏附角膜组织扫描电镜观察见图1。
术后2周时，对照组、空白对照组支架表面有少量的角膜纤维贴附，组织较薄，尤其是空白对照组角膜纤维贴附稀少；实验组支架表面局部角膜组织长入羟基磷灰石孔隙之中，近圆形细胞多见，组织较厚。术后4周时，实验组与对照组支架表面角膜纤维组织增厚，实验组角膜组织相较于对照组更为密集，并有大量角膜细胞外基质附着，组织愈合度更好；空白对照组角膜纤维组织相对于其他两组较稀薄。术后16周时，实验组、对照组支架表面细胞外基质进一步增多，在实验组支架表面贴附的细胞外基质更加紧密，愈合更加良好；空白对照组仅有少量细胞外基质，组织愈合度较差。

参考文献

引言

目前多种类型材料制作的人工角膜已用于临床，并使众多角膜盲患者重见光明^[1-2]。在1789年由法国眼科医生Pellierde Quensey首次提出人工角膜研究，其想法是用玻璃片代替混浊角膜^[3-4]。伴随着生物学和技术材料学的发展，人工角膜研究也在不断进步。人工角膜由中心镜柱及周边支架两部分组成。中国医学界对于人工角膜的研究工作起步较晚，是从20世纪60年代开始，虽然借鉴了国外人工角膜的经验，但与国外研究水平有明显差距^[5-6]。目前人工角膜的结构设计、支架材料、手术方法及人工角膜与宿主角膜组织间的生物相容性是国内外的研究重点^[7-8]。相关研究发现，人工角膜植入后出现大部分并发症的主要原因在于，支架和宿主角膜没能达到真正的生物愈合^[9-10]，因此寻找一种生物相容性高的人工角膜支架材料一直是国内外研究的重点和热点^[11-12]。
钛材料作为一种安全的生物种植材料被广泛应用于临床^[13-14]，但在人工角膜支架应用中仍然会发生各种并发症^[15-22]。羟基磷灰石是人体骨骼组织的主要无机组成成分，其植入体内后，钙和磷会游离出材料表面，被机体组织吸收，并生长出新的组织。有研究证明，羟基磷灰石的晶粒越细生物活性越高。牙齿表面珐琅质的主要成分亦是羟基磷灰石，因此羟基磷灰石具有较高的生物相容性。本次实验将羟基磷灰石作为人工角膜钛支架的表面修饰材料，观察其植入新西兰白兔角膜碱烧伤后的组织学变化，来探究羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的体外生物相容性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。
1.2 时间及地点于2014年5月至2015年1月在陕西中医药大学附属医院完成。
1.3 材料

实验动物：5-7月龄新西兰大白兔27只，雌雄不拘，体质量1.8-2.8 kg，由陕西中医药大学附属医院动物实验室提供并饲养。将27只兔随机均分为3组，分别为实验组、对照组与空白对照组。

实验中应用的试剂、支架及器械：人工角膜钛支架，由宝鸡市钛星金属有限公司生产，生产批号20140321；眼科手术显微器械，由苏州明仁医疗器械生产；眼科手术显微镜，采用德国进口的Muller FS2011 型眼科手术显微镜；速眠新Ⅱ号注射液，由解放军军事医学科学院军事兽医研究所提供；0.5%金霉素眼膏，由南京白敬宇制药有限责任公司生产，生产批号20140724。
1.4 方法

羟基磷灰石修饰人工角膜钛支架：首先将钛支架放置于无水乙醇、丙酮和去离子水中超声清洗约15 min，然后将清洗后的钛支架放置在混合酸(48%H₂SO₄ 100 mL + 18% HCl 100 mL)中1 h，再将钛支架放置在0.6 mol/L的NaOH溶液中(160 ℃)处理24 h；将试剂级的CaCl₂、NaH₂PO₄和NaHCO₃ 按10∶4∶3的比例溶于水，配制成过饱和钙磷溶液；将酸碱两步预处理好的钛支架用去离子水洗，然后浸入过饱和钙磷溶液中，在水浴沉积摇床中沉积1 d。
造模方法：首先采用氯胺酮和速眠新Ⅱ号(1∶1， 0.2 mL/kg)肌注麻醉3组兔，制作右眼角膜碱烧伤模型，造模后随即采用开睑器开眼睑，用2%庆大盐水冲洗结膜囊；在眼科手术显微镜下，在右眼角膜缘内约2 mm处做角膜板层切口，该切口应与角膜缘平行，弧长约8 mm，深度不超过角膜全层的2/3；之后使用板层刀来分离板层，然后制成直径8 mm左右的口袋，实验组植入羟基磷灰石修饰的人工角膜钛支架，对照组植入人工角膜钛支架，确保人工角膜尽量位于角膜的中央位置；空白对照组不植入任何物质。最后采用10-0尼龙线间断缝合角膜切口，采用0.5%金霉素眼膏涂擦结膜囊，1次/d。
1.5 主要观察指标 ①观察记录3组兔在术后2周内的症状。②术后2，4，16周时，每组随机选择3只，进行组织病理学观察，观察角膜炎性细胞与成纤维细胞数量。③术后2，4，16周时，每组随机选择3只，扫描电镜观察支架表面角膜组织黏附情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对研究中得到数据进行统计学分析，计量资料采用t 检验，计数资料采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

对于严重的眼角膜疾病而导致双目失明的患者来说，进行人工角膜移植是其重见光明的希望。目前多种类型材料的人工角膜已用于临床，并使众多角膜盲患者得到较好的治疗效果^[23-24]。以往应用于人工角膜材料如合金、涤纶、碳纤维等，植入后都会出现不同程度的并发症，效果并不理想^[25-26]。人工角膜出现并发症的主要原因在于，支架部和宿主角膜没能达到真正的生物愈合^[27-28]。因此寻找一种生物相容性高的支架材料一直是国内外人工角膜研究的重点和热点。钛材料作为一种安全的生物种植材料被广泛应用于临床，但提高其生物相容性仍是重点。材料的生物相容性主要依赖其表面特性，所以提高材料的表面活性可有效提高材料的生物相容性^[29-31]，而表面修饰法是目前最常用提高材料表面活性的方法，并已成为人工角膜研究的重点。表面改性法指在支架材料表面固定活性物质，从而提高支架材料表面活性的方法^[32-33]。羟基磷灰石是具有微孔结构的硬性材料，其主要化学成分为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ ，类似于人体骨骼的无机成分，具有较高的生物相容性，所以成为提高支架材料表面活性的常用材料^[34-35]。但是纯羟基磷灰石质硬、较脆，可塑性较差，单独作为人工角膜支架应用时无法承受眼睑的压力而容易破裂，所以本次研究将羟基磷灰石和钛支架结合作为研究材料。
本次实验将羟基磷灰石作为人工角膜钛支架的表面修饰材料，进行新西兰白兔角膜碱烧伤体内实验，来探究羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的体外生物相容性。研究结果显示，实验组、对照组兔在1周时均出现畏光、充血症状，饮食、活动均受到一定的影响；2周时两组畏光、结膜出血症状均消失，并且饮食和活动均恢复正常；实验组水肿消退时间明显高于对照组和空白对照组，对照组和空白对照组水肿消退时间差异不明显。术后2周时，实验组角膜炎性细胞数量明显多于对照组和空白对照组(P < 0.05)，术后4，16周时3组角膜炎性细胞数量差异不明显(P > 0.05)，说明3组间的炎症反应无明显差异；术后2，4周时，实验组纤维细胞数量明显多于对照组、空白对照组(P < 0.05)，说明实验组纤维细胞增生较显著，术后16周时3组纤维细胞数量差异不明显(P > 0.05)，说明各组间纤维细胞增生差异不明显。术后2周时，对照组支架表面局部有少量的角膜纤维贴附，但组织较薄；实验组支架表面出现局部的角膜组织长入羟基磷灰石孔隙之中，近圆形细胞多见，而且组织较厚。术后4周时，实验组、对照组表面角膜基质相对于2周时数量明显增多了，而且纤维组织增厚；实验组相较于对照组支架表面角膜组织更为密集，并用大量角膜细胞外基质附着，组织愈合度更好。术后16周时，实验组、对照组支架表面细胞外基质进一步增多，但实验组较对照组贴附更加紧密，愈合更加良好。分析相关原因：因为羟基磷灰石能够有效促角膜成纤维细胞的黏附，其机制是羟基磷灰石在宿主血清或者组织中，可以吸收细胞生长因子和可溶性的黏附分子^[36-37]，使这些分子的构象发生改变，并暴露出细胞结合区，在材料与组织整合过程中，羟基磷灰石会对细胞因子产生恰当反应，有效促进宿主组织分化和基质沉积。综上，羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架，一方面保持了钛支架原有的硬度及柔韧性，另一方面可有效促进角膜细胞增生、黏附及分泌细胞外基质，有利于角膜血管化。羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架与宿主的生物相容性较高，有作为人工角膜周边材料进一步研究的价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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