干扰素抗MGMT阳性胶质瘤干细胞替莫唑胺的耐药机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：临床对胶质瘤患者进行治疗的过程中容易出现耐药现象，研究发现，MGMT是胶质瘤表达的一种多药耐药基因。

目的：探讨干扰素增加替莫唑胺对MGMT阳性胶质瘤干细胞的增敏作用。

方法：采用“悬浮克隆球形成法”对胶质瘤细胞株U251、SKMG-4进行诱导，获得MGMT阳性的胶质瘤干细胞U251G、SKMG-4G。应用CCK-8法检测干扰素α/β联合替莫唑胺对MGMT阳性胶质瘤干细胞的杀伤效应；RT-PCR和Western blot检测预用干扰素α/β后MGMT阳性胶质瘤干细胞MGMT、NF-κB表达情况。

结果与结论：经Western blot检测，胶质瘤干细胞U251G、SKMG-4G中MGMT蛋白呈阳性表达。采用预用干扰素α/β，然后添加替莫唑胺方式，提高了替莫唑胺的化疗敏感性，杀伤效应显著提高。使用干扰素α/β之后，SKMG-4G和U251G MGMT、NF-κB mRNA和蛋白表达均显著降低，联合替莫唑胺之后下降情况更明显。结果表明对于MGMT阳性胶质瘤干细胞，干扰素α/β可以显著增强替莫唑胺的杀伤效应，逆转替莫唑胺的耐药性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胶质瘤, 胶质瘤干细胞, 干扰素, 替莫唑胺, 化疗, 耐药性, O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶

Abstract:

BACKGROUND: It is easy to appear the phenomenon of drug resistance in the treatment of patients with glioma, and O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) is a kind of multidrug resistance gene expressed in glioma.

OBJECTIVE: To investigate the role of interferon to increase the sensibilization of MGMT positive glioma stem cells to temozolomide in vitro.

METHODS: Glioma cell lines, U251 and SKMG-4, were induced by suspended cloning ball formation method to harvest MGMT positive glioma stem cells, U251G and SKMG-4G. Cell counting kit-8 assay was used to detect the killing effect of interferon α/β combined with temozolomide on MGMT positive glioma stem cells. RT-PCR and western blot assay were employed to determine the expression of MGMT and nuclear factor κB in MGMT positive glioma stem cells.

RESULTS AND CONCLUSION: Western blot results showed positive expression of MGMT in U251G and SKMG-4G cells at protein levels. After intervention with interferon α/β, the mRNA expression of MGMT and nuclear factor κB in SKMG-4G and U251G cells was reduced significantly, and then further decreased after temozolomide treatment. These findings indicate that interferon α/β can remarkably strengthen the killing effect of temozolomide on MGMT positive glioma stem cells.

Key words: Glioma, Neoplastic Stem Cells, Interferons, O(6)-Methylguanine-DNA Methyltransferase

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

2.1 胶质瘤干细胞培养与鉴定结果原代培养两三天，可观察到培养液中存在大量呈悬浮生长状态的“细胞球体”(图1)。连续培养7 d，免疫细胞化学染色观察到该“细胞球体”中主要为Nestin阳性细胞(图2)。对“细胞球体”进行血清诱导，可观察到其发生分化(图3)，分化后的细胞可呈现出NSE(图4)和GFAP(图5)阳性表达。经流式细胞仪检测，可得“细胞球体”中CD133阳性细胞所占百分比达到99%以上(图6)。

从2株人胶质瘤细胞株(U251，SKMG-4)中成功获得在无血清干细胞培养基中呈球状生长的胶质瘤干细胞，分别命名为U251G，SKMG-4G。 2.2 胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞MGMT蛋白表达水平经Western blot检测，胶质瘤细胞U251、SKMG-4 MGMT蛋白均呈现出阴性表达，胶质瘤干细胞U251G和SKMG-4G MGMT蛋白均呈现出阳性表达(图7)。 2.3 干扰素对替莫唑胺的化疗增敏作用经CCK-8法检测可以发现，使用替莫唑胺单药疗效不佳，杀伤效应均在20%以下，干扰素单药也显示出大约10%的抗肿瘤杀伤效应。采用预用干扰素处理细胞，然后添加替莫唑胺方式，则杀伤效应可显著提高，达到60%左右，与各单药组相比，差异有显著性意义(P < 0.05，图8)。 2.4 干扰素α/β作用后对胶质瘤干细胞中MGMT、NF-κB mRNA表达水平的影响预先使用干扰素α/β之后，SKMG-4G和U251G MGMT、NF-κB mRNA表达降低，联合替莫唑胺之后降低更明显。替莫唑胺单药组MGMT mRNA表达出现一定的降低，但NF-κB mRNA表达未出现明显变化(图9)。 2.5 干扰素α/β作用后对胶质瘤干细胞中MGMT、NF-κB蛋白表达的影响预先使用干扰素α/β之后，胶质瘤干细胞SKMG-4G和U251G中MGMT、NF-κB蛋白表达水平下降；联合替莫唑胺之后，MGMT蛋白表达水平下降情况更明显，甚至检测不到。而替莫唑胺单药组MGMT 蛋白表达出现一定的下降，但NF-κB蛋白表达未出现明显变化(图10)。

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引言

脑胶质瘤是一种常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤，常规手术治疗无法彻底根治，容易导致术后复发^[1]。因此，术后需要积极的进行化疗治疗，以进一步消灭肿瘤细胞，提高预后。现如今，烷化剂类化疗药物已广泛应用于治疗脑、头颅、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等组织和系统恶性肿瘤。烷化剂类药物主要攻击细胞的DNA，造成DNA烷基化损伤，进而导致细胞死亡。替莫唑胺属于一线烷化剂类化疗药物，是一种常用的抗肿瘤药物，可以用于联合放射治疗新诊断的成人多形性成胶质细胞瘤，在临床治疗过程中可以进行维持用药^[2]，但长期服用替莫唑胺胶囊产生耐药，无法获得理想的治疗效果。细胞内有许多活性蛋白和酶可以使化疗药物对肿瘤细胞的攻击和造成的损伤得到修复，是肿瘤细胞对药物产生耐药性的根本原因。如果无法有效解决临床耐药问题，势必会对最终的化疗效果产生不同程度的影响，最终导致化疗失败，肿瘤耐药已成为抗肿瘤治疗中一个严峻且迫切需要解决的问题。肿瘤耐药的机制十分复杂，涉及到多方面的因素，包括化疗药物摄取量下降和排出量增加以及活化下降，DNA损伤途径增多和DNA甲基化以及信号传导通路异常等。O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)即为一种重要的类型，属于DNA修复酶，可导致烷化剂类药物耐药^[3]。如果可以采取有效措施实现MGMT活性的下降，则可以有效减少临床耐药的出现，提高治疗效果。干扰素是一类特殊的细胞因子，由多种细胞产生，具有一定的抗肿瘤活性和抵抗病毒感染以及免疫调节作用^[4]。以往有研究表明，在胶质瘤的化疗过程中，干扰素α/β可以发挥出一定的增敏作用^[5]。本实验选择体外分离、培养胶质瘤干细胞等方式，对干扰素抗MGMT阳性胶质瘤干细胞替莫唑胺化疗耐药机制进行分析，为临床治疗提供一定的参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年5至6月在衡水市人民医院实验室完成。

1.3 材料细胞及人脑胶质瘤细胞U251、SKMG-4由衡水市哈励逊国际和平医院实验室提供。

干扰素抗MGMT阳性胶质瘤干细胞替莫唑胺化疗耐药机制分析所用主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
细胞总RNA提取试剂盒	上海弘顺生物科技有限公司
RT-PCR二步法试剂盒	杭州纽罗西敏生物科技有限公司
MGMT、NF-κB引物	上海瑞齐生物科技有限公司
小鼠抗人MGMT、NF-κB单克隆抗体	上海拜力生物科技有限公司
小鼠抗人β-actin抗体	南京森贝伽生物科技有限公司
CCK-8试剂盒	上海哈灵生物科技有限公司
替莫唑胺	上海恒远生物技术发展有限公司
胎牛血清	上海源叶生物科技有限公司
干扰素	上海锐谷生物科技有限公司
光学显微镜	深圳市海量光电有限公司

1.4 实验方法

1.4.1 胶质瘤干细胞培养与鉴定在含有胎牛血清的DMEM培养液中进行人脑胶质瘤细胞U251、SKMG-4培养，每2 d换液1次。选取生长状态良好、融合率为70%左右的细胞，用胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次，加入无血清干细胞培养基(含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子以及多聚赖氨酸)。将细胞原代培养两三天，利用显微镜观察培养液中的“细胞球体”生长状态，连续培养7 d，进行后续实验。

1.4.2 Western blot法检测胶质瘤细胞及胶质瘤干细胞MGMT蛋白表达收集胶质瘤细胞U251、SKMG-4及诱导所得胶质瘤干细胞进行总蛋白提取，采用10% SDS-PAGE凝胶电泳后，转印到PVDF膜上，使用一抗稀释度鼠抗人MGMT抗体4∶125，以鼠抗人β-actin抗体1∶1 000为内参照，山羊抗鼠 IgG为二抗(1∶1 000)，进行化学发光法ECL显影。

1.4.3 CCK-8检测干扰素对替莫唑胺的化疗增敏作用将诱导所得两种胶质瘤干细胞制备成单细胞悬液接种于96孔板，接种密度每孔5 000个，接种悬液体积190 μL，分为对照组、替莫唑胺单药组、干扰素单药组、干扰素+替莫唑胺组，每组设3个复孔。接种24 h后，添加100 U/mL干扰素α/β，接种48 h之后添加500 μmol/L替莫唑胺，接种96 h后每孔添加20 μL CCK-8溶液孵育4 h，利用酶联免疫监测仪选择490 nm波长测定各孔吸光度值。

1.4.4 RT-PCR检测干扰素作用后胶质瘤干细胞MGMT、NF-κB mRNA表达情况制备U251、SKMG-4胶质瘤干细胞悬液，接种于6孔板上，接种细胞浓度为2×10⁸ L^-1。设置对照组、干扰素单药组、替莫唑胺单药组、干扰素+替莫唑胺组，每组3个复孔。接种24 h之后添加100 U/mL干扰素α/β，接种48 h之后添加500 μmol/L替莫唑胺，接种96 h之后分别提取各组细胞总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA进行PCR反应。

1.4.5 Western blot检测干扰素作用后胶质瘤干细胞MGMT、NF-κB蛋白表达情况制备U251、SKMG-4胶质瘤干细胞悬液，接种于6孔板上，接种细胞浓度为2×10⁸ L^-¹。设置对照组、干扰素单药组、替莫唑胺单药组、干扰素+替莫唑胺组，每组3个复孔。接种24 h之后添加100 U/mL干扰素α/β，接种48 h之后添加500 μmol/L替莫唑胺，接种96 h之后分别提取各组细胞总蛋白，利用Western blot法检测干扰素作用后胶质瘤干细胞MGMT、NF-κB蛋白表达情况。

1.5 主要观察指标 ①胶质瘤干细胞培养与鉴定结果。②胶质瘤干细胞MGMT蛋白表达水平和干扰素对替莫唑胺的化疗增敏作用。③干扰素作用后胶质瘤干细胞中MGMT、NF-κB mRNA和蛋白表达水平。

1.6 统计学分析所有研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件，并进行处理。计量资料符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肿瘤的形成是因为人体自身的免疫系统遭受破坏，导致体内部分细胞不断扩大增殖进行分裂最终形成肿瘤。肿瘤细胞有很强的浸润性，它可通过血液或淋巴系统向周边正常组织进行转移，形成其他的病变。脑胶质瘤是中枢神经系统最常见而又最难治愈的恶性脑肿瘤，患者临床表现主要为头痛、恶心、呕吐及视力障碍等，其他还有癫痫、眩晕、外展神经麻痹及行为和性格改变等。尽管随着现代科技的进步，胶质瘤的治疗方法有了一定的提高，但是临床对脑胶质瘤患者进行治疗的过程中，受到肿瘤浸润性生长特点的影响，其与正常组织边界不清，而且胶质瘤细胞对放疗敏感性较差，通过常规手术和放射治疗无法彻底消除肿瘤，极易出现术后复发现象^[6-7]。大多数中枢神经系统恶性肿瘤不能全切或者复发都可以选择化疗，通过化疗，可以对残留肿瘤细胞予以进一步消除，提高治疗效果，消灭手术后残余的肿瘤细胞^[8]。替莫唑胺是一种常用于治疗脑质瘤的药物^[9]，具有很好的亲脂性，属于第二代烷化剂化疗药，可以通过DNA甲基化诱导细胞凋亡^[10-12]。经过大量的临床研究发现，受到胶质瘤耐药性的影响，在进行替莫唑胺化疗治疗过程中，无法获得理想的效果^[13-16]。临床在对各种恶性肿瘤进行治疗的时候，采用的治疗方法所针对的大多是肿瘤组织中的绝大多数细胞^[17]。肿瘤干细胞占肿瘤细胞的0.01%-1%，具有无限自我更新潜能、高增殖、耐药特性，是肿瘤组织形成、复发和转移的根源^[18-23]。常规治疗方法只能对部分肿瘤细胞产生不同程度的杀伤，对肿瘤干细胞却没有影响。一些恶性肿瘤患者在接受常规治疗之后，即便获得一定的临床效果，肿瘤组织出现一定的消退^[24]，但经过一段时间治疗之后，未被杀伤的肿瘤干细胞便会发挥作用，导致肿瘤的再次形成，即临床常见的恶性肿瘤转移或者复发等^[25-26]。本次实验过程中，对胶质瘤细胞进行两三天的原代培养之后，可观察到在培养液中存在大量呈悬浮生长状态的“细胞球体”。经免疫细胞化学染色，该“细胞球体”中主要为Nestin阳性细胞。对“细胞球体”进行血清诱导，可观察到其发生分化。经分离培养得到的细胞均存在CD133以及Nestin阳性表达的情况，并具有一定的自我更新以及多分化潜能。而分化后的细胞可呈现出NSE和GFAP阳性表达。经流式细胞仪检测，可得“细胞球体”中CD133阳性细胞所占百分比达到99%以上。经鉴定，符合胶质瘤干细胞的基本特征。干扰素是一类特殊的细胞因子，具有抗病毒、抑制细胞增殖、调节免疫，能增强自然杀伤细胞(NK细胞)和杀伤细胞(K细胞)的杀伤活性，从而起到调节免疫监视的功能。在低浓度时可明显促进B细胞分泌IgG抗体，增强组织相容抗原和外周血单核细胞表面FC受体的表达，抑制淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的细胞毒活性，调节免疫自身稳定功能等。干扰素也可以发挥出有效抑制肿瘤生长等作用^[27]。邱晓昕等^[28]认为α-干扰素可以与环氧合酶2抑制剂塞来昔布发挥出较强的协同作用，共同对体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞生长产生有效的抑制。干扰素的抗肿瘤作用在于它既可直接抑制肿瘤细胞的生长，又可通过免疫调节发挥作用^[29-30]。Colman等^[31]通过研究报道，对胶质母细胞瘤患者，在手术治疗之后的放疗治疗过程中，予以干扰素β治疗可以获得更好的效果，患者生存明显受益。 NF-κB家族及其介导的细胞信号转导通路与肿瘤的发生以及发展等之间存在十分密切的关系，广泛调控着人类免疫和炎症反应中一系列基因的表达，同时也对肿瘤的发生发展有着重要作用^[32-35]。而且，NF-κB信号通路的异常激活是导致肿瘤产生转移和化疗耐药的重要原因之一^[36]。通过实验还发现，预先使用干扰素α/β之后，SKMG-4G和U251G MGMT、NF-κB mRNA和蛋白表达均出现下降，联合替莫唑胺之后下降情况更明显。替莫唑胺单药组MGMT mRNA和蛋白表达出现一定的下降，但NF-κB mRNA表达未出现明显的下降。分析出现这一结果的原因，可能因为通过使用干扰素α/β可以对NF-κB蛋白的表达水平予以有效的下调，降低了MGMT的转录表达，从而促进替莫唑胺抗肿瘤效应的显著提高，与国内其他一些学者实验结果基本一致^[37]。通过实验还发现，使用替莫唑胺单药杀伤效应均在20%以下，干扰素α/β单药也具有大约10%的抗肿瘤杀伤作用。如果采用预用干扰素α/β，然后添加替莫唑胺方式，则杀伤效应可显著提高，达到60%左右，较之替莫唑胺单药治疗，杀伤效应显著提高，提示MGMT阳性表达仅为胶质瘤干细胞耐药的原因之一，除此之外，可能还存在其他耐药机制^[38]。因此，关于MGMT信号传导与肿瘤耐药相关问题，还有待进一步分析。综上所述，对于MGMT阳性胶质瘤干细胞，干扰素α/β可以显著增强替莫唑胺的杀伤效应，逆转替莫唑胺的化疗耐药机制。虽然目前关于MGMT生物学作用机制及其与干扰素、肿瘤耐药性等之间的研究还不够全面和深入，但可以预期的是干扰素和MGMT相关研究在肿瘤治疗中具有重要的应用前景。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程