雌激素诱导干细胞成骨研究新进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.022

摘要/Abstract

摘要：

背景：雌激素与人体正常骨代谢有紧密联系，并可以为干细胞诱导成骨提供有利条件。
目的：文章就雌激素在多种干细胞诱导成骨中的应用情况及其作用机制、安全性、效果、优缺点、突出特性等进行综述。
方法：由第一作者应用计算机检索PubMed数据库，以“estrogen，bone marrow mesenchymal stem cells，adipose derived stem cells，embryonic stem cells，osteogenesis”为检索词；应用计算机检索CNKI数据库、万方数据库以“雌激素，骨髓间充质干细胞，脂肪干细胞，胚胎干细胞，诱导成骨”为检索词。
结果与结论：最终纳入50篇文献进行分析。雌激素在人体中是最重要的内分泌激素，在干细胞诱导成骨的研究中是一种安全有效的诱导剂，促进干细胞增殖与成骨分化，并在不同干细胞上表现出来的作用特点不同。其主要作用机制为：直接作用于位于干细胞上的雌激素受体发挥作用，也可以诱导产生各种细胞因子间接影响细胞增殖与分化。雌激素的浓度等级、干细胞上雌激素受体基因的编码调控表达转录、构建细胞支架等尚存在一定的争议，需进一步研究。

关键词: 干细胞, 干细胞学术探讨, 骨髓间充质干细胞, 脂肪干细胞, 胚胎干细胞, 雌激素, 雌激素受体, 诱导成骨, 细胞因子, 组织工程, 综述文献

Abstract:

BACKGROUND: Estrogen is closely related to normal bone metabolism in human body and provides favorable conditions for osteogenic differentiation of stem cells.
OBJECTIVE: To summarize the application, mechanism of action, safety, efficacy, advantages/disadvantages, and characteristics of estrogen in inducing osteogenic differentiation of various stem cells.
METHODS: A computer-based online retrieval of PubMed, CNKI and Wanfang databases was performed for searching papers using the key words “estrogen, bone marrow mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, embryonic stem cells, osteogenesis” in English and Chinese.
RESULTS AND CONCLUSION: Fifty papers were suitable for final analysis. Estrogen is the most important endocrine hormone. It is a safe and effective inducing agent used in the osteogenic differentiation of stem cells, promotes the proliferation and differentiation of stem cells and exerts different actions on stem cells. Estrogen directly influences on the estrogen receptor of the stem cells and also directly influences cell proliferation and differentiation by inducing the production of various cytokines. Nevertheless, there are some uncertainties, including estrogen level, estrogen-target gene expression and transcription on stem cells, and cell-scaffold reconstruction, which should be further studied.

Key words: stem cells, stem cell academic discussion, bone marrow mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, embryonic stem cells, estrogen, estrogen receptor, osteoinductive, cytokine, tissue engineering, review literature

中图分类号:

R318

吕炜亮，廖毅，童庭辉. 雌激素诱导干细胞成骨研究新进展[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(14): 2617-2624.

Lü Wei-liang, Liao Yi, Tong Ting-hui. Research progress in osteogenic differentiation of stem cells induced by estrogen[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(14): 2617-2624.

图/表（结果） 1

2.1 雌激素诱导骨髓间充质干细胞成骨的研究成果 骨髓间充质干细胞位于成体骨髓中，是成骨细胞与破骨细胞的祖先。具有强大的增殖能力及多向分化潜能。在不同的诱导条件下, 可使其向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成肌细胞、神经细胞等方向分化^[5-7]。作为最主要的骨组织工程种子细胞已经广泛应用。

在对雌激素与骨代谢的研究中发现，骨髓间充质干细胞的终末分化细胞：成骨细胞与破骨细胞均已发现雌激素受体表达。提示在骨髓间充质干细胞上可能存在雌激素受体。张进等^[7]证实了在骨髓间充质干细胞上确实存在雌激素的受体，并且雌激素可直接通过其受体作用于骨髓间充质干细胞。体内具体影响过程是雌激素通过血液循环到达骨, 与骨髓间充质干细胞内的雌激素受体作用，促进细胞基因转录合成骨形态发生蛋白2。骨形态发生蛋白2具有高度诱导成骨的活性,通过自分泌或旁分泌的方式促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化^[8]。

间充质干细胞是骨生长和骨修复的细胞来源，成骨细胞由骨髓间充质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来，调控因素主要有骨形态发生蛋白，骨形态发生蛋白能促进间充质干细胞向成骨细胞的分化和骨基质的形成，而雌激素对成骨细胞的分化发挥重要的介导作用。

张晓丽^[9]总结了雌激素在骨髓间充质干细胞中的表达和作用。在骨重建的过程中，雌激素分泌入血液，通过血液循环到达骨，与间充质干细胞内的雌激素受体作用，促进细胞转录并合成骨形态发生蛋白2，骨形态发生蛋白2在局部以自分泌或旁分泌的方式进而促进间充质干细胞向成骨细胞分化。在促进骨髓间质干细胞成骨细胞的分化同时阻止骨髓脂肪细胞的生成。绝经期妇女，雌激素水平下降，使间充质干细胞向成骨细胞分化的能力降低而向脂肪细胞分化增强，即骨量减少和骨髓中的脂肪组织增多同时发生，从而引起的骨丢失导致骨髓腔增大，骨皮质变薄，小梁骨量减少，最终引发骨质疏松。此外，骨重建的速率由骨吸收和骨形成的循环数决定，骨量则取决于每个循环中骨吸收和骨形成是否平衡。近年的研究表明雌激素缺乏可降低成骨细胞从其前体细胞分化的速率，从而使骨重建循环的次数减少，导致骨量减少。

长期以来骨髓间充质干细胞的体外培养是一个难题。因为其分化后数量及能力的损失，体外有限的扩增数量，以及体内识别的困难，限制了其实际应用。Gopalakrishnan 等^[10]通过对糖尿病导致的骨质疏松进行实验研究，证明胰岛素和雌二醇能控制高浓度葡萄糖对骨髓源性基质细胞成骨细胞的增殖和功能的有害影响。DiSilvio等^[11]通过实验测试证实了雌激素能刺激人类初级成骨细胞或人骨髓间充质干细胞增殖，但是对于人骨髓间充质干细胞的增殖影响可能存在高剂量依赖性，这需要进一步证明。接着Hong等^[12-14]对雌激素诱导骨髓间充质干细胞进行了进一步研究，先是以17β-雌二醇和地塞米松作为培养骨髓间充质干细胞的调节器，并按照浓度不同进行分组。通过MTS法测定细胞增殖数，ELISA及PCR评估成骨标志物和类固醇相关的生长因子转化生长因子β1与骨形态发生蛋白7，检查骨髓间充质干细胞的成骨细胞增殖和分化情况。发现雌激素作用后骨髓间充质干细胞的增殖与分化的情况有所提高。提出类固醇可能作为一有效诱导剂促进干细胞的骨再生能力的结论。为改善和优化骨髓间充质干细胞骨再生并为今后的临床应用提供了重要的信息。

紧接着将雌二醇应用在体外培养人类骨髓间充质干细胞中，并对细胞增殖数、细胞标志物，细胞分化后成骨细胞与脂肪细胞进行检验、实验表明雌二醇的补充能保持干细胞的增殖维持细胞分化特征。证明了在改善人类骨髓间充质干细胞体外扩张中雌激素可以发挥重要作用。提出了在实际组织工程应用中雌激素能有效地促进骨髓间充质干细胞增殖及分化的设想。但是在此实验中雌激素作用的时间短，而且也非持续作用于骨髓间充质干细胞。为了解决这个问题，Hong等制备了具有负载雌二醇的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物颗粒。此聚乳酸-聚乙醇酸共聚物颗粒可以保持长达7 d雌二醇释放。将聚乳酸-聚乙醇酸共聚物应用于体外培养人类骨髓间充质干细胞，主要检验了成骨分化标记碱性磷酸酶和骨钙素，发现人骨髓摄取共聚物微粒的雌二醇后碱性磷酸酶及骨钙素显著上调。此实验为骨髓间充质干细胞体外培养建造了一个持续雌激素释放的微环境，一部分模拟了体内干细胞生长环境。比起以往的实验更加有说服能力，而且为干细胞体内移植提供了参考信息。

LIM矿化蛋白是近期发现的诱导成骨细胞分化成熟的细胞内信号因子，促进称骨细胞分化和骨形成，其中LIM矿化蛋白1有诱导成骨能力。杨军等^[15]从切除卵巢的小鼠骨髓中提取骨髓间充质干细胞，建立实验进行成骨诱导，对各组LIM矿化蛋白1的mRNA表达进行测定，证实加入雌二醇的实验组中LIM矿化蛋白1的mRNA表达显著高于未处理组。由于长期的体内雌激素不足，骨髓间充质干细胞表现出较低的增殖率与成骨能力^[16]。Chen等^[17]通过从患有骨质疏松症的绝经后妇女髂骨中提取骨髓间充质干细胞，通过实验检验证实雌二醇通过雌激素受体α增强成骨活性。最新研究表明雌激素不仅能促进骨髓间充质干细胞的增殖还能抑制骨髓间充质干细胞的细胞凋亡，主要机制是通过保护线粒体跨膜电位，减少细胞凋亡抗体caspase-9，c-Jun氨基端激酶(JNK1/2)和原癌基因c-Jun蛋白的表达进而在细胞线粒体死亡途径和JNKs途径发挥抗凋亡的作用同时上调抗凋亡基因Bcl-x(L)和Bcl-2的表达降低骨髓间充质干细胞凋亡率^[18-20]。
雌激素通过直接间接作用于骨髓间充质干细胞从而在诱导骨髓间充质干细胞成骨中体现出促进骨髓间充质干细胞增殖，维持骨髓间充质干细胞特性，提高骨髓间充质干细胞成骨能力，并且还有抗细胞凋亡的作用。推论出雌激素能作为一个有效的抗细胞凋亡及诱导剂应用在骨髓间充质干细胞诱导成骨中。

2.2 雌激素诱导脂肪干细胞成骨的研究成果 脂肪干细胞由Zuk等^[21]首次报道，是近年来从脂肪组织中分离得到的与成纤维细胞样细胞和骨髓间充质干细胞形态相似的一种具有多向分化潜能的干细胞。脂肪干细胞经过一定的定向培养后，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、内皮细胞等成熟组织细胞^[22]。聂绪强等^[23]就脂肪干细胞的不同培养方法、诱导分化及最新的临床应用进行阐述。由于脂肪干细胞具有储备量大，提取容易, 提取部位广，机体损伤小，增殖速度快等特点,受到越来越多的关注，尤其是在骨与软骨组织工程上^[24]。有研究表明雌激素可以调节脂肪干细胞的分化并且可能改善脂肪干细胞为基础的组织工程及再生^[25]。

脂肪源间充质干细胞与骨髓间充质干细胞同样来至于中胚层，并且在脂肪干细胞上已发现雌激素受体的表达^[26]。提示雌激素能通过受体作用于脂肪干细胞。Dudas等^[27]报道了脂肪干细胞在成骨上的潜力，并且提出雌激素信号与其成骨机制有关的结论。陈昕等^[28]观察了雌激素对诱导老年大鼠脂肪干细胞体外增殖和成骨分化的影响，通过MTT法测试，骨茜素红染色，RT-PCR检测，证明17-β雌二醇能增强老年大鼠脂肪干细胞体外增殖与诱导成骨分化能力。贾竹亭等^[29]开展了雌激素诱导新西兰兔脂肪组织来源的干细胞成骨的实验。首先建立了不同雌激素浓度培养的脂肪干细胞组，在光镜下观察不同组细胞形态、生长特性和碱性磷酸酶染色后反应，证明培养出成骨细胞。然后进一步检验AFP活性，发现虽然0 mol/L雌激素组细胞增殖较快，但是AFP活性明显低与其他雌激素组。通过不同时期光镜下计算钙结节数，在诱导第10天10^-8组首次发现钙结节，第20天10^-8，10^-9，10 ^-10 mol/L 组均可观察到大量钙结节形成，但是3组无差异性，而0 mol/L组与10^-11 mol/L组增长缓慢有差异性。贾竹亭等^[29]在得出实验结果后分析了雌激素如何对脂肪干细胞进行作用。第一、雌激素直接作用于脂肪干细胞受体。在低浓度范围内作用，雌激素能有效刺激细胞增殖，并且作用成剂量依赖关系。这与DiSilvio 的报道一致。虽然实验结果中表现出来的碱性磷酸酶差异性不大，但是在钙沉积方面雌激素的作用更加突出。第二、雌激素对脂肪干细胞间接作用效应：雌激素可作用于脂肪干细胞分泌细胞因子，如转化生长因子β，骨形态发生蛋白2等，这些细胞因子发挥诱导或促进脂肪干细胞成骨分化的作用。此间接效应与在骨髓间充质干细胞成骨中的间接效应有很大程度上的相似性。国外Taskiran等^[30]分离出大鼠内脏脂肪组织中的脂肪干细胞，同样制备了不同浓度的雌二醇诱导成骨细胞的培养基，并通过von Kossa染色，碱性磷酸酶活性测量和钙离子水平评估，证明了雌二醇有刺激脂肪干细胞体外成骨分化潜能，可以用来作为一种诱导剂以提高效率。但是在研究中发现，脂肪干细胞的细胞增殖是由雌激素外的其他因素负责^[31]。

上述雌激素诱导脂肪干细胞成骨实验中表明，雌激素能通过直接作用于脂肪干细胞上的雌激素受体和促进细胞因子的分泌诱导脂肪干细胞成骨，并且在钙沉积上雌激素体现出了突出的作用。

2.3 雌激素诱导胚胎干细胞成骨的研究成果 胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。具有能发育为成体动物的所有组织和器官的全能性和无限增殖的能力,即胚胎干细胞经过一定的定向培养后，能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型^[32-33]。当Reubinoff等^[34]分离出第一个细胞系时，它体现出来的潜力使它成为最有前景的种子细胞之一。目前已有报道研究表明雌激素能增加胚胎干细胞神经定向分化诱导^[35-36]。而对诱导胚胎干细胞分化成骨细胞的同时，还发现胚胎干细胞分化出血管内皮细胞，两种分化的细胞按照比例混合后仍然能继续在支架材料上培育和移植，此特点解决了实验后期重新建立血供的难题^[37]。

雌激素作用于胚胎干细胞也可以分为直接作用于间接作用。直接作用：胚胎干细胞上也存在相应的雌激素受体及相关表达^[38]，已有相关报道小鼠胚胎干细胞膜雌激素受体的快速通路^[39]。雌二醇刺激胚胎干细胞上相应受体提高蛋白水平，增加原癌基因 (c-fos，c-jun和c-myc)的mRNA表达，提高细胞周期蛋白D1以及细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)和CDK4水平，降低CDK抑制物P21(CIP1)和p27(kip1)的水平从而促进胚胎干细胞增殖^[40]。在对胚胎干细胞研究中发现Oct4，Sox2和Nanog是胚胎干细胞的自我更新调节转录因子，对胚胎干细胞的特异性表达有重要意义。van den Berg DL等^[41]通过研究表明雌激素受体β可以与Oct4相互作用，积极调控Nanog基因的表达。从而影响胚胎干细胞的分化。间接作用：钙是一种普遍的第二信使，使用共聚焦显微镜在胚胎干细胞上发现了钙池操纵的钙入口(SOCE)。在胚胎干细胞的培养中加入SOCE阻滞剂和抑制剂发现，胚胎干细胞的增殖减少并存在浓度依赖性。证明SOEC是胚胎干细胞增殖重要信号通路。实验中还发现转录因子Sox-2，Klf-4，Nanog作用下降，表明SOCE不仅影响着胚胎干细胞增殖，还影响了其自身更新的特性。雌激素介导的刺激对SOCE的主要作用是促进其扩散，进一步有效促进胚胎干细胞的增殖^[42]。另外还有报道称雌激素通过PI3K/Akt, ERK1/2等信号通路上调caveolin-1刺激胚胎干细胞增殖^[43]。Tielens等^[44]研究了抗坏血素，地塞米松，雌二醇对胚胎干细胞成骨分化的影响。实验中通过免疫组织化学法检测了成骨细胞标志物如碱性磷酸酶，转录因子核心结合因子α1和骨钙素，并通过电子显微镜观察了胶原纤维沉积和矿化基质。实验中发现雌二醇培养基碱性磷酸酶的活性逐渐上升，在培养21 d后下降；核心结合因子α1在培养14 d后首次发现，并在后面的培养中继续增加。对比抗坏血素培养基和加入地塞米松的抗坏血素培养基，雌二醇培养基中观察到高数量的成骨样细胞更多，骨样结节更少，并且雌二醇培养基中观察到的胚胎干细胞骨钙素浓度比对照组的多，有差异性。证明雌激素能促进胚胎干细胞诱导成骨。

雌激素可以刺激胚胎干细胞上受体基因介导蛋白激酶，激酶和原癌基因促进胚胎干细胞增殖，保护胚胎干细胞的分化特性的完整性^[45]，同时也可以直接和间接影响胚胎干细胞重要转录因子，调控胚胎干细胞分化能力。在雌激素诱导胚胎干细胞成骨实验中培育出大量的成骨细胞没有被包裹在骨样结节中，为骨组织工程纯化成骨样细胞创造了可能^[44]。

参考文献

[1] Wang Y, Li LZ, Zhang YL, et al. LC, a novel estrone-rhein hybrid compound, concurrently stimulates osteoprotegerin and inhibits receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) and interleukin-6 production by human osteoblastic cells.Mol Cell Endocrinol.2011;337(1-2):43-51.

[2] Zallone A.Direct and indirect estrogen actions on osteoblasts and osteoclasts.Ann N Y Acad Sci. 2006;1068: 173-179.

[3] Vanderschueren D.Androgens and bone. Endocr Rev.2004; 25(3): 389-425.

[4] Ashida K, Akehi Y, Kudo T, et al.Bone and Men's Health. J Clin Calcium. 2010;20(2):165-173.

[5] Luo F, Zhou D, He L,et al.Effect of hyaluronic acid on promoting bone marrow-derived mesenchymal stem cells to differentiate into neural cells in vitro]. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban.2012;43(3):352-357, 433.

[6] Meligy FY, Shigemura K, Behnsawy HM,et al.The efficiency of in vitro isolation and myogenic differentiation of MSCs derived from adipose connective tissue, bone marrow, and skeletal muscle tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim.2012; 48(4):203-215.

[7] 张进,丁富平,徐志伟,等.骨髓间充质干细胞体外培养过程中雌雄激素受体的表达[J].中国临床康复, 2005,9(46):96-98.

[8] Liesveld JL, Jordan CT, Phillips GL 2nd.The hematopoietic stem cell in myelodysplasia. Stem Cells.2004;22(4):590- 599.

[9] 张晓丽.雌激素在骨髓间充质干细胞中的表达和作用[J].四川生理科学杂志,2010,32(3):132-132.

[10] Gopalakrishnan V, Vignesh RC, Arunakaran J, et al.Effects of glucose and its modulation by insulin and estradiol on BMSC differentiation into osteoblastic lineages. Biochem Cell Biol. 2006;84(1):93-101.

[11] DiSilvio L, Jameson J, Gamie Z,et al.In vitro evaluation of the direct effect of estradiolon human osteoblasts(HOB)and human mesenchymal stem cells(BMSCs). Injury.2006; 37 (Suppl 3):S33-42.

[12] Liu Hong,Habiba Sultana,Karina Paulius,et al.Steroid regulation of proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells: a gender difference. J Steroid Biochem Mol Biol.2009;114(3-5):180-185.

[13] Hong L, Zhang G, Sultana H, et al.The effects of 17-beta estradiol on enhancing proliferation of human bone marrow mesenchymal stromal cells in vitro. Stem Cells Dev.2011; 20(5):925-931.

[14] Hong L, Krishnamachari Y, Seabold D, et al.Intracellular release of 17-beta estradiol from cationic polyamidoamine dendrimer surface-modified poly (lactic-co-glycolic acid) microparticles improves osteogenic differentiation of human mesenchymal stromal cells. Tissue Eng Part C Methods.2011; 17(3):319-325.

[15] 杨军,倪斌.雌激素对小鼠骨髓间质细胞LIM矿化蛋白-1 mRNA表达的影响[J].脊柱外科杂志, 2009,7(6):357-360.

[16] Cao L, Liu G, Gan Y, et al.The use of autologous enriched bone marrow MSCs to enhance osteoporotic bone defect repair in long-term estrogen deficient goats. Biomaterials. 2012;33(20): 5076-5084.

[17] Chen FP, Hu CH, Wang KC.Estrogen modulates osteogenic activity and estrogen receptor mRNA in mesenchymal stem cells of women. Climacteric.2012.

[18] Chen HY, Zhang X, Chen SF, et al.The protective effect of 17β-estradiol against hydrogen peroxide-induced apoptosis on mesenchymal stem cell. Biomed Pharmacother.2012; 66(1): p. 57-63.

[19] Ayaloglu-Butun F, Terzioglu-Kara E, Tokcaer-Keskin Z,et al. The effect of estrogen on bone marrow-derived rat mesenchymal stem cell maintenance: inhibiting apoptosis through the expression of Bcl-xL and Bcl-2. Stem Cell Rev. 2012;8(2): 393-401.

[20] 程姝丽,丁寅.雌激素对小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的抑制作用及其机制研究[J].细胞与分子免疫学杂志, 2012,28(5): 514-516.

[21] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng.2001;7(2):211-228.

[22] Bunnell BA, Estes BT, Guilak F, et al.Differentiation of adipose stem cells. Methods Mol Biol.2008;456:155-171.

[23] 聂绪强,陈怀红,唐宁,等.脂肪干细胞的共培养及其分化应用概述[J].生物工程学报, 2011(8):1121-1131.

[24] Rada T, Reis RL, Gomes ME. Gomes, Adipose tissue-derived stem cells and their application in bone and cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev.2009;15(2):113-125.

[25] Hong L, Colpan A, Peptan IA, et al.17-Beta estradiol enhances osteogenic and adipogenic differentiation of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng.2007;13(6): 1197-1203.

[26] Wang Q, Yu JH, Zhai HH, et al.Temporal expression of estrogen receptor alphain rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochem and Biophys Res Commun. 2006; 347(1): p.117-123.

[27] Dudas JR, Losee JE, Penascino VM,et al.Leporine-derived adipose precursor cells exhibit in vitro osteogenic potential. J Craniofac Surg.2008;19(2):360-368.

[28] 陈昕,丁寅,蔡川,等.雌激素对老年大鼠脂肪干细胞体外诱导成骨能力的影响[J].口腔医学研究, 2010.26(3):340-342.

[29] 贾竹亭.雌激素对脂肪组织来源干细胞向成骨方向分化以及与丝素材料相容性影响的初步研究[D].江苏大学, 2009.

[30] Taskiran D, Evren V.Stimulatory effect of 17β-estradiol on osteogenic differentiation potential of rat adipose tissue-derived stem cells. Gen Physiol Biophys.2011; 30(2): 167-174.

[31] Ng LW, Yip SK, Wong HK, et al.Adipose-derived stem cells from pregnant women show higher proliferation rate unrelated to estrogen.Hum Reprod. 2009;24(5):1164-1170.

[32] Cho LT, Wamaitha SE, Tsai IJ, et al.Conversion from mouse embryonic to extra-embryonic endoderm stem cells reveals distinct differentiation capacities of pluripotent stem cell states. Development.2012;139(16): 2866-2877.

[33] Abu Dawud R, Schreiber K, Schomburg D, et al.Human embryonic stem cells and embryonal carcinoma cells have overlapping and distinct metabolic signatures. PLoS One. 2012; 7(6): e39896.

[34] Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, et al.Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol.2000;18(4):399-404.

[35] López-González R, Camacho-Arroyo I, Velasco I. Progesterone and 17β-estradiol increase differentiation of mouse embryonic stem cells to motor neurons.IUBMB Life. 2011;63(10):930-939.

[36] 秦茂林,蔡文琴,张吉强,等.雌二醇对胚胎干细胞神经定向分化诱导的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志, 2009,(4):495.

[37] Kärner E, Unger C, Cerny R, Ahrlund-Richter Let al.Differentiation of human embryonic stem cells into osteogenic or hematopoietic lineages: a dose-dependent effect of osterix over-expression. J Cell Physiol.2009;218(2): 323-333.

[38] Hong SH, Nah HY, Lee YJ, et al.Expression of estrogen receptor-alpha and -beta, glucocorticoid receptor, and progesterone receptor genes in human embryonic stem cells and embryoid bodies. Mol Cells.2004;18(3): 320-325.

[39] Yun SP, Ryu JM, Kim MO,et al.Rapid Actions of Plasma Membrane Estrogen Receptors Regulate Motility of Mouse Embryonic Stem Cells through a Profilin-1/Cofilin-1-Directed Kinase Signaling Pathway. Mol Endocrinol, 2012.

[40] Han HJ, Heo JS, Lee YJ.Estradiol-17beta stimulates proliferation of mouse embryonic stem cells: involvement of MAPKs and CDKs as well as protooncogenes. Am J Physiol Cell Physiol, 2006. 290(4): C1067-1075.

[41] van den Berg DL, Zhang W, Yates A,et al.Estrogen-related receptor beta interacts with Oct4 to positively regulate Nanog gene expression. Mol Cell Biol. 2008;28(19):5986- 5995.

[42] Wong CK, So WY, Law SK,et al.Estrogen controls embryonic stem cell proliferation via store-operated calcium entry & the nuclear factor of activated T-cells (NFAT). J Cell Physiol. J Cell Physiol. 2012;227(6):2519-2530.

[43] Park JH, Lee MY, Han HJ.A potential role for caveolin-1 in estradiol-17beta-induced proliferation of mouse embryonic stem cells: involvement of Src, PI3K/Akt, and MAPKs pathways. Int J Biochem Cell Biol.2009;41(3):659-665.

[44] Tielens S, Wymeersch F, Declercq H, et al.Effect of 17beta-estradiol on the in vitro differentiation of murine embryonic stem cells into the osteogenic lineage. In Vitro Cell Dev Biol Anim.2008;44(8-9): 368-378.

[45] Jung EM, Choi KC, Yu FH,et al.Effects of 17beta-estradiol and xenoestrogens on mouse embryonic stem cells. Toxicol In Vitro.2010’24(6): 1538-1545.

[46] 鞠洪斌,邓展生,朱峥嵘,等.大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞基本生物学特征的比较[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(15):2856-2860.

[47] 鞠洪斌.大鼠脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞成骨分化比较的体外研究[D].中南大学,2006.

[48] Webb TL, Quimby JM, Dow SW.In vitro comparison of feline bone marrow-derived and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Feline Med Surg, 2012’14(2): 165-168.

[49] Zhu X, Shi W, Tai W,et al.The comparition of biological characteristics and multilineage differentiation of bone marrow and adipose derived Mesenchymal stem cells. Cell Tissue Res. 2012 Jun 5.

[50] Wang Y, Yang D, Song L, et al.Mifepristone-inducible caspase-1 expression in mouse embryonic stem cells eliminates tumor formation but spares differentiated cells in vitro and in vivo. Stem Cells.2012’30(2):169-179.

引言

材料方法

讨论

干细胞研究的第一环也是重要环节就是干细胞的提取。骨髓间充质干细胞从取材开始就存在难度，骨髓取材获取细胞数量有限，每个成人只能抽取10-20 mL，不能满足需要。且大量抽取骨髓会增加机体创伤，并有一定的并发症。为了寻求能替代骨髓间充质干细胞诱导成骨的新型种子细胞，国内外对诱导脂肪干细胞，胚胎干细胞成骨进行了大量的研究。人体中，平均每300 mL脂肪组织可获得(2-6)×10⁸脂肪干细胞^[21]。鞠洪斌等^[46-47]与Webb等^[48]比较了骨髓来源和脂肪组织源性间充质干细胞的生物特性证明了两者的生物特性类似。因为细胞起源和资源量的决定性了干细胞的应用，所以脂肪组织是一个更有前途的干细胞来源[49]。但是脂肪干细胞分化条件不易控制而且在培养或诱导下极易转化为成熟细胞，失去干细胞的特性，对实际应用造成了一定的不利影响。相比脂肪干细胞的取材，人体储备量上的优势来说，胚胎干细胞主要的优势在于全能性和无限增殖，但是胚胎干细胞存在伦理学争议并且胚胎干细胞移植后的成瘤风险，限制了其具体使用。近期Wang等^[50]对米非司酮诱导在胚胎干细胞自杀基因caspase-1的过度表达可以消除潜在的肿瘤的形成进行了相关的报道，为解决胚胎干细胞成瘤的问题提出了新的方法。

在上述3种干细胞的培养及诱导成骨的研究中，雌激素都体现出来促进干细胞增殖，促进干细胞成骨分化的作用，并且在不同干细胞上突出的特点不同。证明了雌激素能作为一种有效的诱导剂应用于干细胞的培养及诱导成骨。但是雌激素应用于干细胞成骨中存在几个问题有待解决：①现普遍认为干细胞增殖和诱导成骨与雌激素浓度相关，但是各项实验仍然体现出雌激素浓度分级粗略。相关最适浓度，最低浓度，体外培养标准化等仍无相关报道，需要进一步深入研究。②在上述3种干细胞上均发现雌激素相关受体，但是具体的受体基因多态性，基因编码，基因修饰，信号通路及作用等尚无报道，对相关基因的编码调控表达转录的研究能更加深入的探讨雌激素受体基因作用的具体机制。③雌激素是人体内在的重要的激素之一，在人体中雌激素分泌主要受自身调节。现在仅仅单纯的对体外培养和诱导进行研究及临床观察得出结论，但是干细胞移植到体内直接受雌激素等微环境影响会有如何表现；是否安全而且能够控制；雌激素分泌及浓度变化情况等诸多问题都是今后干细胞移植到体内必须要解决的问题。④在骨组织工程发展的今天，各种天然、人造生物支架已得到大力开发，在干细胞的培养及诱导的实验及应用中，细胞支架是其中一个重要的条件。能否建立一种可人为或自动调控的具备完善雌激素作用的新型支架，在体外模拟正常生理环境，是今后研究干细胞的生长及分化情况必须要解决的问题。

展望：在天然中不存在完美的种子细胞可以直接用以组织工程及临床中，这就需要人工的雕琢，于是当前的研究重点便是通过各方面的调节和改造现有的种子细胞，研发新型种子细胞。通过基因层面改造种子细胞解决实际应用中的问题如定向性低，细胞凋亡，易受干扰，与支架黏附性差等是今后发展的热点趋势。雌激素受体基因表达在上述3种干细胞体现出来的促进增殖与成骨分化的特性能为今后的种子细胞开发提供研究信息及方向。