SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (19): 2953-2958.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.001

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SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化

杜志才¹，银和平¹，李树文¹，武海军²，白明¹，曹振华¹，孟格东¹

1内蒙古医科大学第二附属医院微创脊柱外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030；2呼和浩特市第一医院骨科，内蒙古自治区呼和浩特市 010020

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 通讯作者：银和平，主任医师，教授，硕士生导师，内蒙古医科大学第二附属医院微创脊柱外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:杜志才，男，1981年生，内蒙古自治区呼和浩特市人，汉族，南方医科大学在读博士，主治医师，主要从事脊柱退行性疾病方面的研究。
基金资助:
内蒙古自然科学基金(2009MS1117)

Differentiation of SOX-9 and GDF-5 co-transfected bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus cells

Du Zhi-cai¹, Yin He-ping¹, Li Shu-wen¹, Wu Hai-jun², Bai Ming¹, Cao Zhen-hua¹, Meng Ge-dong¹

1Department of Minimally Invasive Spine Surgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Hohhot, Hohhot 010020, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Corresponding author: Yin He-ping, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Minimally Invasive Spine Surgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Du Zhi-cai, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Minimally Invasive Spine Surgery, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region, No. 2009MS1117

摘要/Abstract

摘要：

背景：移植间充质干细胞预防和治疗椎间盘退变是一种可行的方法，将SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞，使其向髓核细胞转化，以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应。
目的：探讨SOX-9和GDF-5基因共同诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的效果。
方法：提取、分离、纯化4周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，取第3代骨髓间充质干细胞分为5组体外诱导其向类髓核细胞分化，分别为未转染组、空载体转染组、SOX-9转染组、GDF-5转染组、共转染组。转染后第14 天采用RT-PCR检测SOX-9，GDF-5和Ⅱ型胶原的mRNA表达，免疫组化染色法检测髓核细胞标记物KRT19表达。
结果与结论：共转染组SOX-9 mRNA表达高于转染SOX-9组，差异有显著性意义(P < 0.05)；共转染组GDF-5 mRNA表达高于转染GDF-5组，差异有显著性意义(P < 0.05)。共转染组Ⅱ型胶原表达高于转染SOX-9组、转染GDF-5组，差异有显著性意义(P < 0.05)。SOX-9转染组及GDF-5转染组KRT19呈阳性表达，共转染组呈强阳性表达，可见被转染的骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化，且双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的能力和分泌细胞外基质的能力明显高于单基因转染。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 髓核细胞, SOX-9, GDF-5, 转染, 骨髓间充质干细胞, 细胞分化, 内蒙古自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Transplantation of mesenchymal stem cells to prevent and treat degeneration of the intervertebral disc is a feasible method. Mesenchymal stem cells co-transfected by SRY-related high mobility group-box gene 9 (SOX-9) and growth differentiation factor-5 (GDF-5) can differentiate into nucleus pulposus cells, in order to obtain greater effect of induction and proliferation of nucleus pulposus cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of SOX-9 and GDF-5 co-transfection on the differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus cells.
METHODS: We separated and cultured bone marrow mesenchymal stem cells from the bone marrow of rabbit aged 4 months. Passage 3 cells were divided into five groups and in vitro induced to differentiate into nucleus pulposus cells: non-transfected group, empty vector transfection group, SOX-9 transfection group, GDF-5 transfection group, SOX-9 and GDF-5 co-transfection group. At 14 days after transfection, RT-PCR was employed to assay SOX-9, GDF-5 and collagen type II mRNA expressions in bone marrow mesenchymal stem cells. The marker of nucleus pulposus cells-KRT19 expression was also detected by immunohistochemical staining.

RESULTS AND CONCLUSION: In the co-transfection group, the mRNA expressions of SOX-9, GDF-5, and collagen type II were significantly higher than those in the SOX-9 transfection group, GDF-5 transfection group, and both these two groups, respectively (P < 0.05). Cells were positive for KRT19 in the SOX-9 and GDF-5 groups, and strongly positive for KRT19 in the co-transfection group. These findings indicate that double gene-transfected bone marrow mesenchymal stem cells are better than single gene-transfected cells with regard to differentiation into nucleus pulposus cells and secretion of extracellular matrix.

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Transfection, SOX9 Transcription

中图分类号:

R394.2

杜志才，银和平，李树文，武海军，白明，曹振华，孟格东. SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 2953-2958.

Du Zhi-cai, Yin He-ping, Li Shu-wen, Wu Hai-jun, Bai Ming, Cao Zhen-hua, Meng Ge-dong. Differentiation of SOX-9 and GDF-5 co-transfected bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 2953-2958.

图/表（结果） 3

参考文献

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引言

椎间盘退变是下腰痛和腰椎间盘突出症的主要原因，然而椎间盘产生退变的病理机制尚不完全清楚，大致是由于机械、营养、生物等各种因素造成损伤。在已有研究基础上，针对椎间盘退变的靶点基因，通过组织工程学方法来阻止或改变椎间盘退变，成为腰椎间盘退变基础研究的热点课题之一。
间充质干细胞是椎间盘组织工程学较理想的种子细胞来源，注入外源性间充质干细胞可以治疗多种组织损伤^[1-6]。研究显示移植间充质干细胞治疗椎间盘退变是一种可行的方法^[7-8]。国外有学者将体外培养的骨髓间充质干细胞植入退变的动物椎间盘模型中，结果显示移植的骨髓间充质干细胞能够在一定程度上延缓椎间盘退行性变的病理过程[9-10]。
髓核细胞是软骨样细胞，髓核细胞对椎间盘正常功能的维持有重要作用，其细胞外基质成分是蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。研究表明骨髓间充质干细胞和髓核细胞复合培养能增强髓核细胞的增殖、DNA合成和蛋白聚糖合成，可能是由于骨髓间充质干细胞分泌的生长因子对髓核细胞起到了促增殖分化作用^[11-12]。近年来有关骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化以及在体内椎间盘微环境存活的研究成为热点^[13-14]。
实验表明Sox9(SRY-related high mobility group- box gene 9)参与软骨死亡发育及成熟[^15]，Sox9和Ⅱ型胶原蛋白表达降低与腰椎间盘退变正相关[16]。生长分化因子5(growth/differentiation factor 5, GDF-5)是骨形态发生蛋白家族中与众不同的成员，在机体软骨形成、骨骼发育过程中发挥重要作用。GDF-5较其他细胞因子在骨髓间充质干细胞向软骨细胞及类髓核细胞分化中显示出很多优势^[17-19]。魏强强^[20]报道GDF-5联合地塞米松诱导大鼠骨髓间充质干细胞向类髓核样细胞分化有一定作用。而且，GDF-5诱导后人骨髓间充质干细胞的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原表达上调，提示GDF-5对于软骨修复可能有治疗作用^[21]。
选择适合的细胞表型有助于区别骨髓间充质干细胞不同的分化细胞群。近来研究表明cytokeratin 19(KRT-19)在鼠细胞和人细胞中可以作为髓核细胞标记物[22-23]。在环境刺激物的作用下，骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化时特殊表达的基因可以区分类髓核表型和软骨样表型。KRT-19和蛋白聚糖/Ⅱ型胶原比例对于区分软骨形成和椎间盘性分化是一个潜在标记^[24]。
国内外多数研究表明单基因诱导对骨髓间充质干细胞定向分化产生积极影响，但多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求，并有助于发挥多基因产物之间的协同作用，提高分化效果。国内也有双基因共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的研究^[25]。本实验将SOX-9和GDF-5共同转染兔骨髓间充质干细胞，使其向类髓核细胞转化，以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应，为治疗椎间盘退变的组织工程研究提供新思路。

材料方法

设计：SOX-9和GDF-5共同转染分离培养的兔骨髓间充质干细胞。
时间及地点：实验于2010年6月至2011年12月在内蒙古医科大学分子生物学实验室完成。
材料：
实验动物：纯种4周龄新西兰大白兔2只用于提取骨髓间充质干细胞，体质量约1.6 kg，由内蒙古农业大学实验动物中心提供。

SOX-9和GDF-5共同转染兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
质粒pcDNA3.1-GDF-5、pcDNA3.1-SOX-9	Cytolab公司
Ⅱ型胶原酶	美国Gibco公司
Takara RNA PCR Kit(AMY)Ver．3.0	大连宝生物工程有限公司
PTC-200型PCR仪	美国MJ公司
细胞培养箱	德国Heraeus公司

实验方法：
兔骨髓间充质干细胞的分离与培养：取4周龄新西兰大白兔2只，以戊巴比妥麻醉后，无菌条件下用16号骨穿针于髂嵴处作骨髓腔穿刺，抽吸骨髓共5 mL，缓慢加入到含有等量体积Percoll分离液的离心管中，离心弃上清，加入基础培养液，反复吹打制成单细胞悬液，接种于50 mL 培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱中培养。4 d后全量换液，弃去悬浮细胞，两三天更换1次培养液，至8-12 d时70%-80%细胞融合成单层后用胰酶消化传代。
免疫荧光染色进行骨髓间充质干细胞的鉴定：取第3代骨髓间充质干细胞以2×107 L-1细胞浓度接种于24孔板中，分别向2孔内滴加CD44，CD29，CD34鼠抗兔多克隆抗体(1∶100) 300 μL，PBS清洗3遍后每孔加入300 μL山羊抗兔FITC标记的二抗(1∶100)，室温孵育2 h后弃去二抗，荧光显微镜下观察。
实验分组：①未转染组：仅加入200 μL无血清无双抗的L-DMEM培养液。②转染空载体组：用100 μL无血清无双抗的L-DMEM培养液分别溶解2 μg pcDNA3.1空载体和脂质体8 μL。③转染SOX-9组：用100 μL无血清无双抗的L-DMEM培养液分别溶解2 μg pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体8 μL。④转染GDF-5组：用100 μL无血清无双抗的L-DMEM培养液分别溶解2 μg pcDNA3.1-GDF-5质粒和脂质体8 μL。⑤共转染组：用100 μL无血清无双抗的L-DMEM培养液分别溶解pcDNA3.1-GDF-5、pcDNA3.1-SOX-9质粒各2 μg和脂质体16 μL。
脂质体介导的SOX-9和GDF-5转染骨髓间充质干细胞：第3代骨髓间充质干细胞接种于细胞培养板，每组3个复孔，每孔细胞数调节至2×109 L-1，加含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基，待细胞80%融合时，采用脂质体介导的转染法将pcDNA3.1-GDF-5、pcDNA3.1- SOX-9质粒分别转染骨髓间充质干细胞，24 h后弃去转染液，用无血清L-DMEM培养基温育5 min，每孔0.3 mL。 37 ℃放置6 h，更换含有血清的全培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养48 h以1︰10的比例稀释接种到新的培养板进行筛选，至阳性克隆形成，用于检测相关指标。
RT-PCR法检测转染后细胞SOX-9，GDF-5，Ⅱ型胶原的mRNA表达：于培养第14天离心收集细胞，抽提细胞总RNA，多次操作，取RNA的平均值。采用水平式琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，按照Takara RNA PCR Kit(AMY)Ver．3.0说明书操作进行反转录。用RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA的第1链作为模板进行PCR扩增。PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析、DNA吸光度扫描检测；显色条带图像分析系统(Alpha Imager 2000)检测其积分吸光度值，与内参β-actin条带的比值为mRNA表达水平参数。
MTT法检测转染基因对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响：培养第5天，各组细胞以每孔1×107 L-1细胞浓度接种于96孔板中，24 h后每孔加入MTT 20 μL，在酶标仪490 nm波长处测定各孔的吸光度值。
免疫组织化学检测KRT19的表达：在培养第14天制作细胞爬片，取出载玻片，固定30 min，乙醇脱水，孵育30 min，加入含0.5%牛血清白蛋白稀释的1∶200鼠抗兔KRT19多克隆抗体，置湿盒4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液洗2次，滴加生物素连接二抗1∶200，37 ℃孵育30 min，加入1∶1 000链霉素连接过氧化酶孵育30 min，DAB显色5 min，苏木精复染，中性树脂封固，另外以不加一抗样本作为空白对照。
主要观察指标：①兔骨髓间充质干细胞的形态。②免疫荧光染色鉴定兔骨髓间充质干细胞表面标志分子表达。③免疫组化法检测KRT19的表达。④RT-PCR法检测SOX-9、GDF-5及Ⅱ型胶原mRNA表达。
统计学分析：所得数值应用多样本均数两两比较方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义，使用SPSS 13.0统计学软件进行分析。

讨论

椎间盘退变作为腰腿痛常见的致病因素，其基础研究一直是脊柱外科领域的研究重点。SOX-9基因是Ⅱ型胶原合成过程中一个重要的转录因子，而髓核Ⅱ型胶原的缺失正是椎间盘退行性变的主要表现之一。研究表明椎间盘退行性变的发生与SOX-9基因的表达下调有关[26]。GDF-5在骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化过程中发挥着重要作用。髓核细胞在椎间盘组织中的主要功能就是产生细胞外基质并维持其成分的稳定。
骨髓中间充质干细胞的含量极低，1%的骨髓群中有1/10 000-1/100 000的骨髓核细胞为间充质干细胞[27-28]。供提取骨髓间充质干细胞动物年龄的选择一般为1-4周龄，因为随着周龄的增加，间充质干细胞分化能力逐渐减低，但是周龄太小，则兔的体质量小，且选取骨髓量及操作都有困难，因此实验选择4周龄大小兔为实验对象。间充质干细胞无特异的表面标记，Tsai等^[29]发现骨髓间充质干细胞高表达SH2，SH3，SH4及CD29，CD44，CD90，CD105。Zvaifler等[30]发现CD34只有极少数骨髓间充质干细胞表达。而脂肪间充质干细胞则低表达CD44[31]。本实验用免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞表面标志分子表达，CD44、CD29阳性表达，CD34阴性表达，表明骨髓间充质干细胞获取成功。
脂质体是常用的基因载体，课题组购买重组质粒pcDNA3.1-GDF-5和pcDNA3.1-SOX-9表达载体，并将其转染兔骨髓间充质干细胞。转染后兔骨髓间充质干细胞的增殖活性显著高于未转染组、转染空载体组(P < 0.01)，表明外源性SOX-9和GDF-5基因转染到兔骨髓间充质干细胞后，显著提高了骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的增殖能力。转染SOX-9组、GDF-5组、共转染组间比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，表明双基因转染后骨髓间充质干细胞的增殖活性和单基因转染无显著差异。
转染成功后，经RT-PCR检测表明转染基因在mRNA水平得到了表达。Ⅱ型胶原蛋白是正常髓核的重要表型特征，椎间盘退变过程中，Ⅱ型胶原蛋白含量降低，通过检测Ⅱ型胶原可以反映Ⅱ型胶原蛋白含量变化情况。RT-PCR检测提示转染的骨髓间充质干细胞已在转录水平合成Ⅱ型胶原mRNA，以共转染组Ⅱ型胶原的表达最多。由此推测双基因转染诱导骨髓间充质干细胞在细胞外基质分泌的能力上明显高于单基因转染。
国外研究发现髓核细胞与纤维环细胞及软骨细胞相比，KRT19水平更高，在髓核细胞中KRT19水平随着年龄增大而降低，从而得出KRT19的基因表达水平可能成为人髓核细胞的特征标志。实验中SOX-9转染组、GDF-5转染组及SOX-9和GDF-5共转染组转染后的骨髓间充质干细胞成功表达髓核细胞的特异性标记物KRT19，具有了髓核细胞特征，提示骨髓间充质干细胞在外源特异性基因作用下向类髓核细胞定向分化成功。SOX-9和GDF-5共转染组KRT19呈强阳性表达，推测双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转化的能力明显高于单基因转染。
综上所述，外源GDF-5和SOX-9的正调节作用使骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化，从而合成并分泌细胞外基质Ⅱ型胶原，为外源性骨髓间充质干细胞修复椎间盘提供了理论依据。多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求，并有助于发挥多基因产物之间的协同作用，提高治疗效果。

SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化

Differentiation of SOX-9 and GDF-5 co-transfected bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus cells

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