海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞的动作电位和L型钙通道电流

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.010

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2843-2848.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.010

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞的动作电位和L型钙通道电流

蒲红伟1，苏丽萍2，王雪梅3，陈晓2，张丽萍2，刘小山4，王治国5，王华2，李凯超6

新疆医科大学第一附属医院，1科教中心，3临床研究院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；2新疆医科大学基础医学院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；4广州中山大学医学院法医学系，广东省广州市 510080；5新疆维吾尔自治区司法鉴定科学技术研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830002； 6新疆维吾尔自治区阿勒泰地区哈巴河县公安局法医室，新疆维吾尔自治区哈巴河县 836700

收稿日期:2015-02-12 出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
通讯作者: 通讯作者：刘小山，博士，主任法医师，广州中山大学中山医学院法医系，广东省广州市 510080
作者简介:蒲红伟，女，甘肃省人，汉族，新疆医科大学在读博士，副教授，主要从事病理及毒理学方面的研究。并列第一作者：苏丽萍，新疆医科大学在读硕士，主要从事法医病理和毒理方向研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81260464)；新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2011211B20)

Action potential and L-type calcium channel currents in myocardial cells of rat models of heroin addiction

Pu Hong-wei1, Su Li-ping2, Wang Xue-mei3, Chen Xiao2, Zhang Li-ping2, Liu Xiao-shan4, Wang Zhi-guo5, Wang Hua2, Li Kai-chao6

1Science and Education Center, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Basic Medical School, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Clinical Research Institute, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 4Department of Forensic Medicine, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; 5Forensic Science and Technology Institute of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 6Public Security Bureau of Habahe County of Aletai area, Habahe 836700, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2015-02-12 Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
Contact: Liu Xiao-shan, M.D., Legal physician in chief, Department of Forensic Medicine, Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Pu Hong-wei, Studying for doctorate, Associate professor, Science and Education Center, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Su Li-ping, Studying for master’s degree, Basic Medical School, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Pu Hong-wei and Su Li-ping contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81260464; the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211B20

摘要/Abstract

摘要：

背景：钙离子通道异常可导致心肌受损，海洛因可直接作用钙离子通道，从而改变心肌结构。
目的：观察海洛因成瘾致大鼠心律失常后心肌细胞超微结构、L型钙离子通道电流及心肌细胞动作电位的变化情况。
方法：SD大鼠随机分为对照组和模型组，模型组大鼠以海洛因初使剂量5 mg/(kg•d)，采用逐日剂量递增法[递增剂量2.5 mg/(kg•d)]复制海洛因成瘾大鼠模型；20 d海洛因成瘾模型成功建立，继续递增剂量至第30天，进一步建立海洛因成瘾大鼠心律失常模型。
结果与结论：与对照组相比，海洛因成瘾大鼠心肌电镜结构改变主要表现在细胞核膜皱缩、核浓缩、变小，染色质集结成块，线粒体嵴排列紊乱、消失，肌小节排列紊乱、灶性断裂，肌丝辨识不清等，心肌细胞L型钙通道电流-电压曲线呈现上移趋势，90%去极化动作电位显著缩短。表明海洛因可直接致心肌结构发生病理改变，钙通道电流发生改变是造成心肌损伤的主要原因之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 心脏及血管损伤模型, 海洛因, L型钙通道, 心律失常, 膜片钳, 电镜, 心肌超微结构, 电流-电压曲线, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Calcium channel abnormalities can damage myocardium. Heroin can directly affect calcium ion channel, and alter myocardial structure.
OBJECTIVE: To study the changes of heroin-induced myocardial ultrastructure, L-type calcium channel current and action potential of myocardial cells after rat cardiac arrhythmia.
METHODS: Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group and model group. In the model group, rats were administered heroin at initial dose of 5 mg/kg•d. The daily dose escalation method was used (increasing dose: 2.5 mg/kg•d) to replicate rat models of heroin addiction. At 20 days, models of heroin addiction were successfully established. At 30 days after increasing the dose, rat models of heroin addiction-induced arrhythmias were further established.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the electron microscopy demonstrated that myocardial structure changes mainly presented nuclear membrane shrinkage, nuclear condensation, nuclei became small, chromatin assembled into blocks, mitochondria disordered and disappeared, sarcomeres disordered, focal fracture, and unclear myofilament in rat models of heroin addiction. Electric current-voltage curve of myocardial cell L-type calcium channel current showed the increasing trends. The 90% repolarization action potential was significantly shortened. These data indicated that heroin can directly lead to the pathological change of myocardial structure. Calcium channel current change is one of the main reasons for myocardial injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Heroin Dependence, Myocytes, Cardiac, Arrhythmias, Cardiac, Calcium Channels, L-type

中图分类号:

R318

蒲红伟，苏丽萍，王雪梅，陈晓，张丽萍，刘小山，王治国，王华，李凯超. 海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞的动作电位和L型钙通道电流[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2843-2848.

Pu Hong-wei, Su Li-ping, Wang Xue-mei, Chen Xiao, Zhang Li-ping, Liu Xiao-shan, Wang Zhi-guo, Wang Hua, Li Kai-chao. Action potential and L-type calcium channel currents in myocardial cells of rat models of heroin addiction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2843-2848.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析注射海洛因20 d时，SD大鼠已出现戒断症状，有3只大鼠心电图表现心律加快，P波变宽，T波压低；持续给药10 d，模型组15只大鼠基本上出现窦性心动过缓、T波倒置、房性早搏、室性早搏、束支传导阻滞等心律改变，表明心律失常模型成功建立。对照组大鼠心电图未见明显异常。至实验结束时模型组大鼠死亡5只(在心律失常造模过程死亡)，死亡比例为模型组大鼠的25%。

2.2 海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞的形态变化苏木精-伊红染色显示，对照组大鼠心肌细胞排列整齐均匀，染色均衡，肌纤维、横纹及细胞核形态清晰。模型组大鼠部分心肌波浪状排列，部分心肌断裂、缺失。灶性肌纤维嗜伊红浓染较多，横纹肌肌纤维模糊不清，部分肌细胞核固缩，其主要分布在左、右室壁，以外层多见。偶见少量中性粒细胞、红细胞浸润心内外膜，少量的血管内均质红染(图1)。

2.3 海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞的超微结构电镜观察显示，对照组大鼠心肌肌丝排列整齐，存在形态完整的肌小节结构；心肌内、外膜完整，线粒体排列整齐、嵴完整，肌原纤维清晰整齐，横纹肌结构清楚，细胞核核膜无皱缩，染色质密度正常(图2A)。模型组大鼠心肌肌丝排列紊乱、断裂或消失，部分肌小节排列紊乱、灶性断裂。有部分心肌横纹间距变短，肌节缩短，部分肌丝分辨不清。心肌细胞膜肿胀，呈区带性病变。部分线粒体肿胀电子密度升高，嵴变短变小甚至消失，或空泡样改变(图2B)；肌

表2 对照组和模型组大鼠动作电位变化情况 (x(_)±s, n=10, ms)

Table 2 Changes of action potential in rat models of the control group and the model group

项目	对照组	模型组
静息动作电位	95.665±4.165	93.582±1.062
90%去极化动作电位	84.473±3.739	80.164±2.136
动作电位复极至90%的时程	534.560±34.363	436.630±45.243^a

表注：与对照组相比，^aP < 0.05。

间隙扩张，微血管基底膜与正常组相似，无增厚病变，肌原纤维强烈收缩，电子密度明显升高，表现出大小不等结构形态；可见扩张的肌浆网，其中部分肌浆网破裂、消失，闰盘迂曲、不连续(图2C，D)。可见部分细胞核变形，变小或不规则样改变，染色质进一步浓缩。部分核膜轻微皱缩，核异形较轻，染色质凝集不完全，心肌间质可见线粒体，偶见心肌内出现脂滴(图2E)。

2.4 海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞I_Ca-L电流-电压曲线的变化全细胞封接状态后，将电位从-40-50 mV之间改变，阶跃10 mV电流、300 ms波宽、0.1 Hz频率的刺激，开始激活导出-40 mV的内向电流。在-10 mV时，模型组中的心肌细胞电流-电压曲线出现明显上移(图3)，电流密度峰值(pA/pF)上升(P < 0.05；表1)。与对照组相比，在模型组心肌发生心律失常后，Ca²⁺电流曲线呈现右移趋势异样改变(图4)。

2.5 海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞动作电位时程的变化与对照组相比，模型组大鼠心肌细胞RP和AP90变化的差异无显著性意义(P > 0.05)，而APD90显著缩短(P < 0.05；表2)。模型组大鼠心肌细胞在海洛因药物作用下，动作电位曲线发生显著改变，特别是对心肌复极化过程中2期平台期影响较大，其模型组2期平台期时间较对照组明显缩短(图5)，提示钙离子通道大量激活。与对照组相比，模型组SD大鼠RP及AP90的变化差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年4至7月在新疆医科大学第一附属医院临床研究院动物实验平台完成。

材料：

海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞检测使用的试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
盐酸纳洛酮(批号：H20055758)	北京四环制药有限公司
二甲苯透明液，苏木精，伊红，盐酸乙醇	北京中衫金桥技术生物有限公司
生物显微镜	上海光学仪器厂
电极拉制仪(WPI PULLl00型)	德国
倒置显微镜，三维操纵器	德国HEKA公司
透射扫描电镜(JEM-1200EX)	日本电子公司JEO公司

动物：SPF级3月龄健康雄性SD大鼠40只，体质量为(220±20) g，按新疆医科大学第一附属医院临床研究院动物饲养中心提供的饲料和方法喂养(动物许可证号：IACUC-20131224002)。

药物：海洛因由新疆维吾尔族自治区公安厅禁毒总队提供，为米黄色粉末及颗粒状，纯度为70%(生理盐水溶解)。

方法：

实验动物分组：大鼠随机分为对照组和模型组，各20只。

海洛因成瘾模型大鼠的建立：结合参考文献[20]及预实验结果，采用逐日剂量递增方法建造成瘾模型，海洛因药物首次剂量为5 mg/kg，每日北京时间10：00和19：00 2次皮下注射，逐日剂量递增2.5 mg/kg。持续注射20 d，建立海洛因成瘾模型。每只大鼠注射0.8 mg盐酸纳洛酮戒断催促，以扭体、湿狗样抖、跳跃、齿颤等异常症状综合判定海洛因成瘾模型，继续以递增剂量至第30天，海洛因成瘾大鼠出现心律失常症状。

对模型大鼠的病理观察：大鼠腹腔注射水合氯醛 (3 μL/g)麻醉，快速断颈并取出心脏。取心脏最大平面组织块大小1 cm³，放入体积分数4%甲醛中固定，1周后行包埋石蜡包埋，切成0.5 mm厚度薄片于载玻片上，二甲苯脱蜡 20 min，梯度乙醇脱水，苏木精染液染色5 min，体积分数1%盐酸乙醇分色20 s。流水冲洗5 min，置于0.1%-0.5%伊红染液染色1-5 min，清水洗2遍，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封固，显微镜观察。

对模型大鼠的电镜观察：取心尖部作为电镜材料，大小分别为1 mm³小块，生理盐水冲洗，用体积分数4%戊二醛固定1周，PBS洗2遍，梯度丙酮脱水；环氧丙烷：环氧树脂混合物内浸透各2 h，环氧丙烷：环氧树脂过夜存放。样品平放在透明包埋筐里，加环氧丙烷：环氧树脂，60 ℃，48 h去除包埋筐，并把初步包埋的组织块重新在环氧丙烷：环氧树脂内包埋一次60 ℃下聚合2 d以上。铜网捞起切成60-80 nm厚的片，用醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，置透射扫描电镜下观察。

对模型大鼠的膜片钳细胞电位记录^[21]：大鼠经水合氯醛麻醉后，处死后迅速取出心脏，用无钙台式液(NaCl：8.006 3 g，HEPES：2.383 g，KCl(1 mol/L)5.4 mL，NaH₂PO₄•2H₂O(1 mol/L)0.33 mL，MgCl₂•6H₂O(1 mol/L) 1.00 mL，葡萄糖：2 g，定容至1 000 mL，NaOH(4 mol/L)

校正其pH值为7.30)灌流10 min，酶溶液(无钙台式液+胶原酶Ⅱ)灌流20 min，无钙台式液中止冲洗5 min，剪碎心室肌于分离细胞槽内，吸管吹打，温育10 min，100目过滤网过滤，静置后弃去上清液，复钙至1 mmol/L，静置1 h。在室温条件下，选取形态大小适中的心肌细胞，将1×10⁵个数量细胞置于细胞培养皿中，在倒置荧光显微镜下观察细胞贴壁后，用台式液(无钙台式液+CaCl₂)冲洗5 min，开始监测心肌细胞。通过电极拉制仪观察细胞膜电位情况，记录L型钙通道电流(long lasting calcium current，I_Ca-L)、静息动作电位(resting potential，RP)、90%去极化动作电位(90% depolarization action potential，AP90)及动作电位复极至90%的时程(90% Repolarization action potential

duration，APD90)等细胞膜电位改变情况。

主要观察指标：苏木精-伊红及透射扫描电镜观察海洛因成瘾模型大鼠心肌形态结构改变，膜片钳观察膜电位，记录I_Ca-L、RP、AP90及APD90改变情况；

统计学分析：数据以x(_)±s表示，计量资料采用配对双侧t 检验；计数资料采用卡方检验，检验水准为0.05，所有统计数据结果均在SPSS 17.0统计软件上完成(采用确切概率法)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

在临床资料中，海洛因成瘾患者最常见的症状为心律失常，其主要为心电图ST-T段改变、心肌供血不足、窦性心律不齐及束支传导阻滞等临床表现^[22]，表明海洛因对心脏有直接损害。有文献报道钙离子通道的异常与心律失常有密切关系^[23-24]。文章着重于离子相关通道电流改变情况进行研究，深入探讨复杂的离子通道功能、细胞与细胞间的联系，进一步了解钙离子在海洛因致心律失常中的作用。通过电子显微镜及膜片钳技术直接观察海洛因成瘾大鼠心肌超微结构改变和单个心肌细胞钙离子通道电流的变化来探讨海洛因致心律失常机制。

苏木精-伊红染色可见，海洛因成瘾大鼠心肌细胞部分心肌嗜伊红、部分心肌波浪状排列、断裂及溶解，部分细胞核固缩等改变。此形态改变与超微结构显示部分心肌细胞改变基本一致；电镜显示部分心肌细胞核变形、核染色质浓缩；部分肌纤维排列紊乱、断裂或消失，部分肌细胞横纹间距缩短，电子密度升高；部分线粒体电子密度升高，线粒体嵴排列紊乱，嵴分辨不清、消失或空泡化变；肌浆网扩张、破裂及消失；闰盘不连续。以上形态学的改变在一定程度上证实了海洛因可直接对大鼠心肌造成损害，这可能是海洛因对心肌细胞损害最初的病理形态学改变，也是长期吸食海洛因导致心律失常的一定基础。电流-电压曲线是电压依赖性离子通道的特征性曲线，不同离子通道有不同特征的电流-电压曲线^[25-26]。与对照组相比，模型组大鼠心肌细胞L-Ca²⁺通道电流峰值明显降低，电流-电压曲线明显上移，但曲线的形态未发生改变，这在一定程度表明海洛因可能直接作用钙离子，从而影响心肌膜电位的改变。

实验中模型组大鼠出现心律失常，甚至猝死，原因正是L型钙通道电流的降低，钙离子内流减少，动作电位2期平台期相应缩短造成，心肌强烈收缩造成心肌供血不足，造成不同程度损害。海洛因对大鼠心肌细胞RP、AP90作用不明显，直接作用心肌APD90显著缩短，表明心肌L型钙通道的电流可在海洛因药物作用下明显抑制，电流-电压曲线明显上移，形态不变，一定程度上说明海洛因通过抑制L型钙电流造成动作电位时程缩短。细胞动作电位是由细胞相关内外离子流相互作用形成^[27-28]。I_Ca-L是心肌复极过程中主要内向离子流，也是心室肌细胞动作电位平台期的一定基础^[28]。在海洛因药物抑制L型钙通道的活性后，发生动作电位时程缩短、有效不应期延长等改变。如果用相应药物阻断钙离子的大量内流，那么就能减少心肌损伤的发生。心肌细胞膜上主要存在两种钙通道，即L型和T型钙通道，一个α1亚基和几个辅助亚基共同组成心肌L型钙通道，其中α1亚基形成孔状结构，β亚基则位于细胞内，二硫链接位于细胞膜外的α2δ亚基^[29-30]。L型钙离子通道在心肌细胞产生兴奋性、电信号及电活动的过程中起着举足轻重的作用。其不仅参与心室肌电活动，通过I_Ca-L通道Ca²⁺内流而形成动作电位，并且其主要构成窦房结和房室结的动作电位。I_Ca-L在细胞动作电位去极化和复极化过程中是不可缺少的一部分，如心律失常早期后除极和细胞兴奋收缩耦联中细胞内[Ca²⁺]_i瞬变中起关键作用，但动作电位却不受其影响^[31-33]。T型钙通道则主要参与慢反应细胞动作电位的形成和传导^[34]。

实验结果发现心肌超微结构肌丝排列紊乱、断裂或消失，部分肌小节排列紊乱、灶性断裂。有部分心肌横纹间距变短，肌节缩短，部分肌丝分辨不清。肌间隙扩张，微血管基底膜与正常组相似，无增厚病变，肌原纤维强烈收缩，电子密度明显升高，大小不等改变，这与L型钙通道的电流改变有密切关系。多数文献报道肌节紧靠、肌丝融合或呈典型的收缩带状分布，可见于多种病理情况，如缺血后再灌注，儿茶酚氨中毒等。有多种因素参与心律失常的发生，细胞内钙离子浓度过高与其有密切关系^[35-36]。心室肌细胞在缺血、缺氧状态下持续性增加钙离子内流，钠钙交换增多，细胞内钙离子增多，引起钙超载，继而闰盘两侧心肌纤维末迅速发生高强度收缩，促使线粒体移位至距闰盘较远的部位，收缩区段因缺失ATP的供应而阻碍肌原纤维的松弛，肌纤维持续性过度收缩，减少血液供应，从而在闰盘两侧形成特殊改变区带性病变^[37-43]。海洛因可致大鼠心肌细胞钙离子内流异常，其是心肌细胞不同程度损害的病理基础，也是心律失常的主要原因。

综上，大鼠心肌细胞损伤、膜电位改变及心肌细胞钙离子改变情况，能够进一步明确海洛因直接作用于钙离子通道，从而导致心肌损伤。探讨钙离子通道改变致心律失常的相关性，为海洛因成瘾患者心脏损伤的早期防治提供理论基础。那么海洛因致钙离子通道改变与凋亡是否存在相互作用？若存在又如何影响细胞凋亡，其机制有待进一步深入探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞的动作电位和L型钙通道电流

Action potential and L-type calcium channel currents in myocardial cells of rat models of heroin addiction

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