巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响

doi:10.12307/2025.020

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (7): 1380-1387.doi: 10.12307/2025.020

• 胚胎干细胞 embryonic stem cells • 上一篇下一篇

巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响

黄婷1，2，3，郑晓晗1，2，3，钟远吉1，2，3，魏艳召1，2，3，魏绪芳2，曹旭东4，冯晓丽1，2，3，赵振强1，2，3

1海南医学院第一附属医院神经内科，海南省海口市 570100；2 海南医学院，海南省海口市 570100；3 海南省热带脑科学研究与转化重点实验室，海南省海口市 570100；4 渥太华大学，加拿大渥太华 K1N6N5

收稿日期:2023-11-13 接受日期:2024-02-05 出版日期:2025-03-08 发布日期:2024-06-27
通讯作者: 赵振强，博士，主任医师，海南医学院第一附属医院神经内科，海南省海口市 570100；海南医学院，海南省海口市 570100；海南省热带脑科学研究与转化重点实验室，海南省海口市 570100 共同通讯作者：冯晓丽，硕士，主治医师，海南医学院第一附属医院神经内科，海南省海口市 570100；海南医学院，海南省海口市 570100；海南省热带脑科学研究与转化重点实验室，海南省海口市 570100
作者简介:黄婷，女，1993年生，江苏省连云港市人，汉族，海南医学院在读硕士，主要从事干细胞移植与神经系统疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81860238)，项目负责人：赵振强；海南省重点研发计划(ZDYF2018233)，项目负责人：赵振强；海南省科技厅高层次人才项目(821RC694)，项目负责人：赵振强；海南省国际科技合作人才与交流项目(G20241024014E)，项目负责人：赵振强；海南省临床医学中心建设项目(琼卫医函 [2021]276号)；海南省卫生健康行业科研项目(21A200354)，项目负责人：冯晓丽

Effects of macrophage migration inhibitory factor on survival, proliferation, and differentiation of human embryonic stem cells

Huang Ting1, 2, 3, Zheng Xiaohan1, 2, 3, Zhong Yuanji1, 2, 3, Wei Yanzhao1, 2, 3, Wei Xufang2, Cao Xudong4, Feng Xiaoli1, 2, 3, Zhao Zhenqiang1, 2, 3

1Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan Province, China; 2Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan Province, China; 3Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Brain Research and Translation, Haikou 570100, Hainan Province, China; 4University of Ottawa, Ottawa K1N6N5, Ontario, Canada

Received:2023-11-13 Accepted:2024-02-05 Online:2025-03-08 Published:2024-06-27
Contact: Zhao Zhenqiang, MD, Chief physician, Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan Province, China; Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan Province, China; Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Brain Research and Translation, Haikou 570100, Hainan Province, China; Feng Xiaoli, Master, Attending physician, Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan Province, China; Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan Province, China; Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Brain Research and Translation, Haikou 570100, Hainan Province, China
About author:Huang Ting, Master candidate, Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan Province, China; Hainan Medical University, Haikou 570100, Hainan Province, China; Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Brain Research and Translation, Haikou 570100, Hainan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81860238 (to ZZQ); Hainan Key Research & Development Program, No. ZDYF2018233 (to ZZQ); High-Level Talent Project of Hainan Provincial Science and Technology Department, No. 821RC694 (to ZZQ); Hainan International Science and Technology Cooperation Talent and Exchange Project, No. G20241024014E (to ZZQ); Hainan Clinical Medical Center Construction Project, No. QWYH[2021]276; Hainan Health Industry Scientific Research Project, No. 21A200354 (to FXL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

胚胎干细胞：来源于囊胚内部的细胞团，具有在体外无限增殖(自我更新)的能力，并且可以分化成所有3个胚层的细胞(多能性)，这些特性使得胚胎干细胞在细胞替代疗法、药物研发、再生医学等基础科学和临床研究中具有极其重要的价值。
巨噬细胞迁移抑制因子：是一种多效性细胞因子，广泛表达于多种组织和细胞中，可调控多种细胞的增殖、存活、分化和迁移等生物学过程。

背景：巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种具有多效性作用的细胞因子，可以在不同类型干细胞中自分泌并且能调控细胞的增殖、分化和迁移。课题组前期研究证实人胚胎干细胞自分泌MIF，且在培养液中浓度基本固定。然而，MIF是否参与了人胚胎干细胞的存活、增殖和分化尚不清楚。
目的：探究MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的作用。
方法：①培养人胚胎干细胞H9，CCK-8法检测并绘制细胞生长曲线，采用酶联免疫吸附法定量检测培养基中MIF水平。②为了明确外源性MIF对人胚胎干细胞存活、增殖的影响，分为：对照组，细胞在干细胞培养基中正常培养；外源性MIF组，在干细胞培养基中分别添加30，100，300 ng/mL的MIF；MIF抑制剂ISO-1组，在干细胞培养基中分别添加2，7，21 μmol/L的ISO-1；MIF+ISO-1组，在不同浓度ISO-1组中分别添加100 ng/mL MIF，采用CCK-8法检测上述各组细胞活力。③为进一步阐明MIF基因对人胚胎干细胞存活、增殖的影响，采用CRISPR-Cas9技术构建MIF敲除的H9细胞系，观察建系情况。④为了明确高浓度MIF对人胚胎干细胞初步分化是否有影响，在培养基中分别添加100 ng/mL MIF和100 ng/mL CXCR4中和抗体，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、免疫细胞荧光、蛋白质印迹法(Western blot)检测干细胞自我更新因子(KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2)及分化转录因子(FOXA2、OTX2)的表达水平。
结果与结论：①人胚胎干细胞H9的对数生长期为3-6 d，正常生长的情况下自分泌MIF水平约为20 ng/mL，与细胞量无关；②与对照组相比，添加不同质量浓度MIF对人胚胎干细胞的增殖无影响(P > 0.05)；ISO-1明显抑制人胚胎干细胞的增殖，ISO-1浓度越大，抑制越明显(P < 0.05)；ISO-1中添加MIF可以减少ISO-1的抑制作用(P < 0.05)；③RT-qPCR检测MIF基因敲除约50%后，人胚胎干细胞生长活力显著降低并且无法建系成功；④在培养基中添加100 ng/mL外源性MIF，自我更新转录因子KLF4的mRNA、蛋白及荧光表达水平均下降；分化因子FOXA2的mRNA、蛋白及荧光表达水平均上升；⑤在培养基中添加100 ng/mL CXCR4中和抗体，KLF4的mRNA及蛋白表达水平均上升；FOXA2的mRNA及蛋白表达水平均下降，与MIF组表达趋势相反。综上所述，人胚胎干细胞自分泌的MIF是其存活所必需的；培养基中额外添加MIF并不能促进人胚胎干细胞增殖，但可以使自我更新因子KLF4表达下降，转录因子FOXA2表达上升，为下一步探明MIF对人胚胎干细胞分化的影响及机制提供了线索，MIF-CXCR4轴在其中起到一定的调控作用。

https://orcid.org/0000-0001-5264-2265(黄婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Abstract: BACKGROUND: Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a pleiotropic cytokine, which is secreted in different types of stem cells and can regulate the proliferation, differentiation and migration of various types of stem cells. Our previous research has confirmed that human embryonic stem cells secrete MIF and that its concentration in the culture medium is relatively stable. However, whether MIF is involved in the survival, proliferation and differentiation of human embryonic stem cells remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of MIF on survival, proliferation, and differentiation of human embryonic stem cells.
METHODS: (1) Human embryonic stem cells H9 were cultured. The growth curve of cells was detected and plotted by CCK-8 assay. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the level of MIF in the medium. (2) To determine the effects of exogenous MIF on the survival and proliferation of human embryonic stem cells, different groups were established: the control group, which was cultured in stem cell medium without any modifications; the exogenous MIF group, which was treated with different concentrations (30, 100, 300 ng/mL) of MIF in the stem cell medium; the MIF inhibitor ISO-1 group, which was treated with different concentrations (2, 7, 21 μmol/L) of ISO-1 in the stem cell medium; and the MIF+ISO-1 group, which was treated with different concentrations of ISO-1 along with 100 ng/mL of MIF. Cell viability was assessed using the CCK-8 assay. (3) To further elucidate the effect of MIF gene on survival and proliferation of human embryonic stem cell, the MIF knockout H9 cell line was constructed by CRISPR-Cas 9 technology to observe the lineage establishment. (4) To determine the effect of high concentrations of MIF on human embryonic stem cell differentiation, 100 ng/mL MIF and 100 ng/mL of CXCR4 neutralizing antibody were separately added to the normal stem cell culture medium. The expression levels of self-renewal factors (KLF4, c-MYC, NANOG, OCT4, and SOX2) and differentiation transcription factors (FOXA2, OTX2) were measured using real-time quantitative polymerase chain reaction, immunofluorescence staining, and western blot analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The logarithmic growth phase of H9 cells was between 3-6 days. Under normal growth conditions, human embryonic stem cells secreted MIF at a concentration of approximately 20 ng/mL, independent of cell quantity. (2) Compared to the control group, the addition of different concentrations of MIF had no effect on the proliferation of human embryonic stem cells (P > 0.05). ISO-1 significantly inhibited the proliferation of human embryonic stem cells, with a stronger inhibition observed at higher concentrations of ISO-1 (P < 0.05). The addition of MIF in the presence of ISO-1 reduced the inhibitory effect of ISO-1 (P < 0.05). (3) Real-time quantitative polymerase chain reaction showed that knocking out 50% of the MIF gene resulted in a significant decrease in the growth vitality of human embryonic stem cells and failure to establish cell lines. (4) Adding 100 ng/mL exogenous MIF to the culture medium resulted in a decrease in the mRNA, protein, and fluorescence expression levels of the self-renewal transcription factor KLF4, while the mRNA, protein, and fluorescence expression levels of the differentiation factor FOXA2 increased. (5) When 100 ng/mL CXCR4 neutralizing antibody was added to the culture medium, the mRNA and protein expression levels of KLF4 increased, while the mRNA and protein expression levels of FOXA2 decreased, contrary to the expression trend observed in the MIF group. In conclusion, the endogenous secretion of MIF by human embryonic stem cells is essential for their survival. The addition of MIF to the culture medium does not promote the proliferation of human embryonic stem cells. However, it can lead to a decrease in the expression of the self-renewal factor KLF4 and an increase in the expression of the transcription factor FOXA2. This provides a clue for further investigation into the effects and mechanisms of MIF on the differentiation of human embryonic stem cells. The MIF-CXCR4 axis plays a regulatory role in this process.

Key words: macrophage migration inhibitory factor, human embryonic stem cell, autocrine, survival, differentiation, CXCR4, KLF4, FOXA2

中图分类号:

黄婷, 郑晓晗, 钟远吉, 魏艳召, 魏绪芳, 曹旭东, 冯晓丽, 赵振强. 巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1380-1387.

Huang Ting, Zheng Xiaohan, Zhong Yuanji, Wei Yanzhao, Wei Xufang, Cao Xudong, Feng Xiaoli, Zhao Zhenqiang. Effects of macrophage migration inhibitory factor on survival, proliferation, and differentiation of human embryonic stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(7): 1380-1387.

图/表（结果） 3

2.1 人胚胎干细胞在正常培养基中的生长情况及自分泌MIF水平为了解人胚胎干细胞的生长状况，用CCK-8实验检测并绘制人胚胎干细胞的生长曲线，其对数生长期在3-6 d，后续实验均用此期细胞(图1A)。正常生长的细胞为大小相对均一、胞质较为透明的形态，似铺路石样，细胞排列紧密，呈集落状生长(图1B)。在细胞正常生长情况下，取培养液进行ELISA实验，实验结果表明生理情况下分泌MIF为(20.42±0.62) ng/mL。

2.2 正常培养基中添加外源性MIF、MIF抑制剂ISO-1及敲除MIF对人胚胎干细胞存活、增殖的影响添加不同质量浓度MIF(30，100，300 ng/mL)到正常培养基中，CCK-8检测显示不同质量浓度MIF对人胚胎干细胞的增殖并无影响。添加不同浓度MIF抑制剂ISO-1(2，7，21 μmol/L)到正常培养基中，CCK-8检测显示ISO-1能够抑制人胚胎干细胞的存活，细胞数量明显下降，且浓度越大，抑制越明显。添加不同浓度ISO-1(2，7，21 μmol/L)+MIF(100 ng/mL)到正常培养基中，CCK-8检测显示MIF可以减少ISO-1的抑制作用，但无法逆转ISO-1对细胞存活的作用(图2A)。使用CRISPR/Cas9双载体慢病毒质粒系统对人胚胎干细胞进行MIF基因的敲除，通过向人胚胎干细胞内导入Cas9和sgRNA序列表达框，进而实现对MIF基因的敲除。从图中可以看出慢病毒成功感染各组细胞(图2B)。RT-qPCR检测显示，1-sgRNA成功地对细胞进行效率约为50%的MIF基因敲除(图2C)。敲除MIF基因之后的人胚胎干细胞生长活力显著降低(图2D)，光镜下观察可见细胞稀少，难以继续存活(图2E)。

2.3 外源性MIF对人胚胎干细胞初步分化的影响为进一步明确额外添加MIF对人胚胎干细胞初步分化的影响，在培养基中分别添加100 ng/mL MIF和100 ng/mL CXCR4中和抗体，与细胞共培养48 h后，检测自我更新转录因子KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2以及分化转录因子FOXA2和OTX2的表达情况。RT-qPCR以及Western blot显示，与对照组相比，MIF组的KLF4 mRNA以及蛋白表达显著下调，CXCR4中和抗体组的KLF4 mRNA以及蛋白表达显著上调，而c-MYC、NANOG、OCT4和SOX2的mRNA以及蛋白表达无显著变化；MIF组的FOXA2 mRNA以及蛋白表达显著上调，CXCR4中和抗体组的FOXA2 mRNA以及蛋白表达显著下调，OXT2的mRNA以及蛋白表达无显著变化(图3A，B)。免疫荧光显示MIF组KLF4的绿色荧光强度呈现下调的趋势，而c-MYC、NANOG、OCT4和SOX2则无明显差异；FOXA2的绿色荧光表达强度显著高于对照组，OTX2的荧光表达强度无明显差异(图3C)。上述结果显示，高于生理浓度(20 ng/mL)的MIF可以通过下调KLF4的表达以及提高FOXA2的表达对人胚胎干细胞初步分化有一定作用，MIF-CXCR4轴在其中起到一定的调控作用。

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引言

胚胎干细胞是一类具有特殊潜能的细胞，来源于囊胚期胚胎的内部细胞团，能够在体外无限扩增(自我更新)，同时具有分化为任何类型体细胞的潜能(多能性)[1]。人胚胎干细胞自我更新和多能性的维持需要多种转录因子的参与，包括OCT4、KLF4、SOX2、NANOG、c-MYC等，抑制转录因子的表达将会导致自我更新能力和多能性丧失[2]。胚胎干细胞作为一种多能性细胞，在药物研发、体外发育模型的构建及干细胞治疗等方面具有巨大的潜力和广阔的应用前景[3-4]。
巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)作为一种多效性细胞因子，广泛表达于各种类型细胞和组织中，包括免疫和神经系统细胞、垂体前叶细胞、上皮细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、滑膜成纤维细胞以及间充质细胞等，参与了多种生理和病理过程，例如：白细胞募集、炎症、免疫反应、细胞增殖、细胞分化、肿瘤发生和糖皮质激素反调节等[5-6]。MIF是一种蛋白三聚体，由114个氨基酸组成，分子质量为12.5 kD，其基因位于22号染色体(22q11.23)上[7]。MIF催化位点位于 pro-1、Lys-32、Ile-64、Tyr-95和Asn-97附近，(S，R)-3-(4-羟基苯基 )-4，5-二氢-5-异噻唑乙酸甲酯 (ISO-1)能够与该位点结合从而抑制MIF活性[7]。大多数研究表明MIF主要位于细胞质，储存在囊泡样结构中，并在某些因素刺激下分泌出来，有研究报道外泌体和细胞核中也有MIF的定位[8]。MIF以自分泌和旁分泌方式通过与受体CD74、CD44、CXCR2、CXCR4和 CXCR7形成复合体发挥其生物学功能[9]。早期的研究认为受体CD74在MIF的信号转导中起到不可或缺的作用，后期研究表明MIF可以与CXCR2、CXCR4和CXCR7直接结合发挥作用[10-11]。
课题组前期研究已经证实，人胚胎干细胞可以自分泌MIF，且在培养基中浓度基本固定[12]，但其对人胚胎干细胞存活、增殖、分化的影响及机制仍然不清楚，该研究旨在揭示MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的作用，为人胚胎干细胞研究提供新理论。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞分子生物学体外实验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2021年9月至2023年3月在海南省热带脑科学研究与转化重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞、试剂人胚胎干细胞系H9购自上海中乔新舟生物科技有限公司(ZQ0692)；293T细胞购自中科院细胞库(SCSP-502)。mTeSR™1 Basal Medium、mTeSR™1 5×Supplement、Y27632(STEMCELL，加拿大)；Matrigel® Matrix(Corning，美国)；人MIF酶联免疫吸附测定试剂盒(江莱生物，中国)；Lipofectamine 2000、Trizol(Invitrogen，美国)；Lenti-Easy Packaging Mix(吉凯基因，中国)；DMEM/F12、Accutase、Opti-MEM(Gibco，美国)；氯喹、嘌呤霉素(MCE，美国 )；Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for RT-qPCR、Hieff® RT-qPCR SYBR Green Master Mix(翌圣生物，中国)；CCK-8试剂盒(白鲨，中国)；抗荧光淬灭封片液(含DAPI)、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠(碧云天，中国)；抗SOX2、抗KLF4、抗NANOG、抗c-MYC、抗OCT4、抗FOXA2、抗OTX2(Proteintech，美国)；488荧光标记的驴抗兔、488荧光标记的驴抗鼠(Abcam，英国)。
1.3.2 实验仪器 CO2培养箱 (ESCO，新加坡)；BDS400倒置生物显微镜(重庆奥特光学，中国)；半排式细胞超净台(青岛海尔特种电器有限公司，中国)；SC-3612低速离心机(安徽中科中佳，中国)；酶标仪(Bio Tek，美国)；实时荧光定量PCR仪、基因扩增仪(Eppendorf，德国)；超微量紫外可见分光光度计(杭州遂真生物技术有限公司，中国)；全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司，中国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；SDS-PAGE电泳仪(Bio-Rad，美国)；激光共聚焦显微镜(Zeiss德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人胚胎干细胞培养人胚胎干细胞系H9在mTeSR™1 培养基中，放置于37 ℃、体积分数5% CO2和饱和湿度的培养箱常规培养，取对数生长期且状态良好的细胞用于后续实验。
1.4.2 MIF酶联免疫吸附实验收集处于对数生长期的H9细胞，以5×104个/孔密度接种于12孔板，设置3个复孔，每天换液，培养72 h，取离心后的人胚胎干细胞培养上清液，使用MIF ELISA试剂盒测定上清液中MIF水平。
1.4.3 CRISPR/Cas9技术敲除人胚胎干细胞中的MIF基因根据MIF序列(NCBI: NM002415)设计3条sgRNA，序列分别如下：sgRNA-1：5’- GAG GAA CCC GTC CGG CAC GG-3’，sgRNA-2：5’-GAC CAG CTC ATG GCC TTC GG-3’，sgRNA-3：5’- TTG GTG TTT ACG ATG AAC AT-3’，阴性对照NC-sgRNA序列为5’-CGC TTC CGC GGC CCG TTC AA-3’。根据sgRNA序列的不同，分为1-sgRNA组、2-sgRNA组、3-sgRNA组、阴性对照NC-sgRNA组以及对照组，对照组不做处理，将其余各组sgRNA序列克隆至lenti-sgRNA-EGFP质粒中，同时构建Lenti-CAS9-puro质粒。靶向sgRNA的设计与载体构建委托南京英瀚斯生物科技有限公司完成。将lenti-sgRNA-EGFP质粒DNA溶液、Lenti-Easy Packaging Mix、Opti-MEM的混合液体系与Lipofectamine 2000、Opti-MEM的混合液体系进行混合，形成DNA与Lipofectamine 2000的转染复合物，转移至添加Opti-MEM培养基的293T细胞中，培养8 h后更换含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养48 h，收集含慢病毒的细胞上清液，进行过滤、浓缩、纯化、分装。H9细胞加入Lenti-CAS9慢病毒，感染3 d后进行嘌呤霉素筛选，然后感染上述包装好的各组sgRNA慢病毒，在荧光显微镜下观察GFP表达，当荧光率达80%以上时收集细胞，接种后进行单克隆筛选及鉴定。
1.4.4 RNA提取和实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 收集1-sgRNA组、2-sgRNA组、3-sgRNA组、阴性对照NC-sgRNA组的单克隆细胞以及对照组H9细胞，使用Trizol从各组细胞中提取总RNA，使用Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix将总RNA反转录成cDNA，使用Hieff® RT-qPCR SYBR Green Master Mix配制扩增体系放到实时荧光PCR定量检测仪内进行RT-qPCR分析，检测MIF的mRNA 表达。

收集外源性添加MIF(100 ng/mL)或CXCR4中和性抗体(100 ng/mL)培养48 h后的H9细胞以及对照H9细胞，使用Trizol从各组细胞中提取总RNA，使用Hifair®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix将总RNA反转录成cDNA，使用Hieff® RT-qPCR SYBR Green Master Mix配制扩增体系放到实时荧光PCR定量检测仪内进行RT-qPCR分析，检测KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2、FOXA2和OTX2的mRNA表达。RT-qPCR使用以下热循环条件：在95 ℃下预变性5 min；然后进行40个循环(即在95 ℃下变性10 s，在55 ℃下退火20 s，在72 ℃下延伸20 s)。引物序列见表1。每个RT-qPCR实验均重复3次。采用 2-ΔΔCt方法计算mRNA表达量，内参为GAPDH。

1.4.5 CCK-8法检测细胞活性将H9细胞以6 000个/孔密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，培养24，48，72 h，每孔加入10 μL CCK-8，在37 ℃下孵育2 h，用酶标仪检测450 nm波长的吸光度值。
将H9细胞以6 000个/孔密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，然后加入不同质量浓度的 MIF(30，100，300 ng/mL)、不同浓度MIF抑制剂ISO-1(2，7，21 μmol/L)或MIF(100 ng/mL)+ISO-1(2，7，21 μmol/L)，分别培养 24，48，72 h，每孔加入10 μL CCK-8，在 37 ℃下孵育 2 h，用酶标仪检测450 nm波长的吸光度值。
将H9细胞、敲减MIF后的H9细胞以6 000个/孔密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，每天换液，培养72 h，每孔加入10 μL CCK-8，在37 ℃下孵育2 h，用酶标仪检测450 nm波长的吸光度值。
1.4.6 免疫荧光实验收集处于对数生长期的H9细胞，以2×104个/孔密度接种于放有细胞爬片的24孔板，将细胞分为对照组和MIF组，对照组加入正常mTeSR1培养基，MIF组加入含MIF(100 ng/mL)的mTeSR1培养基。培养48 h后用PBS清洗，加入40 g/L多聚甲醛冰上孵育15 min，再用预冷的PBS清洗，加入1 mL封闭液孵育30 min，分别与抗SOX2、抗KLF4、抗NANOG、抗c-MYC、抗OCT4、抗FOXA2、抗OTX2(稀释度为1∶100)在4 ℃孵育过夜，PBS清洗，避光孵育488荧光标记的驴抗兔和驴抗鼠二抗(稀释度为1∶400)1 h，PBS清洗，加入DAPI染色液覆盖细胞，孵育5 min，封固、晾干后，使用蔡司共焦激光扫描显微镜获取图像。
1.4.7 Western blot实验收集处于对数生长期的H9细胞，以3×105个/孔密度接种于6孔板，将细胞分为对照组、MIF组和CXCR4中和抗体组，对照组加入正常mTeSR1培养基，MIF组加入含MIF(100 ng/mL)的mTeSR1培养基，CXCR4中和抗体组加入含CXCR4中和抗体(100 ng/mL)的mTeSR1培养基。培养48 h后用PBS清洗，使用RIPA高效裂解液提取各组细胞中的总蛋白，使用BCA法测量蛋白浓度。加样后根据不同蛋白分子质量大小确定电压和电流条件，120 V电压分离一段时间，转移至PVDF膜上，以250 mA恒定电流转膜90 min，转膜完成后的PVDF膜用Western快速封闭液封闭10 min，分别与抗SOX2、抗KLF4、抗NANOG、抗c-MYC、抗OCT4、抗FOXA2、抗OTX2(稀释度为1∶1 000)在4 ℃摇床上孵育过夜，第2天回收一抗，TBST清洗，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和山羊抗小鼠的二抗(稀释度为1∶5 000)室温慢摇孵育2 h，移去二抗，TBST清洗，最后滴加ECL发光液显影曝光，应用Image J软件分析各组蛋白相对表达。
1.5 主要观察指标 ①人胚胎干细胞系H9在正常培养基中MIF分泌水平；②外源性MIF、MIF抑制剂ISO-1、MIF+ISO-1以及敲除MIF基因对人胚胎干细胞存活、增殖的影响；③外源性MIF(100 ng/mL)对人胚胎干细胞自我更新因子KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2，干细胞分化因子FOXA2、OTX2 mRNA、蛋白表达以及荧光强度的影响；④外源性CXCR4中和抗体(100 ng/mL)对人胚胎干细胞自我更新因子KLF4、c-MYC、NANOG、OCT4、SOX2，干细胞分化因子FOXA2、OTX2 mRNA以及蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析使用Image J软件处理Western blot实验记录的蛋白条带，得到相应灰度值，全文实验数据使用GraphPad Prism 8.0.2软件统计分析，所有实验数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析法(One-way ANOVA)，所有数据至少来自3个独立实验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过海南医学院第一附属医院统计学专家审核。

讨论

MIF是一种多功能蛋白质，具有细胞因子、酶、内分泌因子和类似分子伴侣蛋白样特征，在多种干细胞类型中表达，包括神经干细胞、心脏干细胞、内皮组细胞、间充质干细胞、软骨终板干细胞、脂肪来源干细胞和肿瘤干细胞，参与多种生物学过程[13-14]。MIF通过受体以自分泌和旁分泌方式调控细胞增殖、分化、凋亡、迁移和细胞周期进程等生物学功能[9，14]。尽管先前已有人胚胎干细胞自分泌MIF的相关研究，然而MIF对人胚胎干细胞存活、增殖和分化方面的具体作用及调控机制还尚未清楚。因此，这是首次研究MIF对人胚胎干细胞的具体作用及初步探讨调控机制，对深入了解人胚胎干细胞的生理调控及潜在应用具有重要意义。
MIF基因高度保守，在哺乳动物、鱼类、线虫、原生动物甚至细菌和植物中都有发现。不同物种MIF蛋白同源物的序列同源性在20%-100%之间，人与鼠MIF序列同源性高达90%[15]。MIF缺乏转运至内质网(ER)/高尔基体(Golgi)的N端信号肽序列，因此，MIF的分泌被认为是通过非经典分泌途径发生的[15]。研究表明，正常情况下，健康个体的血清MIF水平在0.2-8.3 ng/mL之间[6]。
该研究结果显示，正常生长的人胚胎干细胞能够自分泌MIF大约20 ng/mL，且保持在恒定水平，这种现象表明MIF的分泌受到生理性调节机制的调控，确保MIF在细胞中维持在适当的水平，以发挥其对细胞的正常功能。既往有研究报道MIF mRNA在小鼠排卵的卵母细胞、受精卵、双细胞胚胎、八细胞胚胎和囊胚中均有表达[16]。MIF在人胚胎着床和早期胚胎发育过程中显著表达，孕妇血清MIF水平在整个生理妊娠期间没有发生变化，但高于未妊娠女性，妊娠早期母体血清MIF水平降低与复发性流产有关[8，17]。以上研究说明了高浓度MIF在胚胎发育过程中起着重要的作用，而人胚胎干细胞源自囊胚的内细胞团，该研究发现人胚胎干细胞自分泌MIF水平远远高于正常健康血清中MIF浓度范畴，说明人胚胎干细胞自分泌的高水平MIF对人胚胎干细胞的正常发育至关重要，通过检测MIF水平的异常变化，可以为妊娠相关疾病的早期诊断和治疗提供一定的参考。然而，MIF分泌的确切机制尚不清楚，研究表明高尔基体囊泡转运蛋白P115以及ATP结合盒转运蛋白亚家族1(ABC1)与MIF的分泌有关[18]。
研究表明MIF可以通过自分泌和/或旁分泌途径增加Akt、Erk、AMPK和Stat3的磷酸化以及Hes3和Egfr的表达，从而促进神经干细胞的增殖和/或存活以及自我更新[19]。另有研究报道MIF通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进神经干细胞增殖及其向神经元谱系分化[20]。还有研究表明，MIF作用于衰老的骨髓间充质干细胞能够促使其恢复“年轻化”，减少缺氧/缺血诱导的细胞凋亡[21-22]。虽然研究发现多种成体干细胞表达MIF并且参与多种重要的细胞功能，但是鲜有研究报道MIF对于人胚胎干细胞的确切作用。该研究外源性添加不同质量浓度MIF与人胚胎干细胞共孵育，观察到其对人胚胎干细胞的增殖无影响，添加MIF抑制剂ISO-1后人胚胎干细胞的存活受到严重抑制，敲除MIF基因后的人胚胎干细胞甚至无法存活。MIF与其他因子的不同之处在于，MIF是半组成型表达，并且是预先从储存池中分泌到体内循环，以维持细胞的正常生理功能[23]。以上研究充分说明MIF参与干细胞的正常生理功能维持，生理浓度的MIF对于人胚胎干细胞的存活必不可少。
KLF4也称为胃肠富集Krüppel样因子或表皮锌指因子，是一种进化保守的真核生物锌指蛋白转录因子，在细胞增殖、分化及胚胎发育等生命过程中发挥重要作用[24]。有研究认为KLF4是分化过程中第一个从转录相关复合体中移除的多能性转录因子。KLF4的核输出是脱离多能状态并致力于分化的关键第一步[25]。该研究外源性添加100 ng/mL MIF与细胞共培养48 h，发现KLF4在基因层面、蛋白层面和荧光表达强度方面都出现显著性下调，c-MYC、OCT4、SOX2和NANOG等因子无明显变化。KLF4是连接外部转录因子和核心多能性网络(c-MYC、NANOG、OCT4和SOX2)的关键因子[26]。因此，KLF4下调意味着人胚胎干细胞自我更新与分化之间的稳态被打破，转而进入分化。
叉头转录因子家族成员FOXA2在胚胎干细胞分化的早期阶段上调，是代表谱系分化的原始调节因子[27]。FOXA2作为“先锋因子”，能够结合到核小体DNA的特定序列上，并募集到封闭的染色质，通过多种机制诱导局部染色质打开，允许其他特殊的调节性蛋白质进入到DNA中，激活沉默基因网络开始进入分化命运的程序[28-29]。OTX2是编码大脑、小脑、松果体和眼睛正常发育所必需的转录因子[30]。该研究外源性添加100 ng/mL MIF与细胞共培养48 h，发现FOXA2在基因层面、蛋白层面和荧光表达强度方面均显著上调，而OTX2的表达无显著性差异。以上结果充分说明高于生理浓度的MIF作用于人胚胎干细胞，导致KLF4下调，打破了维持人胚胎干细胞多能性的调控网络，使人胚胎干细胞退出了多能性状态，同时上调FOXA2开启人胚胎干细胞分化的第一步。
趋化因子受体 CXCR4 是一种7跨膜G蛋白偶联受体，在大多数细胞中表达，包括造血细胞、内皮细胞、神经元和干细胞(胚胎和成体)，在胚胎发育、造血和定向趋化中起着至关重要的作用[31]。CXCR4被CXCL12激活后可促进人胚胎干细胞向神经干细胞分化，并有助于维持其干性[31]。MIF的Arg-Leu-Arg(RLR)序列区域87-89与CXCR4的位点-1结合，N-环样基序与CXCR4位点-2结合[32]。以上结果为MIF-CXCR4轴的存在提供了直接依据。研究表明MIF直接与CXCR2/4结合，通过诱导G蛋白偶联受体相关信号传导，导致磷脂酶C活化，引发胞内钙离子释放，进而激活MAPK、PI3K-AKT等细胞内信号通路[14，33-34]。CD74和CXCR4都在MIF的网格蛋白依赖性内吞作用中发挥作用，CXCR4可以独立于CD74介导MIF的内吞作用，而CD74的存在会加速MIF的内吞作用[35]。MIF诱导ERK磷酸化和B细胞的趋化性可由单独的CXCR4和CXCR7途径、CXCR4/CXCR7异二聚体复合物途径或两者共同介导[10]。课题组的前期研究表明，人胚胎干细胞不表达 MIF的经典受体CD74和CD44，CXCR2、CXCR7受体高表达，CXCR4弱表达[12]。该研究添加100 ng/mL CXCR4中和抗体后，发现KLF4在基因和蛋白层面上表达明显增加，FOXA2在基因和蛋白层面上表达均明显下降，与MIF组表达趋势相反，由此作者推测，高于生理浓度的MIF可能通过MIF-CXCR4轴对人胚胎干细胞的初步分化起到一定的调控作用，其深入机制还尚未明确，仍需进一步探索。
总之，该研究证实，人胚胎干细胞自分泌MIF且在培养基中浓度基本固定，与细胞数量无关，MIF不促进人胚胎干细胞的增殖，但对人胚胎干细胞的存活至关重要。外源性MIF通过降低KLF4的表达并且促进FOXA2的表达，对人胚胎干细胞的初步分化有一定作用。MIF可能通过MIF-CXCR4轴对人胚胎干细胞的信号传导起到一定的调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

巨噬细胞迁移抑制因子对人胚胎干细胞存活、增殖和分化的影响

Effects of macrophage migration inhibitory factor on survival, proliferation, and differentiation of human embryonic stem cells

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