干细胞来源与组织来源小细胞外囊泡诱导脂肪新生的比较

doi:10.12307/2024.171

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 3981-3987.doi: 10.12307/2024.171

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干细胞来源与组织来源小细胞外囊泡诱导脂肪新生的比较

杨宝华，周晓洁，敬伟，田卫东，于湄

四川大学华西口腔医(学)院，口腔再生医学国家地方联合工程实验室，四川省成都市 610041

收稿日期:2023-05-13 接受日期:2023-06-21 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-23
通讯作者: 于湄，博士，副教授，四川大学华西口腔医(学)院，口腔再生医学国家地方联合工程实验室，四川省成都市 610041
作者简介:杨宝华，女，1997 年生，广东省揭阳市人，汉族，四川大学华西口腔医学院在读硕士，主要从事干细胞与再生医学方面的研究。
基金资助:
四川省科技计划重点研发项目(2019YFS0312)，项目负责人：于湄；国家自然科学基金(81971319)，项目负责人：敬伟；国家自然科学基金区域创新发展联合基金(U21A20369)，项目负责人：田卫东

Comparison of small extracellular vesicles derived from stem cells and tissue on de novo adipose regeneration

Yang Baohua, Zhou Xiaojie, Jing Wei, Tian Weidong, Yu Mei

National Engineering Laboratory for Oral Regenerative Medicine, West China School of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2023-05-13 Accepted:2023-06-21 Online:2024-09-08 Published:2023-11-23
Contact: Yu Mei, PhD, Associate professor, National Engineering Laboratory for Oral Regenerative Medicine, West China School of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Yang Baohua, Master candidate, National Engineering Laboratory for Oral Regenerative Medicine, West China School of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
Key Technology Research and Development Program of Sichuan Province, No. 2019YFS0312 (to YM); National Natural Science Foundation of China, No. 81971319 (to JW); National Natural Science Foundation of China (Regional Innovation and Development Joint Fund), No. U21A20369 (to TWD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

小细胞外囊泡：胞外囊泡是一类可以由各种不同类型细胞分泌的具有双层脂质膜的不可复制的颗粒总称。根据囊泡粒径大小分为大细胞外囊泡(粒径大于200 nm)和小细胞外囊泡(粒径小于200 nm)。目前广为关注的外泌体属于小细胞外囊泡，携带多种内容物，如蛋白质、脂质、DNA、RNA等，是细胞间交流的重要信使。
脂肪新生：是指在没有脂肪组织的部位重新形成具有成熟脂肪细胞的组织形态，如小鼠皮下植入充填了Matrigel和胞外囊泡的无细胞硅胶管，硅胶管内形成脂肪组织即为脂肪新生。

背景：再生医学近几十年的发展，使胞外囊泡诱导脂肪组织再生成为修复软组织缺损的可行方法。但由于实验模型不同以及胞外囊泡使用剂量不同，目前仍无法对不同来源胞外囊泡在脂肪再生中的应用效果进行定量比较。

目的：比较干细胞来源小细胞外囊泡与组织来源小细胞外囊泡在体内诱导脂肪新生的效果。
方法：采用超速离心法提取脂肪干细胞来源小细胞外囊泡和脂肪组织来源小细胞外囊泡，采用纳米颗粒跟踪分析、透射电镜和Western blot鉴定比较2种小细胞外囊泡的数量、粒径、形态和标志蛋白表达；使用定制硅胶管建立C57小鼠皮下脂肪新生定量评估模型，通过细胞计数和苏木精-伊红染色比较2种小细胞外囊泡体内促进脂肪组织新生的效果。

结果与结论：①通过超速离心法提取2种小细胞外囊泡，粒径均位于50-200 nm之间，在透射电镜下均为典型的圆形，均表达小细胞外囊泡的特征性蛋白CD81、CD63、TSG101；②使用定制硅胶管，将等粒子数小细胞外囊泡与Matrigel凝胶混合于硅胶管中植入小鼠背部皮下，建立小鼠体内无细胞、可定量的脂肪新生模型；③植入后3，7 d，硅胶管内容物苏木精-伊红染色和细胞计数显示，加入了小细胞外囊泡的2组都比空白对照组募集到更多的宿主细胞，且脂肪组织来源小细胞外囊泡组优于脂肪干细胞来源小细胞外囊泡组；④体内植入4周的硅胶管内容物苏木精-伊红染色显示，小细胞外囊泡促进脂肪新生，且脂肪组织来源小细胞外囊泡组优于脂肪干细胞来源小细胞外囊泡组。以上结果表明，组织来源小细胞外囊泡促进脂肪新生的效果优于干细胞来源小细胞外囊泡。

https://orcid.org/0000-0003-0306-6817 (于湄)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪干细胞, 脂肪组织, 小细胞外囊泡, 细胞募集, 脂肪细胞, 脂肪新生

Abstract: BACKGROUND: De novo adipose regeneration induced by small extracellular vesicles has become a promising method for repairing soft tissue defects. However, due to different animal models and small extracellular vesicle application dosages, it is difficult to quantitatively compare the therapeutic effect of small extracellular vesicles from various sources on adipose regeneration.
OBJECTIVE: To compare the regenerative effects of small extracellular vesicles derived from stem cells and small extracellular vesicles from tissue.
METHODS: Small extracellular vesicles derived from adipose-derived stem cells and from adipose tissue were isolated by ultracentrifugation. The particle number, particle size, morphology, and protein expression of small extracellular vesicles were identified by nanoparticle tracking analysis, transmission electron microscopy and western blot assay. A quantitative and evaluative subcutaneous model for adipose regeneration in C57 mice was established using a customized silicone tube. The regenerative effects of induced de novo adipose were compared by cell counting and hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Small extracellular vesicles derived from adipose-derived stem cells and from adipose tissue were isolated by ultracentrifugation. Both small extracellular vesicles were round-shape in transmission electron microscopy with particle size between 50-200 nm, and abundant with the small extracellular vesicles marker protein CD81, CD63 and TSG101. (2) An equal number of small extracellular vesicles were mixed with matrigel in customized silicone tubes, implanted subcutaneously in the back of mice to establish a cell-free and quantifiable adipose regeneration model. (3) On days 3 and 7 after implantation, the results of cell counting and hematoxylin-eosin staining showed that both small extracellular vesicle groups recruited more host cells than the blank group, and the small extracellular vesicles derived from adipose tissue group were superior to the small extracellular vesicles derived from adipose-derived stem cell group. (4) 4 weeks after implantation, hematoxylin-eosin staining of the contents in silicone tubes showed that small extracellular vesicles induced de novo adipose regeneration in vivo, and the small extracellular vesicles derived from adipose tissue group were superior to the small extracellular vesicles derived from adipose-derived stem cell group. The above results indicated that small extracellular vesicles derived from tissues have a superior effect on inducing de novo adipose regeneration compared to small extracellular vesicles derived from stem cells.

Key words: adipose-derived stem cell, adipose tissue, extracellular vesicle, cell recruitment, adipocyte, de novo adipose

中图分类号:

杨宝华, 周晓洁, 敬伟, 田卫东, 于湄. 干细胞来源与组织来源小细胞外囊泡诱导脂肪新生的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 3981-3987.

Yang Baohua, Zhou Xiaojie, Jing Wei, Tian Weidong, Yu Mei. Comparison of small extracellular vesicles derived from stem cells and tissue on de novo adipose regeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 3981-3987.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪干细胞的鉴定结果光学显微镜下见脂肪干细胞形态呈长梭形，胞体狭长，有一定方向性，见图1A。用成脂诱导液处理10 d诱导脂肪干细胞成脂分化，油红O染色后在光学显微镜下可见细胞内形成了红色的脂滴，见图1B。流式细胞仪鉴定显示脂肪干细胞标志物CD29的标记率为99.6%，CD90的标记率为100%，CD105的标记率为99.9%，CD31、CD45表达均在1%以下，具有典型的间充质干细胞特征，见图1C。

2.2 两种sEV的提取与鉴定结果 sEV-ASC与sEV-AT的提取流程见图2A。根据培养液体积及所获取的sEV颗粒数计算sEV的产率，结果显示sEV-ASC产率为2.45×108颗粒/mL，而sEV-AT产率为3.73×109颗粒/mL，在相同体积的培养液中，sEV-AT颗粒数目是sEV-ASC颗粒数目的15.2倍(P < 0.01)，sEV-AT产量远大于sEV-ASC，见图2B。纳米颗粒跟踪分析结果显示，sEV-ASC和sEV-AT的粒径绝大部分在50-200 nm之间，sEV-ASC平均粒径为125 nm，sEV-AT的平均粒径为137 nm，sEV-ASC比sEV-AT的平均直径略小，都符合sEV的直径范围，见图2C；Western blot检测显示sEV-ASC和sEV-AT均表达外泌体标志蛋白CD81、CD63、TSG101，不表达β-actin 蛋白，见图2D。透射电镜结果显示，sEV-ASC和sEV-AT均显示出典型的类圆形囊泡状结构，见图2E。

2.3 小鼠硅胶管内脂肪新生模型建立定制的硅胶管整体呈一个空心圆环状[27]，具体尺寸：内环大直径为4.77 mm，内环环宽为1 mm，外环大直径为10.77 mm，外环环宽为2 mm，外环上固定小孔直径为1 mm，外环高度为1 mm，总高度为4 mm，见图3A；按需求配制内容物后注射入硅胶管内，37 ℃下放置30 min后呈胶冻状凝固，见图3B。
术中小鼠背部正中切口约为1 cm长，左右钝性分离背部皮下组织至能容纳硅胶管，将图3B中的硅胶管外环朝皮肤放入小鼠皮下，见图3C，对称穿过硅胶管外环的缝合小孔将硅胶管缝合于小鼠皮肤，稳定于小鼠背部后缝合正中切口，见图3D。

2.4 两种sEV募集宿主细胞效果比较对小鼠体内植入3 d硅胶管内容物进行苏木精-伊红染色，结果显示，宿主细胞主要集中在植入硅胶管与小鼠皮肤连接处，见图4A，空白对照组的细胞数最少，加入了sEV的2组都比空白对照组募集到更多的细胞。对硅胶管内总细胞数进行计数，结果也显示空白对照组的细胞数最少，平均为8.9×105个，加入了sEV的2组都比空白对照组募集到更多的细胞，且sEV-AT组(平均为2.1×106个)比sEV-ASC组(平均为1.7×106个)募集到的细胞更多，见图4C。
对小鼠体内植入7 d硅胶管内容物进行苏木精-伊红染色，结果显示各组植入硅胶管与小鼠皮肤连接处的浸润细胞比植入3 d时均有增加，见图4B；对硅胶管内总细胞数进行计数，结果显示空白对照组中的细胞数为1.2×106个，sEV-ASC组为1.7×106个，sEV-AT组浸润细胞数最多，平均为2.4×106个，见图4D。

2.5 两种sEV促进脂肪新生效果的比较植入后4周，在小鼠背部行矢状位正中切口，钝性分离皮下组织，翻开，从小鼠体内取出硅胶管，对内容物进行苏木精-伊红染色，如图5A所示，空白对照组没有明显的脂肪组织生成；sEV-AT组和sEV-ASC组可见新生血管以及空泡状的脂肪细胞形成，计算新生脂肪组织占硅胶管切面面积的比例，结果表明sEV-AT组比sEV-ASC组的新生脂肪组织的面积更大，见图5B。

2.6 生物相容性在实施体内实验整个过程中，3组小鼠均未发生背部感染，小鼠皮肤内未见明显异物生长现象，也未发现实验小鼠有发热、身体不适、不喜饮食等症状。因此，2种sEV具有极好的生物相容性。

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引言

因衰老、先天因素、病理因素(如创伤、肿瘤和退行性疾病等)造成的软组织缺损在现今的社会仍然屡见不鲜，如何对软组织缺损进行重建，许多研究团队正在不断进行新的尝试。随着再生医学的发展，通过脂肪再生来修复软组织缺损成为一个可行的方法。干细胞因其来源多样、高增殖活性、良好的免疫调节功能和多向分化潜能得到广泛研究[1-2]。研究表明，干细胞发挥治疗作用的是其分泌的旁分泌因子，而不是干细胞本身[3]。在这些旁分泌因子中，小细胞外囊泡(small extracellular vesicles，sEV)因其低免疫原性、可长期冻存、可通过血脑屏障、可加载特异性药物等优点在无细胞组织再生中得以应用[4-6]。
sEV是直径为50-200 nm有双层脂质膜的囊泡，不能自我复制[7-9]，可以由各种不同类型的细胞分泌，携带其来源细胞的内容物，如蛋白质、脂质、DNA、RNA等，现被普遍认为是细胞间交流的重要信使[5，10-12]，在脂肪再生研究中也得到广泛关注。例如，脂肪干细胞来源sEV(small extracellular vesicles from adipose-derived stem cell，sEV-ASC)[13-15]、脂肪组织来源sEV(small extracellular vesicles from adipose tissue，sEV-AT)[16-20]、人脂肪瘤组织来源sEV[21]、骨髓间充质干细胞来源sEV[22]、月经血来源sEV均能够在动物体内促进脂肪再生[23-24]。但是由于各研究团队采用的体内脂肪再生实验模型不同以及sEV使用剂量不同，无法对不同sEV诱导的脂肪再生效果进行系统比较。该研究通过建立小鼠体内无细胞脂肪新生模型，同期、同模型、同剂量比较sEV-ASC和sEV-AT体内诱导脂肪新生的效果，明确sEV来源对脂肪新生能力的影响，为未来选择最佳用于脂肪再生相关研究的sEV提供参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差
分析。
1.2 时间及地点实验于2021年12月至2023年3月在四川大学华西口腔医学院口腔疾病国家重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 Sprague Dawley(SD)大鼠、C57BL/6小鼠购自成都达硕实验动物有限公司(中国)。3周龄雌性SD大鼠30只，体质量45-55 g，用于提取脂肪干细胞和sEV-AT；6周龄雌性C57BL/6小鼠22只，体质量14-16 g，用于2种不同来源sEV体内功能验证。实验方案经四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准，批准号为WCHSIRB-D-2023-296。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂和仪器 α-MEM培养基、青霉素、链霉素(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶消化液、胎牛血清(美国 Gibco 公司)；无外泌体血清(胎牛血清在4 ℃下120 000×g离心18 h后收集上清)；BCA蛋白定量试剂盒(中国凯基公司)；单克隆抗体：CD81(中国正能公司)、CD63(中国正能公司)、TSG101(英国Abcam公司)、β-actin(中国正能公司)、CD90(英国Abcam公司)、羊抗兔IgG-HRP(中国正能公司)；CD29-FITC、CD31-PE、CD45-FITC抗体(美国BD公司)、CD105-FITC(美国Invitrogen公司)；荧光二抗Alexa FluoR 488 Goat anti Mouse(美国Invitrogen公司)；蛋白电泳仪、转印系统(美国Bio-Rad公司)；Tanon5200化学发光成像仪(中国天能公司)；Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)；Matrigel胶(美国Corning公司)；高速离心机、超速冷冻离心机(美国Beckman公司)；透射电镜(日本Hitachi公司)；纳米颗粒跟踪分析仪(德国 Particle Metrix公司)；JIMBIO FIL流式图像计数仪(中国卓微公司)；BD Accuri C6 流式细胞仪(美国BD公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 脂肪干细胞的提取与培养取3周龄SD大鼠腹股沟脂肪垫，用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的生理盐水彻底清洗并挑除血管组织，剪碎为1.0-2.0 mm3的小块，加入其2倍体积的0.075% Ⅰ型胶原酶于37 ℃的CO2培养箱中消化1 h，期间每隔5 min将组织振荡混匀，将消化获得的乳糜状组织加入等体积含胎牛血清的α-MEM培养基终止消化，400×g离心5 min，用生理盐水重悬洗涤细胞沉淀，400×g离心5 min，用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基重悬细胞沉淀，将细胞混悬液接种到T25培养瓶，于37 ℃的CO2培养箱中培养，隔天换液1次，当细胞达到80%-85%融合时，用PBS清洗2遍，胰蛋白酶消化并以1∶3比例传代。为了收集用于sEV提取的细胞培养上清液，从第3代起，换用含体积分数10%无外泌体血清的α-MEM培养基。
1.4.2 脂肪干细胞的鉴定
(1)成脂诱导：将培养的第3代脂肪干细胞以4×104个/孔接种于12孔板，12 h后用PBS洗涤，更换培养基(含体积分数10%胎牛血清、1 mmol/L地塞米松、10 mmol/L胰岛素、200 mmol/L吲哚美辛和0.5 mmol/L IBMX的α-MEM培养基)，每孔2 mL，每2 d更换1次培养基，第10天时细胞用PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定 30 min，PBS洗涤2 min，用油红O溶液避光染色30 min，PBS洗涤2次，在光学显微镜下拍照。
(2)流式细胞仪检测：将培养的第3代脂肪干细胞进行表面抗原标志物检测，取100 μL细胞悬液(细胞数为6×105个)于EP管中，分别加入CD90、CD29-FITC、CD105-FITC、CD31-PE、CD45-FITC抗体100 μL(抗体用含体积分数2%胎牛血清的PBS以1∶100稀释)，4 ℃避光孵育30 min，孵育结束后加入含体积分数2%胎牛血清的PBS，400×g离心5 min洗涤2次，孵育CD90的EP管中加入荧光二抗Alexa FluoR 488 Goat anti Mouse 500 μL(抗体用含体积分数2%胎牛血清的PBS以1∶500稀释)，室温下避光孵育30 min，用含体积分数2%胎牛血清的PBS，400×g离心5 min洗涤2次，最后用100 μL含体积分数2%胎牛血清的PBS重悬每个EP管中的细胞，上BD Accuri C6 流式细胞仪检测。

1.4.3 sEV-ASC提取收集第3-5代脂肪干细胞的培养上清，4 ℃环境下连续差速离心(300×g离心10 min，2 000×g离心10 min，10 000×g离心30 min)收集上清；4 ℃，100 000×g离心70 min，轻轻倒去上清，收集底部沉淀，用PBS稀释洗涤，再次4 ℃，100 000×g离心70 min，收集沉淀用PBS重悬，分装，-80 ℃保存[25]。

1.4.4 sEV-AT提取取3周龄SD大鼠腹股沟脂肪垫，用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的生理盐水彻底清洗并挑除血管组织，剪碎为1.0-2.0 mm³的小块，按脂肪(g) ∶α-MEM培养基(mL)=1∶10比例加入转速为100 r/min的悬浮培养瓶，于37 ℃的CO2培养箱中培养48 h后，过4层无菌纱布，再过40 μm细胞筛后收集培养基，4 ℃环境下连续差速离心(300×g离心10 min，2 000×g离心10 min，10 000×g离心 30 min)收集上清；4 ℃下2次100 000×g离心70 min，收集沉淀用PBS重悬分装，-80 ℃保存[26]。
1.4.5 sEV的鉴定
(1)粒径和浓度：将PBS稀释后的sEV用1 mL注射器缓慢注射入ZetaView分析仪，用NTA v3.2软件进行分析，测量出纳米粒子的粒径和浓度。
(2)透射电镜观察形态：sEV用2.5%戊二醛固定10 min，洗涤后加载到载样铜网上，室温下静置5 min，用滤纸轻轻吸去铜网边缘液体，室温晾干，向铜网上滴加1%乙酸双氧铀负染10 min后用滤纸轻轻吸去铜网边缘水分，室温晾干，通过透射电子显微镜观察并拍照。
(3)Western blot 检测：在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离sEV和脂肪干细胞蛋白质，上样量为20 μg/孔，并转移到PVDF膜上。将膜浸润在5%牛奶中封闭1 h，用CD81、CD63、TSG101和β-actin一抗在4 ℃下孵育过夜，TBST 洗涤3次后在室温下孵育二抗1 h，再用TBST洗涤3次。使用Tanon5200化学发光成像仪进行拍照。

sEV-ASC与sEV-AT培养、鉴定比较，见表1。

1.4.6 C57BL/6小鼠硅胶管内脂肪新生模型的建立定制硅胶管(华泓硅塑胶制品有限公司)按照内容物的不同分为3组：对照组(生理盐水+Matrigel)、sEV-ASC组(Matrigel+sEV-ASC)、sEV-AT组(Matrigel+sEV-AT)。Matrigel∶生理盐水/sEV=1∶1，每个硅胶管内容体积为100 μL，其中添加sEV的实验组按照sEV的粒子数为2×1011颗粒/mL配置。以30 mg/kg的剂量用戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，在小鼠左右两侧背部皮下分别植入1个硅胶管，每只小鼠背部的2个硅胶管内容物不相同。实验共使用22只小鼠，分别于植入3，7 d每个时间点取样9只，共有18个硅胶管，每组各6个硅胶管，每组随机取3个硅胶管用于细胞计数，另外3个硅胶管用于组织染色。植入4周后取样4只，共有8个硅胶管用于组织染色，对照组2个硅胶管，sEV-ASC组、sEV-AT组各3个硅胶管。
1.4.7 细胞计数植入后第3天和第7天，取出硅胶管，分离出管中内容物，剪碎后加入含0.2%胶原酶的PBS在37 ℃的CO2培养箱中消化1 h，400×g离心5 min后，用200 μL含体积分数2%胎牛血清的PBS重悬，取10 μL用JIMBIO FIL计数仪进行细胞计数。
1.4.8 组织染色植入后第3天、第7天和第4周，取出硅胶管，将硅胶管与组织一起于40 g/L多聚甲醛中固定过夜，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。将石蜡包埋的组织块按照硅胶管形态纵向切成5 μm厚的切片，进行苏木精-伊红染色。采用 Image J 软件计算第4周时在硅胶管中心点同一视野中新生脂肪组织面积占硅胶管截面面积的比例。
1.5 主要观察指标 ①sEV的鉴定结果；②sEV对宿主细胞的募集作用；③sEV对脂肪新生的作用。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 9 软件进行统计分析。所有数据均表示为x±s。采用单因素方差分析比较多组数据间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义，文章统计学方法已经通过四川大学华西口腔医院敬伟教授审核。

讨论

再生医学的快速发展为软组织缺损修复奠定了坚实的理论基础，其中干细胞技术在再生医学中被广泛研究，目前已有18个干细胞产品获批上市[28]，虽然干细胞技术的临床应用被逐渐提上日程，但是越来越多的体内外研究表明，干细胞通过旁分泌方式发挥其再生潜力，sEV在旁分泌物中占据主导地位，被广泛用于再生医学研究[4，29]。
实验采用的小鼠硅胶管是在课题组前期发表的大鼠体内移植模型的基础上改进而来[16]。采用体外预先凝固的方式能使sEV固定于硅胶管模型中，硅胶管的外环设计使其能使用缝线固定于小鼠背部，并且整个脂肪新生模型可根据硅胶管的尺寸对新生组织进行定量。但在实验过程中发现，硅胶管尺寸过大会引起小鼠弓背、易感染、皮肤破溃等现象，植入后4周，个别小鼠体内留存下来的硅胶管组织学切片无法观察到良好的新生脂肪组织。因此，该实验调整了硅胶管高度，成功在小鼠体内诱导脂肪组织新生，强调了在沿用动物模型时需要考虑模型与动物的适用性。
该实验皮下植入的硅胶管中只有martigel和sEV，没有额外添加外源细胞，因此硅胶管中出现的脂肪组织是一种无细胞的脂肪新生。研究表明，与植入干细胞相比，单独植入sEV的无细胞组织再生可以减少免疫排异和肿瘤形成的可能性[30]，而且sEV的来源丰富，不仅来自于单纯的细胞培养基，还可以从体液、组织液、组织中直接获取[31-35]，在再生医学领域具有广阔的应用潜能。间充质干细胞来源sEV在免疫调节和组织再生中发挥着重要作用[5，36]，可以诱导巨噬细胞从促炎的M1型向抗炎的M2型转变，从而控制炎症反应，加速修复和再生过程[37]，也可以通过促进血管生成改善脂肪移植保留的能力[38]。而组织来源sEV来源于体内真实的组织微环境，携带更丰富和准确的组织微环境信息，能够真实反映细胞间通信[31，39]。
虽然现今研究集中于细胞来源sEV，特别是具有免疫调节作用的间充质干细胞来源sEV，但是细胞培养的环境单一，并不能模拟体内复杂环境，其来源sEV所携带的生物信息丰富度和真实性不及组织来源sEV。在各种sEV用于脂肪新生的研究中并未设计同期、同模型、同剂量比较不同来源sEV在动物体内诱导脂肪新生的效果，该实验首次将sEV-AT和sEV-ASC进行系统比较，发现无论是在早期的细胞募集还是在体内诱导脂肪组织新生，sEV-AT的诱导效果都优于 sEV-ASC。sEV-AT来自于脂肪组织的悬浮培养，只需培养48 h即可收集，而收集sEV-ASC则需要经过细胞的连续培养与传代，一般需要12-18 d的时间，在所需提取时间上来说，使用组织来源胞外囊泡也更具有优势。因此选择使用sEV-AT诱导脂肪组织再生更为合适，为今后sEV-AT的研究及临床应用提供新思路。
尽管发现sEV可以有效诱导脂肪组织新生[16]，但具体的诱导机制还需要进一步探索。sEV可能通过激活NF-κB信号通路促进巨噬细胞释放趋化因子，以募集宿主细胞从而诱导脂肪再生[40]。sEV也可能通过促进干细胞的增殖和迁移，促进血管生成，从而诱导脂肪组织再生[18]。实验结果表明，不同来源sEV诱导脂肪再生的能力并不相同，实验室前期结果也表明，脂肪组织释放的sEV富含多种miRNA[41-42]，并且与sEV-ASC相比较，sEV-AT有更多的与脂肪生成相关的miRNA。因此sEV中对组织再生发挥作用的特定生物活性成分(miRNA、长链非编码RNA、蛋白质)也需要进一步发掘，并研究其发挥作用的具体机制。
尽管不同来源sEV在组织修复和再生中发挥的作用可能存在着差异，但是在诱导脂肪组织新生方面，该实验结果显示2种不同来源sEV都比不添加sEV的空白对照组效果好，所以sEV在组织修复和再生的无细胞疗法中是具有研究价值和临床应用潜力的。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

干细胞来源与组织来源小细胞外囊泡诱导脂肪新生的比较

Comparison of small extracellular vesicles derived from stem cells and tissue on de novo adipose regeneration

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