脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯管体外构建组织工程化尿液流出道行犬尿流改道

doi:10.12307/2022.275

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (22): 3487-3491.doi: 10.12307/2022.275

• 复合支架材料 composite scaffold materials • 上一篇下一篇

脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯管体外构建组织工程化尿液流出道行犬尿流改道

刘俊炜，杨嗣星，熊云鹤，宋超，廖文彪，孟令超，李德，宋钱林，何子奇，李彬

武汉大学人民医院泌尿外Ⅱ科，湖北省武汉市 430060

收稿日期:2020-12-28 修回日期:2021-01-30 接受日期:2021-05-21 出版日期:2022-08-08 发布日期:2022-01-12
通讯作者: 杨嗣星，主任医师，武汉大学人民医院泌尿外Ⅱ科，湖北省武汉市 430060
作者简介:刘俊炜，女，1996年生，湖北省武汉市人，汉族，武汉大学第一临床学院在读硕士，主要从事泌尿系组织工程研究。

Construction of tissue-engineered urine outflow tract using adipose stem cells and expanded polytetrafluoroethylene for canine urinary diversion

Liu Junwei, Yang Sixing, Xiong Yunhe, Song Chao, Liao Wenbiao, Meng Lingchao, Li De, Song Qianlin, He Ziqi, Li Bin

Second Department of Urology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Received:2020-12-28 Revised:2021-01-30 Accepted:2021-05-21 Online:2022-08-08 Published:2022-01-12
Contact: Yang Sixing, Chief physician, Second Department of Urology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Liu Junwei, Master candidate, Second Department of Urology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脂肪干细胞：是一种由脂肪组织中提取出来的成体干细胞，具有向多种细胞类型分化的能力，具有获取较易、分离培养简便、安全及取材过程对机体创伤小的特点。在特定的培养条件下，脂肪干细胞在体外环境下可以向尿路上皮细胞分化。
组织工程尿液流出道：是由人工材料和组织或细胞构成一种细胞-材料复合物，移植到体内后可替代原有的膀胱或尿道构成组织工程尿液流出道。实验利用条件培养基将脂肪干细胞定向诱导分化为尿路上皮细胞，种植于膨体聚四氟乙烯工程管上构成组织工程尿液流出道，移植入比格犬体内，发现其与犬具有良好相容性且具备引流尿液、防止尿外渗的功能，证明组织工程尿液流出道具有应用于人类的潜在可能性。

背景：利用组织工程技术在体外构建形成具有良好抗尿液渗漏性能的组织工程管，能够显著降低各类围术期并发症的发生率。
目的：应用脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯管在体外构建组织工程化尿液流出道，尝试用于犬尿流改道手术，评估其可行性。
方法：实验组取4只雌性比格犬，分离培养脂肪干细胞，在体外向尿路上皮细胞定向诱导分化14 d，将诱导分化后的细胞种植于膨体聚四氟乙烯工程管内表面，构成组织工程尿流改道装置；切除犬膀胱组织(仅保留三角区1.0 cm×1.0 cm组织)，将组织工程尿流改道装置两端分别与三角区、腹壁造口吻合，完成尿流改道手术，术后1，2，4，8周取材。对照组2只犬采用膨体聚四氟乙烯工程管完成尿流改道手术，术后8周取材。动物实验获武汉大学人民医院实验动物伦理委员会批准，许可证号为WDRM动(福)第20180810号。
结果与结论：①两组植入的组织工程尿流改道装置均与腹壁或肠壁有不同程度的粘连，实验组2只犬存在轻度肾积水，无尿外渗、感染等严重并发症；对照组1只犬形成严重的尿瘘，术后7周死亡，另1只组织工程流出道被结石包裹，长满结石；②苏木精-伊红染色显示，实验组流出道内腔在术后1周后开始出现连续生长的薄层上皮细胞，细胞间连接较松散；术后2周细胞间连接开始变得致密，上皮细胞数量增多；术后4周开始细胞出现堆积、增厚，逐步变为多层结构；术后8周上皮层已经覆盖整个管腔，并可见新生血管生成；③结果表明，脂肪干细胞向尿路上皮细胞定向诱导分化后与膨体聚四氟乙烯共同构建组织工程尿液流出道，在比格犬体内进行尿流改道是可行的，流出道内腔可形成具有紧密连接的尿路上皮层，具备引流尿液、防止尿外渗的功能。

https://orcid.org/0000-0002-1291-3355(刘俊炜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 膨体聚四氟乙烯, 脂肪干细胞, 尿路上皮细胞, 尿流改道, 组织工程

Abstract: BACKGROUND: Tissue engineering technology was used to construct and form tissue engineering, tubes which can significantly reduce the incidence of various perioperative complications with good anti-urine leakage performance in vitro.
OBJECTIVE: To evaluate the feasibility of using adipose stem cells and expanded polytetrafluoroethylene to construct tissue-engineered urine outflow tract in vitro for canine urinary diversion surgery.
METHODS: In the experimental group, adipose stem cells were isolated and cultured from four female beagles, and then differentiated into urothelial cells in vitro for 14 days. The differentiated cells were implanted on the inner surface of expanded polytetrafluoroethylene tubes to form a tissue-engineered urinary diversion device. Bladders were removed from dogs (only 1.0 cm × 1.0 cm of trigonometric area was retained), and both ends of the tissue engineered urinary diversion device were anastomosed with trigonometric area and abdominal wall respectively to complete the urinary diversion operation. The samples were collected at 1, 2, 4 and 8 weeks postoperatively. The control group (two dogs) underwent urinary diversion with expanded polytetrafluoroethylene engineered tube, and samples were collected 8 weeks after operation. The animal experiment was approved by laboratory animal ethics committee of Renmin Hospital of Wuhan University (approval No. WDRM(Fu)20180810).
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There were different degrees of adhesion between the two groups of implanted tissue-engineered urinary diversion devices and the abdominal wall or intestinal wall. Two dogs of the experimental group had mild hydronephrosis, and no serious complications such as urinary exosmosis or infection. One dog in the control group developed severe urinary fistula and died 7 weeks after operation. The tissue-engineered urinary diversion device of the other dog was covered with stones. (2) Hematoxylin-eosin staining showed that thin epithelial cells with loose intercellular connections began to grow continuously in the outflow tract lumen of the experimental group 1 week after operation. At 2 weeks postoperatively, the intercellular connections became dense and the number of epithelial cells increased. Four weeks after operation, the cells began to accumulate and thicken, and gradually changed into a multi-layer structure. The entire lumen was covered by the epidermis, and neovascularization was observed 8 weeks after surgery. (3) The results showed that it was feasible to construct tissue-engineered urine outflow tract together with expanded polytetrafluoroethylene after adipose stem cells were differentiated into urothelial cells for urinary diversion in beagles. The inner cavity of outflow tract could form a tightly connected urothelial cortex with the function of draining urine and preventing urinary extravasation.

Key words: expanded polytetrafluoroethylene, adipose stem cells, urothelial cells, diversion of urine flow, tissue engineering

中图分类号:

刘俊炜, 杨嗣星, 熊云鹤, 宋超, 廖文彪, 孟令超, 李德, 宋钱林, 何子奇, 李彬. 脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯管体外构建组织工程化尿液流出道行犬尿流改道[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3487-3491.

Liu Junwei, Yang Sixing, Xiong Yunhe, Song Chao, Liao Wenbiao, Meng Lingchao, Li De, Song Qianlin, He Ziqi, Li Bin. Construction of tissue-engineered urine outflow tract using adipose stem cells and expanded polytetrafluoroethylene for canine urinary diversion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(22): 3487-3491.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪干细胞的生长特点原代提取细胞初始形态呈圆形，6 h后开始贴壁生长，24 h后贴壁完全，细胞由圆形变为纺锤形或梭形，有突起，胞核居中，培养5-7 d细胞融合达80%，传代后细胞渐呈梭形，呈集落样生长融合，见图1。取第3代分裂旺盛期脂肪干细胞进行流式细胞检测发现，其高表达CD29(99.7%)、CD44(99.2%)，低表达CD31(1.41%)、CD45(1.04%)，见图2，与间充质干细胞的表型特征相符合，证明通过上述方法可成功提取脂肪干细胞。

2.2 诱导分化后脂肪干细胞的生长特点诱导分化后的脂肪干细胞生长速度明显变慢，贴壁细胞形态逐渐由长梭形变为多角形，2周后细胞生长速度开始加快。Western Blot检测发现，诱导后的脂肪干细胞尿路上皮特异蛋白1α表达上调，而未诱导脂肪干细胞的尿路上皮特异蛋白1α呈低表达状态，见图3。Western Blot定量检测显示，诱导后脂肪干细胞的尿路上皮特异蛋白1α的蛋白表达高于未诱导的脂肪干细胞(P < 0.05)。

2.3 犬尿流改道实验结果
大体观察：5只实验犬存活，取材时发现植入的组织工程尿液流出道均与腹壁或肠壁有不同程度的粘连，实验组2只存在轻度肾积水，无尿外渗、感染等严重并发症；对照组1只犬形成严重的尿瘘，术后7周因尿漏导致的腹膜炎死亡，另1只组织工程流出道被肾脏包裹，外有大量结石形成，管腔内面粗糙，遍布砂砾样结晶，无明显上皮层覆盖，见图4。所以，对照组无法进行组织学观察。

组织学观察：苏木精-伊红染色显示，实验组流出道内腔在术1周后开始出现连续生长的薄层上皮细胞，细胞间连接较松散；术后2周细胞间连接开始变得致密，上皮细胞数量增多；术后4周细胞开始出现堆积、增厚，逐步变为多层结构；术后8周组织上皮层细胞较4周有所增多，上皮层已经覆盖整个管腔，并可见新生血管生成，见图5。综上可知，术后4周上皮组织的生长增殖状态趋于稳定。

2.4 组织工程尿液流出道的生物相容性由犬尿流改道实验可知，实验构建的组织工程尿液流出道具有良好的生物相容性。

参考文献

[1] CHUA ME, FARHAT WA, MING JM, et al. Review of clinical experience on biomaterials and tissue engineering of urinary bladder. World J Urol. 2020;38(9): 2081-2093.
[2] ATALA A, DANILEVSKIY M, LYUNDUP A, et al. The potential role of tissue-engineered urethral substitution: clinical and preclinical studies. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(1):3-19.
[3] MACRI A. Modified double-barrelled wet colostomy after total pelvic exenteration. Updates Surg. 2017;69(4):545-548.
[4] ZHOU Z, YAN H, LIU Y, et al. Adipose-derived stem-cell-implanted poly(-caprolactone)/chitosan scaffold improves bladder regeneration in a rat model. Regen Med. 2018;13(3):331-342.
[5] SHIN JH, RYU CM, YU HY, et al. Current and Future Directions of Stem Cell Therapy for Bladder Dysfunction. Stem Cell Rev Rep. 2020;16(1):82-93.
[6] ADAMOWICZ J, POKRYWCZYNSKA M, VAN BREDA SV, et al. Concise Review: Tissue Engineering of Urinary Bladder; We Still Have a Long Way to Go? Stem Cells Transl Med. 2017;6(11):2033-2043.
[7] ABBAS TO, ALI TA, UDDIN S. Urine as a Main Effector in Urological Tissue Engineering-A Double-Edged Sword. Cells. 2020;9(3):538.
[8] WANG Q, XIAO DD, YAN H, et al. The morphological regeneration and functional restoration of bladder defects by a novel scaffold and adipose-derived stem cells in a rat augmentation model. Stem Cell Res Ther. 2017;8(1):149.
[9] SMOLAR J, HORST M, SULSER T, et al. Bladder regeneration through stem cell therapy. Expert Opin Biol Ther. 2018;18(5):525-544.
[10] MENG L, LIAO W, YANG S, et al. Tissue-engineered tubular substitutions for urinary diversion in a rabbit model. Exp Biol Med (Maywood). 2016;241(2):147-156.
[11] SI Z, WANG X, SUN C, et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomed Pharmacother. 2019;114:108765.
[12] CHEN Y, TILLMAN B, GO C, et al. A novel customizable stent graft that contains a stretchable ePTFE with a laser-welded nitinol stent. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2019;107(4):911-923.
[13] ZHUO Z, DAN H, GENSONG L, et al. Design of a Mechatronics Model of Urinary Bladder and Realization and Evaluation of Its Prototype. Appl Bionics Biomech. 2019;2019:9431781.
[14] HORST M, EBERLI D, GOBET R, et al. Tissue Engineering in Pediatric Bladder Reconstruction-The Road to Success. Front Pediatr. 2019;7:91.
[15] 熊云鹤,杨嗣星,孟令超,等.兔骨髓间充质干细胞向尿路上皮分化后构建膀胱组织工程化移植物[J]. 中国组织工程研究,2014,18(32):5097-5102.
[16] 李欣慧,廖文彪,李永伟,等.骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性[J].中国组织工程研究,2012,16(51):9567-9573.
[17] WANG JM, GU Y, PAN CJ, et al. Isolation, culture and identification of human adipose-derived stem cells. Exp Ther Med. 2017;13(3):1039-1043.
[18] FANG B, LIU Y, ZHENG D, et al. The effects of mechanical stretch on the biological characteristics of human adipose-derived stem cells. J Cell Mol Med. 2019;23(6):4244-4255.
[19] SHEYKHHASAN M, WONG J, SEIFALIAN AM. Human Adipose-Derived Stem Cells with great Therapeutic Potential. Curr Stem Cell Res Ther. 2019;14(7):532-548.
[20] ZHAO Z, YU H, FAN C, et al. Differentiate into urothelium and smooth muscle cells from adipose tissue-derived stem cells for ureter reconstruction in a rabbit model. Am J Transl Res. 2016;8(9):3757-3768.
[21] WANG Y, ZHOU S, YANG R, et al. Bioengineered bladder patches constructed from multilayered adipose-derived stem cell sheets for bladder regeneration. Acta Biomater. 2019;85:131-141.
[22] WANG Q, XIAO DD, YAN H, et al. The morphological regeneration and functional restoration of bladder defects by a novel scaffold and adipose-derived stem cells in a rat augmentation model. Stem Cell Res Ther. 2017;8(1):149.
[23] CHAN YY, SANDLIN SK, KURZROCK EA, et al. The Current Use of Stem Cells in Bladder Tissue Regeneration and Bioengineering. Biomedicines. 2017;5(1):4.
[24] LI H, XU Y, FU Q, et al. Effects of multiple agents on epithelial differentiation of rabbit adipose-derived stem cells in 3D culture Tissue Eng Part A. 2012;18(17-18):1760-1770.
[25] SHI JG, FU WJ, WANG XX, et al. Transdifferentiation of human adipose-derived stem cells into urothelial cells: potential for urinary tract tissue engineering. Cell Tissue Res. 2012;47(3):737-746.
[26] GASANZ C, RAVENTOS C, MOROTE J. Current status of tissue engineering applied to bladder reconstruction in humans. Actas Urol Esp. 2018;42(7):435-441.
[27] PEREZ JR, KOUROUPIS D, LI DJ, et al. Tissue Engineering and Cell-Based Therapies for Fractures and Bone Defects. Front Bioeng Biotechnol. 2018;6:105.
[28] PETERS JJ, SHINGLETON WB, MORGAN D, et al. Neointimized Gore-Tex graft for ureteral prosthesis in the dog. Urology. 1996;48(3):379-382.
[29] SABANEGH EJ, DOWNEY JR, SAGO AL. Long-segment ureteral replacement with expanded polytetrafluoroethylene grafts. Urology. 1996;48(2):312-316.
[30] DAS S, GORDIAN-VELEZ WJ, LEDEBUR HC, et al. Innervation: the missing link for biofabricated tissues and organs. NPJ Regen Med. 2020;5:11.

引言

临床上膀胱切除后原有尿流通道被破坏，需要进行尿流改道手术将尿液引流到体外。迄今为止最经典的尿流改道手术方式仍然是传统的回肠膀胱术(Bricker手术)，尽管该术式存在肠梗阻、肠瘘、感染、吻合口狭窄、肾积水和结石等并发症，且据统计该术式中远期并发症的发生率高达90%[1-3]，但由于没有更优替代方案目前仍在大量开展。如果利用组织工程技术在体外构建形成具有良好抗尿液渗漏性能的组织工程管，代替Bricker术中截取的健康回肠，将极大减少患者所受打击，加速手术进程，且能够显著降低各类围术期并发症的发生率。
近年来，干细胞在膀胱组织工程中的研究较为广泛，为临床患者尤其是膀胱外翻、膀胱发育不全及膀胱恶性肿瘤患者带来了新的希望[4-5]。组织工程中用于构建组织的功能性细胞常被称为种子细胞，尿路上皮细胞是组织工程流出道构建中最常用的种子细胞[6]。尿路上皮细胞之间形成紧密连接，与其分泌的Uroplakin蛋白共同构成防止尿液外渗的结构，保护下层组织不受尿液的侵蚀。但是尿路上皮细胞作为一种分化成熟的细胞在体外培养环境下难以大量扩增，且临床上多因膀胱肿瘤行膀胱切除手术，这类患者尿路上皮取材时存在潜在的肿瘤扩散风险，因此，近些年干细胞成为了泌尿系组织工程种子细胞的新选择[7]。脂肪干细胞容易取材，具有高度增殖和自我更新能力且具有多向分化潜能，能够分泌所需生长活化因子，是理想的种子细胞来源[8-9]。目前已有多项研究证明，脂肪干细胞在体外环境下可以向尿路上皮细胞诱导分化[10-11]。膨体聚四氟乙烯工程管是临床上使用最广泛的人工血管之一，可通过购买获得，有类似回肠的强度和缝合能力，抗渗漏能力强，又有较多的孔隙，有利于组织细胞的长入，且有大量组织工程实验将膨体聚四氟乙烯应用于人工尿液流出道的构建，结果证实其组织相容性极佳，且具有抗尿液渗漏作用[12-13]。实验拟通过条件培养基诱导脂肪干细胞向尿路上皮细胞分化，将分化后的细胞种植到膨体聚四氟乙烯工程管上构建组织工程尿流改道装置，移植到比格犬体内验证其进行尿流改道的可行性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计构建组织工程尿液流出道的动物实验，两组间比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2018年1月至2020年8月在武汉大学人民医院中心实验室及武汉大学动物实验中心完成。
1.3 材料膨体聚四氟乙烯支架的介绍，见表1。

1.3.1 实验动物体质量7-10 kg雌性比格犬8只，实验组4只(分别于术后1，2，4，8周处死取材)；对照组2只(术后8周处死取材)，剩余的2只用于提取尿路上皮细胞，由武汉大学人民医院动物实验中心提供并饲养。动物实验获武汉大学人民医院实验动物伦理委员会批准，许可证号为WDRM动(福)第20180810号。
1.3.2 主要试剂胰蛋白酶、双抗、胎牛血清、I型胶原酶、KSFM培养基、DMEM培养基(美国Gibco公司)；FITC标记山羊抗小鼠二抗(美国eBioscience公司)；FITC标记CD29、CD31、CD45、CD44，尿路上皮特异蛋白1α(英国Abcam公司)；10%中性甲醛(武汉谷歌生物有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 脂肪干细胞的体外培养与扩增取实验组比格犬，称质量后用3%戊巴比妥钠麻醉，取腹股沟处脂肪组织剪碎至糊状，加入0.1%I型胶原酶溶液，消化至无肉眼可见组织块后过滤收集消化液，1 500 r/min离心5 min，漂洗2次，加含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的 H-DMEM培养液重悬，置于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下培养。
1.4.2 脂肪干细胞的流式细胞仪检测取细胞融合密度至90%以上的第3代细胞，调整细胞密度约1.0×106/管，加入不同荧光标记的抗体混匀，孵育30 min后，用流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD31、CD44、CD45的表达。
1.4.3 尿路上皮细胞的制备手术切取比格犬膀胱前壁2 cm×2 cm大小的组织，生理盐水冲洗干净后，用眼科镊完整剥离膀胱黏膜层，放入预先装有双抗培养皿中剪碎，使用0.25%胰酶37 ℃恒温摇床消化，至组织块分散为单个细胞，用含有体积分数5%胎牛血清的培养基终止消化。100目的筛网过滤，1 000 r/min离心5 min，去上清；PBS洗涤后再次离心去上清，将细胞添加于有表皮生长因子和牛垂体提取物的KSFM培养基中，接种于培养瓶中；将培养瓶置于体积分数5%CO2、37 ℃饱和湿度孵育箱中培养。36 h后换液，待细胞贴壁生长后每周换液两三次；倒置显微镜下观察上皮细胞融合至70%-80%时以1∶2进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞形态。利用Western Blot检测尿路上皮细胞标志蛋白尿路上皮特异蛋白1α的表达。
1.4.4 诱导脂肪干细胞向尿路上皮细胞分化
条件培养基的制备：取培养过尿路上皮细胞的KSFM培养基，2 000 r/min离心取上清液，与新鲜DMEM培养基按照体积比1∶4的比例混合，制成定向诱导条件培养基。
脂肪干细胞的定向诱导：选择第3代分裂旺盛的脂肪干细胞，用胰蛋白酶消化离心后制成单细胞悬液，使用条件培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态，分别在不同生长阶段进行拍照。诱导前及诱导后7，14 d，利用Western Blot检测脂肪干细胞尿路上皮细胞标志蛋白尿路上皮特异蛋白1α的表达：提取细胞总蛋白，采用Bradford方法测定蛋白浓度；所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×Loading Buffer上样，Marker也用1×Loading Buffer调整至与样品等体积，电泳电压浓缩胶75 V 30 min，分离胶120 V约100 min，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜；将转好的PVDF膜在室温下用5% 的脱脂牛奶(用0.5%TBST配制)封闭1 h，用TBST在摇床上洗3次，每次5 min，漂洗脱色后加入稀释一抗尿路上皮特异蛋白1α或内参β-actin，4 ℃摇床孵育过夜。次日用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min，然后加入稀释后的二抗后室温下孵育60 min，TBST摇床漂洗20 min后，使用ECL化学发光显色法上机检测。
1.4.5 组织工程尿液流出道的构建收集诱导分化2周后的脂肪干细胞，调整细胞浓度为(3-5)×1010 L-1，将2.0-3.0 mL细胞悬液铺满实验组膨体聚四氟乙烯支架内表面，置入37 ℃培养箱培养4 h；用条件培养基浸没支架继续培养，48 h换液后再培养12 h，即可使用于犬尿流改道手术。对照组膨体聚四氟乙烯支架消毒灭菌后直接用条件培养基浸泡3 d后使用。
1.4.6 犬尿流改道实验实验两组犬麻醉消毒后，进入腹腔横断尿道，缝扎尿道残端，切除膀胱仅保留三角区约1.0 cm×1.0 cm组织与组织工程尿液流出道吻合，流出道远端与腹壁造口吻合，用大网膜包埋后关腹。实验组4只犬分别于尿流改道术后1，2，4，8周取出尿流改道支架管，观察吻合口情况及改道后尿路形态结构的变化。复合物取材后行石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色检测，观察光镜下组织材料上皮层的改变。对照组以同样方法植入未种植细胞的组织工程管进行尿流改道，于术后8周处死，其余处理方法相同。
1.5 主要观察指标术后不同时间点的组织学观察结果。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件处理，计量资料采用x±s表达，两组间比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验。以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

传统全膀胱切除术会使原有尿流通道遭到破坏，术后需使用自身回肠代替膀胱行使尿液引流作用，造成生理结构改变，容易引发各类术后并发症，严重影响患者后续生活质量。因此，寻求人工构建的材料进行改良式尿流改道一直是泌尿外科组织工程研究的重要方向[14]。课题组前期成功利用膀胱上皮细胞和膀胱脱细胞基质构建 4 cm 长组织工程管状移植物进行尿流改道[15-16]，证实了运用组织工程移植物进行尿流改道技术的可行性。然而在实际应用中，由于尿路上皮细胞已是分化成熟的细胞，在此基础上进行分裂扩增的能力十分有限。此外，对于膀胱肿瘤患者，取自身尿路上皮细胞作为种子细胞构建组织工程管有癌症扩散风险，因此需使用更安全且增殖能力较强的种子细胞构建尿流改道装置。有研究表明，脂肪干细胞在一定条件诱导下能分化成尿路上皮细胞[17]，而脂肪组织获取较易、增殖快，使脂肪干细胞的分离培养更为简便、安全，取材过程对机体创伤小且细胞的获取量可观[17]。
脂肪干细胞是一种成体干细胞，具有向多种细胞类型分化的能力[18]，由于其提取方便、来源充足、分离简单且不受伦理争议，具有广泛的适用范围[19]。脂肪干细胞可以分泌多种生长因子，包括血管内皮生长因子和转化生长因子等，有利于组织的再生和血管的重建；此外，脂肪干细胞还存在促进创伤愈合的潜能[20]。WANG等[21]将脂肪干细胞直接种植在多孔支架上构成生物工程三维膀胱补片，评估其在大鼠中导致膀胱再生的可行性，组织切片及免疫荧光结果证明，这些组织工程膀胱补片促进了尿路上皮、平滑肌、神经细胞和血管的再生。在特定的培养条件下，脂肪干细胞可分化为多种细胞系[22-23]。LI等[24]利用3D培养系统，通过添加表皮生长因子、角质细胞生长因子等诱导脂肪干细胞向上皮细胞方向分化，发现诱导的细胞表现为分层上皮状，并且可以检测到上皮细胞特异性标志物的表达，证实了在特定微环境中脂肪干细胞可被诱导向上皮细胞方向分化。SHI等[25]用培养过人尿路上皮细胞的条件培养基培养人脂肪干细胞，发现2周后接近 50%的脂肪干细胞表现出上皮细胞的形态，同时尿路上皮细胞标志物(尿路上皮分化特异糖蛋白2和角蛋白18)表达上调，间叶细胞标志物(波形蛋白)表达下调。作者根据SHI等的方法，用培养过比格犬尿路上皮细胞的条件培养基培养犬脂肪干细胞，发现脂肪干细胞逐渐表现出上皮细胞的形态，Western Blot蛋白印迹检测发现，经诱导培养后脂肪干细胞高效价表达尿路上皮特异蛋白1α，证实脂肪干细胞可向尿路上皮细胞分化，为其应用于膀胱组织工程等方面提供了理论基础。
另外，目前广泛使用经脱细胞处理的患者膀胱基质作为组织工程管植入体内，可有效避免患者免疫排斥反应，但在实际应用中膀胱脱细胞基质无法批量生产，无法广泛应用于临床[26]。膨体聚四氟乙烯支架为临床上常用的人工血管材料，在决定组织再生成功的材料特性包括生物相容性、生物降解性和支架结构方面表现良好[27]。早在1996年美国就有报道使用人工血管替代狗输尿管的实验获得成功，术后随访 1 年人工尿道仍保持通畅且未观察到肾积水等并发症[28-29]。此次实验将诱导分化为尿路上皮样表现的比格犬脂肪干细胞种植在膨体聚四氟乙烯支架管上，在对犬进行改良式尿流改道手术后并无肾积水、尿外渗等严重并发症的发生，初步证实了组织工程尿液流出道方案的可行性；同时组织学观察发现，比格犬尿流改道术后1周流出道内腔开始出现连续生长的薄层上皮细胞，术后4周即可形成光滑的黏膜表面，可有效阻隔尿液中有害物质的渗漏，避免人工材料与尿液直接接触产生的侵蚀作用。
目前构建功能性膀胱的组织工程重建面临较多问题，尤其是无法复原膀胱组织的神经支配，无法构建具备完全贮尿及排尿功能的组织工程膀胱[30]。尽管此次实验为一个短期的可行性验证实验，存在实验数量少、远期效果未知等缺陷，但是利用现有组织工程技术对现有术式进行改良的初步成功，展现了组织工程技术潜在的应用可能性，值得进一步深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脂肪干细胞与膨体聚四氟乙烯管体外构建组织工程化尿液流出道行犬尿流改道

Construction of tissue-engineered urine outflow tract using adipose stem cells and expanded polytetrafluoroethylene for canine urinary diversion

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[1]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[2]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[3]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[4]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[5]	何冠宇, 徐宝山, 杜立龙, 张同星, 霍振鑫, 申力. 天然丝素蛋白构建仿生取向微通道纤维环支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 560-566.
[6]	陈晓旭, 罗雅馨, 毕浩然, 杨琨. 脱细胞支架制备及其在组织工程和再生医学中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 591-596.
[7]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[8]	沈佳华, 付勇. 基于石墨烯的纳米材料可否在干细胞领域应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 604-609.
[9]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[10]	李辉, 陈良龙. 植骨材料在脊柱结核治疗中的应用与特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 626-630.
[11]	高仓健, 杨振, 刘舒云, 李浩, 付力伟, 赵天元, 陈威, 廖志垚, 李品学, 眭翔, 郭全义. 静电纺丝技术在肩袖损伤修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 637-642.
[12]	关健, 贾燕飞, 张葆鑫, 赵国中. 4D生物打印在组织工程的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 446-455.
[13]	刘亮, 胡高铨, 韦昭, 陈琳, 洪枫. 细菌纳米纤维素/聚多巴胺复合管作为小口径人工血管的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3535-3542.
[14]	夏克尔扎提·肖哈拉提, 王晓蓓, 王琳. 纳米粒子：缺血性脑卒中治疗新策略[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3566-3572.
[15]	吴姝涵, 祝旭龙, 白璐, 张菲菲, 蔺光帅, 李江, 杜嘉, 李建辉. 水凝胶组织工程脂肪的血管化策略[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3573-3579.