淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化

doi:10.12307/2025.013

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (7): 1371-1379.doi: 10.12307/2025.013

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化

刘琪1，2，李林臻1，2，李玉生1，2，焦泓焯1，2，杨程1，2，张君涛1，2

1天津中医药大学第一附属医院，天津市 300381；2国家中医针灸临床医学研究中心，天津市 300381

收稿日期:2023-10-24 接受日期:2024-01-15 出版日期:2025-03-08 发布日期:2024-06-27
通讯作者: 张君涛，博士，主任中医师，硕士生导师，天津中医药大学第一附属医院，天津市 300381；国家中医针灸临床医学研究中心，天津市 300381
作者简介:刘琪，男，1997年生，安徽省亳州市人，在读硕士，主要从事中医药治疗骨关节炎及软骨修复再生相关基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82074470，51573137)，项目负责人：张君涛

Icariin-containing serum promotes chondrocyte proliferation and chondrogenic differentiation of stem cells in the co-culture system of three kinds of cells

Liu Qi1, 2, Li Linzhen1, 2, Li Yusheng1, 2, Jiao Hongzhuo1, 2, Yang Cheng1, 2, Zhang Juntao1, 2

1First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China; 2National Clinical Research Center for Traditional Chinese Medicine and Acupuncture, Tianjin 300381, China

Received:2023-10-24 Accepted:2024-01-15 Online:2025-03-08 Published:2024-06-27
Contact: Zhang Juntao, MD, Chief physician, Master’s supervisor, First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China; National Clinical Research Center for Traditional Chinese Medicine and Acupuncture, Tianjin 300381, China
About author:Liu Qi, Master candidate, First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China; National Clinical Research Center for Traditional Chinese Medicine and Acupuncture, Tianjin 300381, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82074470, 51573137 (to ZJT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

软骨细胞-骨髓间充质干细胞-滑膜间充质干细胞共培养体系：是指由软骨细胞、骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞3种细胞非接触共培养建立起来的多细胞共培养体系，该体系上室分别培养骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞，下室培养软骨细胞，上室底部为半透膜封闭(孔径0.4 μm)，只允许生物活性因子通过而细胞彼此不接触，方便观察细胞间的相互影响和诱导作用。
淫羊藿苷含药血清：是指动物连续灌胃淫羊藿苷溶液后，采集血液并分离得到血清，即为淫羊藿苷含药血清。

背景：关节软骨损伤修复能力十分有限，组织工程技术为修复受损软骨提供了新的治疗方案，其中软骨细胞、骨髓间充质干细胞和滑膜间充质干细胞之间的相互影响和诱导作用是自体软骨损伤愈合的基础。
目的：构建软骨细胞-骨髓间充质干细胞-滑膜间充质干细胞共培养体系用以模拟软骨细胞体内微环境，并探究其最佳细胞接种比例，同时观察淫羊藿苷含药血清对该体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化的影响。
方法：提取、培养、鉴定大鼠膝关节软骨细胞、骨髓间充质干细胞和滑膜间充质干细胞，按不同细胞接种比例构建软骨细胞-骨髓间充质干细胞-滑膜间充质干细胞非接触共培养体系，共培养72 h后观察软骨细胞增殖活性和表型能力，选择综合效应最佳的共培养体系；用淫羊藿苷溶液(0.25 mg/mL)灌胃新西兰大白兔制备淫羊藿苷含药血清，对照组共培养体系用含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的高糖DMEM培养液培养，实验组共培养体系在此基础之上加入体积分数为10%淫羊藿苷含药血清进行干预，24，48 h后检测两组软骨细胞增殖活性和Ⅱ型胶原表达，14 d后采用免疫荧光染色检测骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞成软骨分化情况。
结果与结论：①3种细胞以不同比例共培养时均可正常贴壁生长，当软骨细胞、骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞接种比例为2∶1∶1时，共培养体系中软骨细胞表现出最佳增殖活性和表型能力；②与对照组相比，实验组培养24 h后软骨细胞增殖活性和Ⅱ型胶原表达显著升高(P < 0.01)，48 h后两组仍有差异(P < 0.05)，培养14 d后两组骨髓间充质干细胞和滑膜间充质干细胞出现明显的软骨分化，部分细胞呈现圆形或椭圆形，胞浆Ⅱ型胶原免疫荧光染色为阳性，实验组荧光强度明显高于对照组(P < 0.01)；③结果表明，以非接触共培养方法可以成功建立软骨细胞-骨髓间充质干细胞-滑膜间充质干细胞共培养体系且细胞比例为2∶1∶1时软骨细胞增殖活性和表型能力最佳；同时淫羊藿苷含药血清具有促进该体系中软骨细胞增殖及骨髓间充质干细胞、滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用。

https://orcid.org/0009-0003-2030-5522 (刘琪)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 淫羊藿苷含药血清, 软骨细胞, 骨髓间充质干细胞, 滑膜间充质干细胞, 共培养, 细胞增殖, Ⅱ型胶原, 成软骨分化

Abstract: BACKGROUND: The capability of repairing articular cartilage damage is very limited, and tissue engineering technology provides new therapeutic options for repairing damaged cartilage, in which the interaction and induction between chondrocytes, bone marrow mesenchymal stem cells, and synovial mesenchymal stem cells is the basis of autologous healing of cartilage damage.
OBJECTIVE: To construct the chondrocyte-bone marrow mesenchymal stem cell-synovial mesenchymal stem cell co-culture system to simulate the in vitro microenvironment of chondrocytes, and to explore the optimal cell inoculation ratio, meanwhile to observe the effects of icariin-containing serum on the proliferation of chondrocytes and the chondrogenic differentiation of stem cells in the system.
METHODS: Rat knee chondrocytes, bone marrow mesenchymal stem cells and synovial mesenchymal stem cells were extracted, cultured and identified, and a chondrocyte-bone marrow mesenchymal stem cell-synovial mesenchymal stem cell non-contact co-culture system was constructed according to different cell inoculation ratios. After 72 hours of co-culturing, the chondrocyte proliferative activity and phenotypic ability were observed, and the co-culture system with the best overall effect was selected. New Zealand white rabbits were gavaged with icariin solution (0.25 mg/mL) to prepare icariin-containing serum, and cultured in conventional complete medium (high sugar DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum and 1% double antibody by volume) as the control group, while the experimental group was intervened by adding 10% icariin-containing serum by volume on the basis of above. The proliferative activity of chondrocytes and the expression of collagen type II were tested for the two groups after 24 and 48 hours. The differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and synovial mesenchymal stem cells into chondrocytes in the co-culture system was tested by immunofluorescence staining after 14 days.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The three kinds of cells grew normally adherently to the wall in different ratios of co-culture, where chondrocytes showed the best proliferative activity and phenotypic ability in the co-culture system when chondrocytes: bone marrow mesenchymal stem cells: synovial mesenchymal stem cells = 2:1:1. (2) Compared with the control group, the proliferative activity and type II collagen expression of chondrocytes in the experimental group were significantly increased after 24 hours (P < 0.01), and the two groups still had difference after 48 hours (P < 0.05). The two groups showed obvious chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and synovial mesenchymal stem cells after 14 days (P < 0.01), and some of the cells appeared round or oval, and the cytoplasmic type II collagen immunofluorescence staining was positive. The fluorescence intensity of the experimental group was significantly higher than that of the control group (P < 0.01). (3) The results showed that the chondrocyte-bone marrow mesenchymal stem cell-synovial mesenchymal stem cell co-culture system could be successfully established by the non-contact co-culture method, and the best chondrocyte proliferative activity and phenotypic ability could be obtained when the cell ratio was 2:1:1. Icariin-containing serum had the promoting effect on chondrocyte proliferation, and chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and synovial mesenchymal stem cells in the system.

Key words: icariin-containing serum, chondrocyte, bone marrow mesenchymal stem cell, synovial mesenchymal stem cell, co-culture, cell proliferation, type II collagen, chondrogenic differentiation

中图分类号:

刘琪, 李林臻, 李玉生, 焦泓焯, 杨程, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1371-1379.

Liu Qi, Li Linzhen, Li Yusheng, Jiao Hongzhuo, Yang Cheng, Zhang Juntao. Icariin-containing serum promotes chondrocyte proliferation and chondrogenic differentiation of stem cells in the co-culture system of three kinds of cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(7): 1371-1379.

图/表（结果） 2

2.1 大鼠软骨细胞鉴定结果经传代培养至第3代，倒置显微镜下可见软骨细胞呈现多角形、三角形或不规则梭形，细胞核大而圆，位于胞体中心，细胞质分布均匀，细胞密集生长后呈现“铺路石”样改变。经甲苯胺蓝染色后，培养的细胞核呈现蓝紫色，核仁明显，细胞质着色稍浅呈浅紫色，其内可见紫红色异染颗粒，细胞周围有少许蓝紫色异染颗粒出现。根据形态学观察和甲苯胺蓝染色阳性，结合取材部位，结果表明所提取的细胞为关节软骨细胞，见图2。
2.2 BMSC表面抗原鉴定结果分离培养约48 h可出现贴壁生长，细胞呈圆形、三角形或梭形，生长缓慢，换液后细胞增殖速度加快，呈克隆性生长，出现以梭形细胞为主且大小不一的细胞集落。2周左右细胞融合度为80%-90%时达到传代要求，传代后细胞形态单一，似成纤维细胞样长梭形，第3代BMSC纯度可达90%以上，细胞增殖融合时呈漩涡状和放射状排列，表现出较强的细胞极性特征，见图3A。流式细胞表型鉴定显示，表达CD45为阴性，表达CD90为阳性，见图3B，基本符合BMSC的特征，证实了从大鼠骨髓中提取的细胞为BMSC。
2.3 SMSC表面抗原鉴定结果 SMSC在细胞形态和免疫表型方面与BMSC相似，但具有比BMSC更强的集落形成能力和成软骨分化能力。分离培养约24 h即可出现贴壁生长，细胞呈不规则梭形，换液后细胞生长速度加快，7-10 d细胞可达80%-90%融合，传代后3-5 d可铺满瓶底，传至第3代时，细胞生长速度和分化能力都处于最佳状态，此时细胞呈现长梭形的成纤维状，为间充质干细胞的标准状态，见图4A。流式细胞表型鉴定显示，表达CD45和CD11b为阴性，CD45阴性率为92.6%，CD11b阴性率为78.9%，表达CD90为阳性，阳性率为78.2%，见图4B，符合国际细胞治疗协会鉴定SMSC的标准。
2.4 不同细胞比例的共培养体系中软骨细胞增殖和表型能力培养72 h后，软骨细胞、BMSC和SMSC的接种比例为2∶1∶1时软骨细胞增殖活性最强，见图5A；软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色结果，见图5B；免疫荧光强度分析显示软骨细胞、BMSC和SMSC接种比例为2∶1∶1时软骨细胞表型能力最佳，Ⅱ型胶原表达量最高，平均荧光强度为70%，见图5C，因此后续实验研究将采用这一细胞比例。
2.5 淫羊藿苷含药血清对共培养体系中软骨细胞增殖的影响从图6可以看出，淫羊藿苷含药血清干预共培养体系24，48 h后，实验组吸光度值均明显增高，表明软骨细胞增殖数量明显增加，淫羊藿苷含药血清干预24 h后两组之间差异有显著性意义(P < 0.01)，48 h后两组相比差异仍有显著性意义(P < 0.05)，说明淫羊藿苷含药血清能够促进软骨细胞的增殖，且以作用24 h效果最佳，推测淫羊藿苷含药血清在短时间内起效明显。
2.6 淫羊藿苷含药血清对共培养体系中软骨细胞表型能力的影响 Ⅱ型胶原是软骨标志性蛋白，其合成和分泌是维持软骨细胞功能的特征性指标。软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达量越高，表明软骨细胞分化表型活性越强[24]。两组软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色结果，见图7A，同一时间下两组荧光强度分析，见图7B，与对照组相比，淫羊藿苷含药血清干预24 h后实验组荧光强度明显增高(P < 0.01)，48 h时两组荧光强度仍有显著差异(P < 0.05)，表明淫羊藿苷含药血清能够提高共培养体系中软骨细胞Ⅱ型胶原的分泌量，促进其表型表达，且这种促进作用在干预24 h时最明显。
2.7 淫羊藿苷含药血清对共培养体系中BMSC和SMSC成软骨分化的影响成软骨分化的BMSC和SMSC可以被Ⅱ型胶原免疫荧光染色，荧光越强，表明BMSC和SMSC转化为软骨细胞的数量越多[25]。图8A，B分别为BMSC和SMSC的Ⅱ型胶原免疫荧光染色图，均可见部分细胞免疫荧光染色呈阳性，对照组整体荧光强度均较弱，而实验组荧光强度均较强，图8C为BMSC和SMSC的荧光强度分析，实验组荧光强度明显高于对照组(P < 0.01)，表明淫羊藿苷含药血清能够促进共培养体系中BMSC和SMSC的成软骨分化。

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引言

膝关节软骨损伤是临床骨科常见的疾病，其特征为关节软骨面变薄，出现纤维化或浅表裂隙样溃疡，严重时可出现软骨部分剥脱甚至全层缺失，最终发展为骨性关节炎[1]。由于关节软骨缺乏神经、血管和淋巴，其营养主要借助渗透方式从关节液中获得[2]，导致软骨损伤后很难得到有效的结构和功能恢复。软骨细胞是软骨内唯一的活性细胞，虽占比重不到关节软骨的5%，但能分泌大量的软骨基质，对维持软骨新陈代谢和促进软骨损伤修复起到重要作用[3]。体内软骨细胞受周围环境中间充质干细胞的调控而维持表型稳定[4]，有学者发现，当软骨细胞与间充质干细胞共培养时，不仅细胞表型稳定，且Ⅱ型胶原、糖胺聚糖和SOX9的表达水平也上调[5]。膝关节周围间充质干细胞主要为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)和滑膜间充质干细胞(synovial mesenchymal stem cells，SMSC)，当外源性添加细胞因子时，能够定向诱导BMSC和SMSC软骨向分化[6-7]，但后来研究发现，软骨细胞分泌的生物活性因子也能够很好地诱导BMSC和SMSC成软骨分化[8-9]，这种诱导分化作用可以为关节补充新生的软骨细胞，有利于自体愈合关节软骨损伤。基于此，该研究按不同细胞接种比例构建软骨细胞-BMSC-SMSC非接触共培养体系，以模拟软骨细胞体内微环境，最大程度维持软骨细胞表型，共培养72 h后选取软骨细胞增殖活性和表型作用最佳的共培养细胞比例用于后续干预研究。
近年来，组织工程技术的发展为软骨损伤修复提供了新的方向，软骨组织工程主要从种子细胞、生物支架材料和细胞生长因子3个方面着手，最终归宿点在种子细胞生成软骨组织，以此来修复受损软骨[10-11]。对种子细胞研究而言不仅需要获得稳定的软骨细胞表型，防止细胞去分化，同时还要提高软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达[12]。
中药在组织工程修复软骨损伤方面展现出独特优势，通过提高软骨细胞增殖活性和生长因子表达，促进间充质干细胞成软骨分化而达到修复软骨缺损的作用[13-15]。淫羊藿苷是中药淫羊藿的主要活性单体，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等活性，对神经、免疫、心血管、骨骼系统疾病均有一定作用[16]。由于淫羊藿苷亲脂性和水溶性差的特点，导致体外细胞实验时往往出现偏差。课题组前期研究发现，经生物转化后的淫羊藿苷含药血清比淫羊藿苷原液具有更强的生物活性，能够提高软骨细胞增殖率和促进糖胺聚糖分泌，其中2倍等效体表面积灌胃所得淫羊藿苷含药血清对软骨细胞增殖和表型作用最强[17]。因此该研究采用低浓度灌胃淫羊藿苷制备含药血清，通过观察淫羊藿苷含药血清对软骨细胞-BMSC-SMSC共培养体系中软骨细胞增殖和BMSC、SMSC成软骨分化的影响，为后续探究淫羊藿苷含药血清更好地促进关节软骨损伤修复提供细胞实验基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性体外细胞学实验，对所得数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的数据多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，两组间方差不齐者用Dunnet T3检验。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年6月在天津中医药大学第一附属医院实验中心和天津易生源生物科技有限公司完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级4周龄健康雄性SD大鼠4只，体质量90-140 g，用于提取细胞，购自北京华阜康生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2019-0008。健康雄性新西兰大白兔4只，8月龄，体质量2.0-2.2 kg，用于制备含药血清，购自北京金牧阳实验动物养殖有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2020-0003。所有动物饲养于天津易生源生物科技有限公司，实验方案经天津易生源生物公司动物伦理委员会批准，批准号为YSY-DWLL-2022177。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验试剂淫羊藿苷(纯度> 98%)、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、甲苯胺蓝染色液(北京索莱宝，批号：I8760，C8140，C8150，G3660)；DMEM高糖培养基(美国Gibco公司，批号：8122572)；特级胎牛血清(广东赛业，批号：FBSAD-01011-500)；CCK-8检测试剂盒(北京中生奥邦，批号：03.S17002DA)；兔抗COL2A1多克隆抗体(武汉贝茵莱，批号：PAB46503)；山羊抗兔IgG抗体(成都正能，批号：550043)；DAPI染料(美国APEXBIO公司，批号：C3362)；流式抗体CD45-APC、CD90-PE、CD11b-PerCP、Cell Staining Buffer(美国BioLegend公司，批号：202313，202523，201819，420201)。
1.3.3 实验仪器电子分析天平(美国梅特勒-托利多公司)；CO2细胞培养箱(美国Themo公司)；Vaioskan Flash多功能酶标仪(美国Themo公司)；CKX41倒置光学显微镜(日本Olympus公司)，倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国Agilent公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 淫羊藿苷含药血清的制备根据课题组前期研究[17]，此次淫羊藿苷灌胃溶液质量浓度为0.25 mg/mL，每日于9：00对新西兰大白兔进行灌胃，连续7 d，灌胃前禁食12 h，灌胃量为10 mL/kg，末次灌胃2 h后心脏取血，37 ℃静置2 h，3 000 r/min离心10 min，取上清即得含药血清，56 ℃水浴灭活30 min，经0.22 μm针式过滤器除菌，分装后-20 ℃保存。
1.4.2 大鼠软骨细胞的分离培养脊椎脱臼法处死大鼠[18]，于体积分数75%乙醇中浸泡15 min，在超净工作台上，将大鼠置于洁净大皿，用高压灭菌的眼科剪先分离双后肢，剔除多余肌肉，再轻轻剪开膝关节囊暴露关节软骨，将软骨组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小并放在含有双抗的PBS中反复清洗3遍，先用含EDTA的0.25%胰酶孵箱消化30 min，0.2%Ⅱ型胶原酶孵箱消化12 h，加入等量含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基终止消化，过70 μm滤网后1 000 r/min离心5 min，去上清，加入适量含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基重悬细胞，吹打混匀，每个25 cm2培养瓶中接种5 mL细胞悬液，置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度的孵箱内培养，24 h首次换液，去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，同时观察细胞形态变化并作记录。待细胞融合度达90%时进行消化传代，取生长状况良好的第3代细胞用于实验。
1.4.3 大鼠BMSC的分离培养采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSC [19]，大鼠前期处理同1.4.2，分离双后肢股骨和胫骨，用含有双抗的PBS反复冲洗3遍，剪去骨头两侧干骺端暴露髓腔，用1 mL无菌注射器抽取PBS反复冲洗髓腔，直至骨头发白。收集所得细胞悬液，过70 μm滤网后加入适量红细胞裂解液静置15 min，室温1 000 r/min离心5 min，去上清，加入含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基重悬细胞，吹打均匀，每个25 cm2培养瓶中接种5 mL细胞悬液，置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度的孵箱内培养，24 h进行半换液，48 h进行全换液，之后每3 d换液1次，同时观察细胞形态变化并作记录，待细胞融合度达90%时进行传代培养，取生长状况良好的第3代细胞用于实验。
1.4.4 大鼠SMSC的分离培养[20] 大鼠前期处理同1.4.2，无菌条件下剪开后肢髌韧带，将髌韧带与内侧滑膜组织剥离开，取膝关节髌上囊内侧滑膜组织，放入含有双抗的PBS中反复清洗3遍，将取下的滑膜组织剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，加入含EDTA的0.25%胰酶孵箱消化30 min，再用0.2%Ⅰ型胶原酶孵箱消化12 h，加入等量含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基终止消化，过70 μm滤网后1 000 r/min离心5 min，去上清，加入适量含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基重悬细胞，吹打混匀，每个25 cm2培养瓶中接种5 mL细胞悬液，置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度的孵箱内培养，24 h首次换液，去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，同时观察细胞形态变化并作记录，待细胞融合度达90%时进行消化传代，取生长状况良好的第3代细胞用于实验。
1.4.5 软骨细胞鉴定采用甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞，将软骨细胞以每孔1.0×105数量接种于6孔板内盖玻片上，待细胞贴壁后再用含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基继续培养，待细胞融合率达90%左右时，取出盖玻片，PBS冲洗3遍，40 g/L多聚甲醛固定1 h，冲洗后置于染色架，滴加甲苯胺蓝染色液，室温染色30 min，PBS冲洗干净，晾干后树胶封固，显微镜下观察拍照并记录。
1.4.6 BMSC和SMSC鉴定采用流式细胞术鉴定BMSC和SMSC表面抗原，两者表达相同的细胞表面抗原，可通过流式细胞术共同鉴定。第3代BMSC和SMSC分别培养至完全融合，胰酶消化后制备单细胞悬液，离心去上清，用预冷PBS重悬洗涤2次，调整细胞浓度为1×109 L-1，取1 mL细胞悬液于1.5 mL EP管中，离心去上清，每管分别加入95 μL cell staining buffer和5 μL CD45、CD90、CD11b标记物抗体，同时每份样品再设置同型阴性对照，混匀后于4 ℃避光孵育30 min，离心去上清，cell staining buffer洗涤2次后重悬细胞，等待上机检测。
1.4.7 软骨细胞-BMSC-SMSC共培养体系的构建结合文献研究[21-23]，将第3代软骨细胞、BMSC和SMSC按不同细胞接种比例构建软骨细胞-BMSC-SMSC共培养体系，见表1，图1，上室分别培养BMSC和SMSC，下室培养软骨细胞，上室底部以孔径为0.4 μm的半透膜材料封固，只允许生物活性因子通过，以此观察细胞间相互影响和诱导作用；同时以相同密度的软骨细胞自身共培养做为对照，共培养72 h，通过CCK-8法检测各组软骨细胞增殖活性，Ⅱ型胶原免疫荧光染色检测各组软骨细胞表型表达，选取软骨细胞增殖活性和表型能力最佳的共培养体系进行后续实验研究。

1.4.8 淫羊藿苷含药血清干预实验取软骨细胞增殖活性和表型能力最佳的共培养体系进行淫羊藿苷含药血清干预实验，设置对照组和实验组，对照组采用含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养液培养，实验组在对照组基础之上加入体积分数10%的淫羊藿苷含药血清进行干预。两组培养24，48 h后，采用CCK-8法检测软骨细胞增殖活性、免疫荧光染色检测软骨细胞表型表达；另外两组培养14 d后终止诱导，采用Ⅱ型胶原免疫荧光染色检测BMSC和SMSC的成软骨分化情况。

1.4.9 CCK-8法检测软骨细胞增殖活性软骨细胞-BMSC-SMSC共培养体系培养72 h后，收集各组对应下室软骨细胞吹打混匀制备细胞悬液，以每孔100 μL细胞悬液均匀接种至96孔板进行培养，每组设立5个复孔，6 h待细胞完全贴壁后，更换无血清DMEM培养基，避光每孔加入10 μL CCK-8溶液，将96孔板置于培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度(A)值。
淫羊藿苷含药血清干预细胞共培养体系24，48 h后，收集两组对应下室软骨细胞吹打混匀制备细胞悬液，以每孔100 μL细胞悬液均匀接种至96孔板进行培养，每组设立5个复孔，6 h待细胞完全贴壁后，更换无血清DMEM培养基，避光每孔加入10 μL CCK-8溶液，将96孔板置于培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度(A)值。
1.4.10 Ⅱ型胶原免疫荧光染色软骨细胞-BMSC-SMSC共培养体系培养72 h后，将各组软骨细胞接种于6孔板内待细胞贴壁后弃培养液，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，用0.5%的Tritonx-100通透液室温处理10 min，PBS洗涤3次，之后加入山羊血清封闭液室温封闭30 min，弃封闭液并用吸水纸吸干，加入足量稀释倍数为1∶100的一抗(兔抗Ⅱ型胶原多克隆抗体)，4 ℃孵育过夜，吸去一抗，用1PBST清洗3次，避光下加入稀释倍数为1∶1 000的荧光二抗，室温摇床孵育1 h，吸去二抗，再用1PBST清洗3次，加入1∶100稀释的DAPI染液进行染核处理，室温避光染色5 min，弃去DAPI染液，用PBS清洗3次，于倒置荧光显微镜下进行观察拍照。
淫羊藿苷含药血清干预细胞共培养体系24，48 h收集软骨细胞，干预14 d收集BMSC和SMSC，将对应时间点的软骨细胞、BMSC和SMSC分别接种于6孔板中，待细胞贴壁后弃培养液，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤3次，用0.5%的Tritonx-100通透液室温处理10 min，PBS洗涤3次，加入山羊血清封闭液，室温封闭30 min，弃封闭液并用吸水纸吸干，加入足量稀释倍数为1∶100的一抗(兔抗Ⅱ型胶原多克隆抗体)，4 ℃孵育过夜，吸去一抗，用1PBST清洗3次，避光下加入稀释倍数为1∶1 000的荧光二抗，室温摇床孵育1 h，吸去二抗，再用1PBST清洗3次，加入1∶100稀释的DAPI染液进行染核处理，室温避光染色5min，弃去DAPI染液，PBS清洗3次，于倒置荧光显微镜下进行观察拍照。
1.5 主要观察指标 ①软骨细胞-BMSC-SMSC共培养体系中软骨细胞增殖率和表型能力；②淫羊藿苷含药血清对共培养体系中软骨细胞增殖活性和表型能力的影响。

1.6 统计学分析数据均采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，计量资料用x±s表示，每组处理平行重复3次，符合正态分布且方差齐的数据多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，两组间方差不齐者用Dunnet T3检验，检验水准α=0.05。文章统计学方法已经通过张君涛主任医师审核。

讨论

软骨细胞和细胞外基质是组成膝关节软骨组织的主要成分[26]。大量研究表明，膝关节软骨损伤的发生发展与软骨细胞衰老和细胞外基质降解有关[27-28]。正常情况下软骨损伤较轻时，软骨细胞可通过自身增殖并合成分泌胶原蛋白补充软骨基质来进行微弱修复，当软骨细胞出现衰老时，细胞外基质降解加剧，抑制合成与修复能力，加重关节软骨损伤病情[29]。随着组织工程技术发展，更多促进软骨细胞再生、修复受损软骨组织的方法被开发出来。自体软骨细胞移植术通过将非负重区软骨细胞进行体外扩增再回植入关节腔内，虽也能够生成透明软骨样组织，但存在软骨细胞体外培养易去分化等问题，导致临床效果不佳，因此维持软骨细胞表型是体外培养软骨细胞的关键[30]。
膝关节软骨细胞周围最主要的细胞为BMSC和SMSC，软骨细胞的新陈代谢与损伤修复离不开此2种细胞及分泌的各种细胞因子和活性蛋白[31-32]。研究表明，人体关节软骨细胞总数目约3亿多，其中膝关节内软骨细胞占一半左右，而BMSC和SMSC因分化程度较低，在组织内含量较少，但BMSC和SMSC具有多向分化潜能[33]。在体内时，关节腔内微环境可诱导BMSC和SMSC成软骨分化，以此来补充衰老的软骨细胞，这种基于细胞间相互诱导作用为体外细胞共培养提供了基础。ZHAO等[34]发现BMSC能够刺激软骨细胞增殖和基质产生而起到软骨营养作用，与单独软骨细胞培养相比，BMSC和软骨细胞共培养时产生更多的糖胺聚糖沉积，增强了软骨细胞的功能活性。刘朝政等[35]研究表明BMSC可通过抑制Rho/ROCK信号通路调控Bax、Bcl-2蛋白表达，抑制软骨细胞凋亡。QIONG等[36]研究发现软骨细胞与SMSC共培养，可促进软骨细胞增殖和SMSC软骨向分化，同时激活MAPK信号通路，提高了软骨细胞中蛋白聚糖、SOX9和Ⅱ型胶原的表达。由此可见，间充质干细胞与软骨细胞共培养时可以更好地促进软骨细胞功能表达，但目前共培养研究还只限于两种细胞，难以模拟软骨细胞体内环境。
为使体外细胞实验更贴合体内研究，课题组以不同接种细胞比例构建软骨细胞-BMSC-SMSC非接触共培养体系，以此模拟软骨细胞体内环境，最大程度维持体外软骨细胞表型。Ⅱ型胶原是软骨细胞维持分化表型的特征性指标[24]，马春辉等[37]研究发现Ⅱ型胶原表达量减少直接关系到软骨细胞的质与量，是骨关节炎软骨损伤发病的重要环节。课题组通过检测各组软骨细胞增殖活性和Ⅱ型胶原表达量，筛选出软骨细胞功能表达最佳的共培养体系。研究发现，当软骨细胞∶BMSC∶SMSC为2∶1∶1时，此时软骨细胞增殖活性和表型能力最佳。张松等[38]研究发现关节软骨细胞和SMSC以2∶1比例进行非接触共培养时，不仅促进SMSC成软骨分化，维持软骨细胞表型，并在一定程度上降低共培养体系中基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13等炎症因子表达。这与该研究结果基本相符，因此采用软骨细胞∶BMSC∶SMSC为2∶1∶1这一细胞比例进行后续干预研究。
骨关节炎软骨损伤病位在筋骨，其本在肾，肾为先天之本，主骨生髓，肾气盛则精髓充足，则骨骼发育正常而强健有力[39]。补肾强骨类中药淫羊藿苷因具有多重药理学活性，故在关节软骨损伤修复中备受关注，具有降低关节炎症反应、抑制软骨细胞凋亡和软骨基质降解等作用[40]。
XU等[41]研究发现淫羊藿苷具有良好的软骨形成和抗炎特性，能够促进软骨细胞增殖和软骨损伤再生修复。TANG等[42]研究表明淫羊藿苷能够提高BMSC分泌聚集蛋白聚糖、骨形态发生蛋白2和Ⅱ型胶原A1蛋白表达，促进BMSC成软骨分化，加速软骨损伤修复。前期研究发现，单纯淫羊藿苷原液对软骨细胞增长并不明显，而经过生物转化的淫羊藿苷含药血清能够促进软骨细胞增殖和糖胺聚糖分泌[17]。ZHANG等[43]研究表明淫羊藿苷含药血清能够促进软骨缺损模型中糖胺聚糖分泌和关节软骨细胞Ⅱ型胶原A1表达，逆转软骨下骨重塑，降低炎症因子基质金属蛋白酶13和解聚蛋白样金属蛋白酶5水平，促进关节软骨损伤修复。CHENG等[44]利用超高效液相色谱-串联质谱法分析发现，大鼠口服淫羊藿苷后91.2%转化为淫羊藿次苷Ⅱ，而静脉给药只有0.4%的淫羊藿苷转化为淫羊藿次苷Ⅱ，表明淫羊藿苷口服后经过胃肠道转化，血清中含药浓度更高，因此采用含药血清干预研究更能贴合真实体内环境。该研究采用0.25 mg/mL的淫羊藿苷混悬液进行灌胃制备淫羊藿苷含药血清，研究结果显示，淫羊藿苷含药血清具有促进软骨细胞-BMSC-SMSC非接触共培养体系中软骨细胞增殖的作用，与对照组相比，淫羊藿苷含药血清干预24 h时软骨细胞增殖效果最明显；免疫荧光染色显示淫羊藿苷含药血清干预24 h后能够显著促进软骨细胞Ⅱ型胶原表达，增强软骨细胞表型能力，且48 h后两组仍具有差异。此外，淫羊藿苷含药血清干预14 d后BMSC和SMSC出现明显的软骨分化倾向，表明淫羊藿苷含药血清具有促进共培养体系中BMSC和SMSC成软骨分化的能力。
综上，组织工程技术的核心在于使种子细胞功能得到高表达，该研究构建的软骨细胞-BMSC-SMSC共培养体系能够模拟软骨细胞所处体内微环境，最大程度维持软骨细胞表型。淫羊藿苷含药血清具有促进该共培养体系中软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原表达的作用，能够提高软骨细胞的功能活性，同时淫羊藿苷含药血清能够促进共培养体系中BMSC和SMSC的成软骨分化，其作用的信号通路机制目前尚不明确。细胞增殖和分化功能与组织修复能力密切相关，但软骨损伤后期关节腔内微环境改变，致使各种炎症因子产生，而由炎症因子激活产生氧化应激造成软骨损伤持续存在则是影响软骨损伤修复的重要因素。后续基于软骨细胞-BMSC-SMSC共培养体系，课题组将在淫羊藿苷含药血清作用信号通路机制、抑制炎症因子和氧化应激表达方面进行进一步研究，为探索补肾强骨中药有效成分修复关节软骨损伤提供新的研究方向和思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

淫羊藿苷含药血清促进3种细胞共培养体系中软骨细胞增殖和干细胞成软骨分化

Icariin-containing serum promotes chondrocyte proliferation and chondrogenic differentiation of stem cells in the co-culture system of three kinds of cells

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