2.1   体外培养的骨髓间充质干细胞具备成骨、成软骨、成脂诱导分化能力   成骨诱导21 d，茜素红染色可见红色颗粒物，见图2A；成软骨诱导7 d，甲苯胺蓝染色可见大量蓝色颗粒物，见图2B；成脂诱导21 d，油红O染色可见大量红色脂滴，见图2C。表明体外培养的骨髓间充质干细胞经诱导后可向成骨、成软骨、成脂细胞分化。



2.2   不同粗糙度的PDMS皿底表征   为了制备具有不同表面形貌的PDMS， 选用120，1 000，10 000目砂纸为模具，标记为PDMS-120M，PDMS-1000M和PDMS-10000M，未与砂纸接触直接与空气接触的PDMS为对照，制作了4种不同表面形貌的PDMS，用于研究不同表面形貌PDMS对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制。宏观上看PDMS-120M表面具有明显的起伏，而随着砂纸目数的增大，PDMS表面的起伏越趋近于平坦，未与砂纸接触的PDMS表面较为光滑。通过扫描电镜可以看到PDMS表面随着砂纸目数的减小，孔径越来越大，峰间距逐渐扩大，见图3A。3D轮廓仪可以看到随着砂纸目数的减小，PDMS波峰的平均高度逐渐增大，PDMS、PDMS-10000M、PDMS-1000M和PDMS-120M粗糙度分别为(0.035±0.360)，(2.92±1.32)，(13.51±2.11)，(34.50±6.08) μm，
见图3B，C。




2.3   静态条件下不同粗糙度PDMS表面对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响   成骨诱导7 d，RT-qPCR检测结果显示与对照组相比，PDMS-1000M使Runt相关转录因子2 mRNA表达量增加了138.9%，使Ⅰ型胶原mRNA表达量增加了360.1%，使骨钙素mRNA表达量增加了269.4%，见图4。说明静态条件下PDMS-1000M表面促进骨髓间充质干细胞成骨分化的效果更好。



2.4    不同拉伸幅度对相对光滑PDMS表面骨髓间充质干细胞成骨分化的影响   拉伸时同时进行成骨诱导3 d，RT-qPCR检测结果显示在4%大应变拉伸幅度下成骨基因Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶表达量最高，见图5。



2.5   不同拉伸幅度对PDMS-1000M表面骨髓间充质干细胞成骨分化的影响   拉伸时同时进行成骨诱导3 d，RT-qPCR检测结果显示在2%拉伸幅度下成骨基因Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙素、碱性磷酸酶表达量最高，明显高于4%，6%拉伸组(P < 0.01，P < 0.005)，见图6。




2.6   2%拉伸幅度下不同糙度PDMS表面对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响   
2.6.1   对骨髓间充质干细胞增殖的影响   随着培养时间的延长，各组细胞显著增殖，第5天PDMS-1000M表面细胞增殖最为明显，比PDMS组高40.5%(P < 0.001)，比PDMS-10000M组高33.0%(P < 0.001)，比PDMS-120M组高28.1%(P < 0.001)，见图7，说明2%拉伸幅度下PDMS-1000M表面促进骨髓间充质干细胞增殖效果最显著。




2.6.2   对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响   成骨诱导3 d，RT-qPCR检测结果显示PDMS-1000M表面骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原、骨钙素、转录因子 Osterix、碱性磷酸酶mRNA表达量均高于PDMS、PDMS-10000M、PDMS-120M组，见图8。成骨诱导7 d，Western blot检测结果显示PDMS-1000M表面骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原、Runt相关转录因子2、骨钙素的蛋白表达量均高于PDMS、PDMS-10000M、PDMS-120M组，见图9。








2.6.3   碱性磷酸酶染色结果   对2%拉伸幅度下不同粗糙度PDMS表面骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d后，进行碱性磷酸酶(早期成骨的典型标志物)染色，结果显示，PDMS-1000M具有更多的碱性磷酸酶染色阳性细胞，见图10。




2.6.4   茜素红染色结果   PDMS-1000M与其他组相比有更多的钙沉积，通过溶解钙结节，相比PDMS组，PDMS-1000M使晚期钙沉积增加了52.3%，见图11。这也进一步说明了2%拉伸条件下PDMS-1000M促进晚期成骨分化的效果。



2.7   2%拉伸幅度下不同粗糙度PDMS表面骨髓间充质干细胞中SIRT1表达   成骨诱导3 d，RT-qPCR检测结果显示PDMS-1000M组SIRT1的mRNA表达量明显高于PDMS组、PDMS-10000M组(P < 0.001)和PDMS-120M组(P < 0.005)，见图12。PDMS-1000M组SIRT1蛋白表达量明显高于PDMS组、PDMS-10000M组(P < 0.005)和PDMS-120M组(P < 0.05)，见图13。

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骨髓间充质干细胞是来源于骨髓的骨骼祖细胞，具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等多种细胞类型分化的能力，是细胞治疗和组织工程中常用的干细胞[1-5]。ERENAY等[6]研究发现间充质干细胞所处的微环境对细胞行为具有重要的调节作用。除了微环境中存在的生化线索外，细胞所处微环境的生物物理和生物力学特性也会影响细胞功能，并最终影响细胞命运。
研究表明，机械刺激在间充质干细胞成骨分化过程中起到重要作用[7-10]。机械力可以通过拉伸、压缩、剪切等多种形式，改变细胞的形态、信号转导通路和基因表达等，调控细胞的增殖、分化和凋亡等功能[8]。拉伸对间充质干细胞成骨分化具有重要影响。SUMANASINGHE等[11]对人体间充质干细胞施加循环拉伸应变会促进成骨分化，且发现骨形态发生蛋白2的表达显著上调，表明骨形态发生蛋白2在拉伸促进间充质干细胞成骨分化过程中起到了重要调节作用。DONG等[12]研究揭示了机械力-炎症反应-成骨分化轴之间的联系，结果表明机械拉伸可以使巨噬细胞向M2表型极化，最终促进间充质干细胞成骨分化。ZHANG等[13]研究发现在1 Hz、8%拉伸幅度的循环拉伸条件下可以促进成骨相关基因的表达增加。GUO等[7]研究发现在1 Hz、5%拉伸幅度下也可以促进间充质干细胞成骨分化。而MAEDA等[14]的研究发现在1 Hz、10%拉伸幅度下抑制了间充质干细胞成骨分化。这些研究都说明机械拉伸对成骨分化有重要的影响。
研究表明，生物材料表面的粗糙度和形貌会强烈影响细胞行为，例如细胞的增殖、迁移、分化和黏附[15-16]。在间充质干细胞的成骨分化过程中，表面形貌也起到了重要的调节作用[17-20]。通过改变细胞所处微环境的表面形貌能够更好地提高间充质干细胞的成骨能力[21]。
细胞所处的微环境同时受到机械拉伸和表面形貌的影响，而两者对间充质干细胞的综合作用研究较少。该研究探讨拉伸条件下聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)表面粗糙度对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，探讨其可能的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1   材料和方法   Materials and methods
1.1    设计   体外细胞学实验：①研究静态条件下，不同PDMS表面对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响；②研究0%，2%，4%，6%不同拉伸幅度对相对光滑PDMS表面和粗糙PDMS-1000M表面骨髓间充质干细胞成骨分化的影响；③研究2%拉伸幅度对不同粗糙度PDMS表面骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
1.2   时间及地点   实验于2022年10月至2023年11月在苏州大学附属第一医院骨科研究所完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   4周龄雄性SD大鼠6只，体质量230-260 g，购于杭州启真实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK(浙)2022-0005。实验方案经苏州大学动物伦理委员会批准，审批号为SUDA20231116A05，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   实验试剂和仪器   胎牛血清、α-MEM培养基、青霉素-链霉素溶液(双抗)、0.25%胰蛋白酶、辣根过氧化物酶结合偶联的二抗、PBS(武汉普诺赛生命科技有限公司)；Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙素、碱性磷酸酶、成骨相关转录因子Osterix、沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)和GAPDH抗体(美国Affinity公司)；Tubulin抗体、HRP偶联羊抗兔二抗、HRP偶联羊抗小鼠二抗、DAPI染色液、茜素红、碱性磷酸酶染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；40 g/L多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)；PDMS(Sylgard 184，美国 Dow Corning公司)；TRIzol RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；Prime Script™ RT-PCR试剂盒(南京建成生物工程研究所)；无水乙醇(≥99.8%)(上海阿拉丁试剂有限公司)；反转录试剂盒(日本Takara公司)；SYBR-Green (美国Bio-Rad公司)；高压蒸汽灭菌锅、-80 ℃冰箱(日本Sanyo公司)；电子天平(苏州欧米特公司)；水浴锅(江苏金仪公司)；机械应变加载系统(日本Panasonic公司)；3D光学轮廓仪(西班牙Sensofar公司)；IX51倒置光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；倒置荧光显微镜(德国Zeiss公司)；全波长酶标仪(美国BioTek公司)；实时定量PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)；扫描电子显微镜(Quanta FEG250， FEI公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   不同粗糙度PDMS表面的制备和表征   将PDMS预聚物与交联剂以质量比10∶1的比例充分搅拌均匀，1200 r/min离心5 min去除产生的气泡，缓慢倒入铺有不同目(10 000，1 000，120目)砂纸的铁盒中，然后放入烘箱中，在100 ℃条件下烘干1 h使其充分固化，PDMS固化后可以较容易的从砂纸表面分离下来，根据需要裁剪成不同的大小，便于放入不同的细胞培养孔板中进行静态条件下研究，未与砂纸接触直接与空气接触的PDMS作为相对光滑对照组。
同样，根据需要制成不同粗糙表面的拉伸皿，将液态PDMS倒入拉伸皿，将不同目砂纸紧密贴合在液态PDMS表面，然后放入烘箱中，100 ℃条件下烘干1 h使其充分固化，PDMS固化后将砂纸从拉伸皿表面剥离，得到不同粗糙表面的拉伸皿，用于拉伸条件下研究。与空气接触的PDMS皿底作为对照组。将制成的皿底用扫描电镜和3D轮廓仪进行表征。
1.4.2   骨髓间充质干细胞培养   从4周龄的SD大鼠股骨和胫骨骨髓中分离骨髓间充质干细胞。
具体方法如下：分离股骨和胫骨，放入含有10%双抗的α-DMEM基础培养基中，转移至无菌操作台，用含有10%双抗的PBS冲洗3次，每次5 min，剪断股骨、胫骨干骺端，放进1 mL枪头中，干骺端朝下，将枪头插入  50 mL离心管，1 200 r/min离心5 min，从离心管倒出上清液，细胞沉淀用含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的α-DMEM培养基重悬，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，每3 d换1次液，待其长满至10 cm培养皿的80%-90%时，用0.25%胰酶溶液消化开始传代，传至第2，3代的细胞用于后续实验。
1.4.3   骨髓间充质干细胞三系分化能力   成骨诱导培养基：α-MEM+体积分数10%胎牛血清+1%双抗+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+50 μg/mL维生素C+10-7 mol/L 地塞米松；成软骨诱导培养基：α-MEM+0.1 μmol/L地塞米松+体积分数10%胎牛血清+50 μg/mL抗坏血酸+50 μg/mL脯氨酸+10 ng/mL转化生长因子β1+6.25 μg/mL转铁蛋白+亚硒酸+亚油酸；成脂诱导培养基：α-MEM+体积分数10%胎牛血清+1%双抗+10-6 mol/L 地塞米松+ 5×10-4 mol/L IBMX +10-4 mol/L 吲哚美辛+10 μg/mL胰岛素+50 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。将第3代骨髓间充质干细胞接种至12孔细胞培养板中(每孔2.5×105个)，第2天更换成骨诱导培养基、成软骨诱导培养基、成脂诱导培养基，每3 d换液1次，成骨诱导21 d进行茜素红染色，成软骨诱导7 d后进行甲苯胺蓝染色，成脂诱导21 d后进行油红O染色。
1.4.4   静态条件下不同粗糙度PDMS表面对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响   静态条件下，将第3代骨髓间充质干细胞接种于含有不同粗糙度PDMS的6孔细胞培养板中(每孔1.5×106个)，第2天更换成骨诱导培养基，每3 d换液1次，成骨诱导7 d采用 RT-qPCR检测成骨基因 Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙素的表达。
1.4.5   不同拉伸幅度条件下相对光滑PDMS表面和PDMS-1000M粗糙表面对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响   机械拉伸装置由计算机系统、控制单元、驱动电机和细胞培养硅胶室组成。控制单元、驱动电机和细胞培养硅胶室(3 cm×6 cm)，见图1。拉伸皿经过灭菌处理后，在相对光滑PDMS和PDMS-1000M基底上铺明胶过夜，在预处理过的拉伸皿表面以初始密度为3 000个/cm2接种第3代骨髓间充质干细胞，24 h后对细胞进行纵向拉伸，同时更换为成骨诱导培养基。由计算机控制设备产生纵向拉伸，拉伸频率为1 Hz，拉伸幅度为0，2%，4%，6%，每天持续拉伸4 h。在纵向拉伸过程中，细胞置于 37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，每3 d换液1次，在相对光滑PDMS表面培养的细胞成骨诱导3 d时采用 RT-qPCR检测成骨基因 Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶的表达，在PDMS-1000M粗糙表面培养的细胞成骨诱导3 d时采用 RT-qPCR检测Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙素、碱性磷酸酶的表达。

1.4.6   2%拉伸幅度条件下不同粗糙度PDMS表面对骨髓间充质干细胞增殖的影响  使用CCK-8细胞增殖试剂盒检测细胞增殖情况。将第3代骨髓间充质干细胞以1 000个/cm2的密度接种在不同粗造度PDMS的拉伸皿进行拉伸幅度为2%的纵向拉伸，每天持续拉伸4 h，在培养第1，3，5天，加入1 mL CCK-8溶液，在37 ℃条件下避光孵育1 h，使用微孔板分光光度计在450 nm处测量吸光度值。

1.4.7   2%拉伸幅度条件下不同粗糙度PDMS表面对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响   第3代骨髓间充质干细胞以3 000个/cm2接种于拉伸皿，24 h后对细胞进行拉伸幅度为2%的纵向拉伸，同时更换为成骨诱导培养基，每天持续拉伸4 h。细胞置于 37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，每3 d换液1次，成骨诱导3 d采用 RT-qPCR检测SIRT1基因和成骨基因Ⅰ型胶原、骨钙素、转录因子 Osterix 、碱性磷酸酶的表达，Western blot检测SIRT1的蛋白表达；成骨诱导7 d进行碱性磷酸酶染色，Western blot检测Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙素的蛋白表达；成骨诱导21 d进行茜素红染色。
1.4.8   RT-qPCR检测   使用RNA提取试剂提取骨髓间充质干细胞总RNA，使用PrimeScript™ RT Master Mix试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后使用iTap™Universal SYBR®Green Supermix试剂盒在CFX96™实时PCR系统上按照制造商的方法进行定量PCR。以GAPDH为内参，检测SIRT1基因和成骨基因Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙素、碱性磷酸酶、转录因子Osterix的表达，引物序列见表1，mRNA相对表达水平以2-ΔΔCT表示。

1.4.9   碱性磷酸酶染色及活性测定   ①碱性磷酸酶染色：成骨诱导分化7 d，使用碱性磷酸酶染色试剂盒对细胞进行染色：弃去培养基，用无菌PBS清洗3次，每次3-5 min；加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，每次3-5 min；最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品，室温避光孵育，直至显色至预期深浅；去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤一两次即可终止显色反应，于显微镜下拍照观察。②碱性磷酸酶活性测定：成骨诱导分化7 d，弃去培养基，用无菌PBS清洗3次，每次3-5 min；加入蛋白裂解液，充分混匀后离心取上清液；加入碱性磷酸酶检测试剂盒工作液37 ℃孵育5-10 min；每孔加入100 μL反应终止液终止反应，用全波长酶标仪在405 nm测定吸光度值。
1.4.10   茜素红染色   成骨诱导21 d，使用茜素红染色试剂盒进行染色。细胞用PBS洗1次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，加入适量茜素红染色液，均匀覆盖细胞即可，室温染色30 min，用蒸馏水充分洗涤，于显微镜下拍照观察。拍照结束后，吸出PBS，加入10%高氯酸溶液，室温孵育10 min，通过全波长酶标仪检测420 nm波长处的吸光度值。
1.4.11   Western blot   细胞加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液RIPA冰上孵育1 h ，使用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度，根据蛋白浓度来确定上样量。取等量的变性蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离，然后再转移至硝酸纤维素膜上，将膜在封闭液中封闭30 min，加入一抗(Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙素、SIRT1抗体，稀释比例1∶1 000)，在4 ℃冰箱孵育过夜，用相应的辣根过氧化物酶结合的二抗在室温下孵育1 h，洗膜后加入超敏化学发光底物，使用多功能成像系统显像并拍照，使用Image J软件对条带强度进行量化。
1.5   主要观察指标   SIRT1的表达；成骨相关Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原、骨钙素、转录因子Osterix、碱性磷酸酶的表达；早期成骨指标碱性磷酸酶染色结果；晚期成骨指标茜素红染色结果。
1.6   统计学分析   采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。多组的计量资料比较采用单因素方差分析，若数据符合正态分布，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)检验；若不符合正态分布，两两比较则使用非参数检验分析。所有数据均经过GraphPad Prism 8.0软件进行图像绘制，所有数据均以均数±标准误表示。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。

该研究通过比较不同粗糙度PDMS表面对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，结果显示在粗糙度为(13.51±2.11) µm的PDMS-1000M表面能够更好地促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。通过研究不同拉伸幅度对光滑PDMS表面骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，结果显示在4%拉伸幅度下能够更好地促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，表明力学刺激对骨髓间充质干细胞有重要的影响。通过研究2%拉伸幅度对不同粗糙度PDMS表面骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，结果发现PDMS-1000M表面的骨髓间充质干细胞在2%拉伸条件下具有最好的成骨分化效果，与相对光滑PDMS表面相比，促成骨的最佳拉伸幅度减小。
具有一定粗糙度的表面形貌在骨组织稳态中起到了重要的调节作用，可促进间充质干细胞成骨分化[6，22-24]。SARUTA等[25]通过机械加工得到了平均粗糙度分别为(12.50±0.65)，(123.00±6.15)，(24.0±1.2) nm的3种纳米级别的表面形貌，结果发现粗糙度为(24.0±1.2) nm的表面钙沉积和成骨基因表达量最高。ERENAY等[6]使用PDMS完整复刻了牛股骨表面的形貌，并发现具有天然骨形貌的PDMS能够促进间充质干细胞增殖、矿化和Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、成骨相关转录因子Osterix等成骨基因的表达。此研究通过简易的方法制备了具有微米级别的粗糙表面，尺寸范围分别为(0.035±0.36)，(2.92±1.32)，(13.51±2.11)，(34.5±6.08) µm，比较了不同微米尺度的表面形貌对骨髓间充质干细胞的影响，研究发现粗糙度为(13.51±2.11) µm 的PDMS-1000M表面可以更好地促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。
骨的最主要功能是给身体提供支撑框架并协助机体的运动，其重要特点是具有应力适应性，当受到扭曲、拉伸、压缩等力作用时，它可改变自身的结构和质量以适应功能性应变。由于生命体时刻处于力学环境中，因而应力对骨的生长、重建和成形起着重要的调节作用[26]。适度运动作为一种有效的非药物治疗方法，有助于促进骨骼形成及缓解骨质疏松[27]。骨骼由机械力刺激所能产生的应变(定义：变形/初始长度)总是在一个正常生理范围内，其极限应变为骨折断裂时的1.5%。然而，大多数的体外细胞分子实验所采用的应变范围远远大于 1.5%，通常在5%-20%之间[7，14，28]。CHEN等[28]研究了骨髓间充质干细胞在2.5%，5%和10%不同应变量级的机械拉伸下对细胞增殖、细胞内活性氧和成骨的影响，结果显示5%应变机械拉伸能更好地诱导抗氧化反应，促进成骨。ZHANG
等[13]研究发现与未拉伸组相比，1 Hz+8%应变组成骨标志物基因表达最高。此研究对PDMS-1000M表面的骨髓间充质干细胞进行不同幅度拉伸，结果表明在2%拉伸条件下有较好的促进成骨分化的效果。骨髓间充质干细胞在PDMS-1000M表面的最佳促成骨拉伸幅度为2%，远小于光滑PDMS表面上4%的拉伸幅度，这可能是因为细胞所处的力学微环境受力不均，细胞响应是与细胞所受的局部受力微环境直接相关，而局部受力环境与整体受力相关，也与局部的结构形貌(粗糙度)相关。从力学角度看，形貌的不均匀性会导致局部应力集中，使得局部应力大于整体应力[29-30]，在外部施加较小的力学刺激可以实现大应变条件下的成骨效果。
SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的脱乙酰基酶[31]，对细胞衰老、凋亡、炎症反应、氧化应激等具有重要的调节作用[32-38]。SIRT1在力学刺激促间充质干细胞成骨分化中起到重要作用。ZHOU等[39]研究发现SIRT1的激活可以保护间充质干细胞免受氧化应激导致的早衰。CHEN等[28]发现SIRT1在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中起到重要调节作用，适当的机械拉伸可以激活AMPK-SIRT1信号通路，提高骨髓间充质干细胞的抗氧化功能，有利于骨再生。LU等[38]研究发现SIRT1的激活可以通过BMP/Smad和BMP/MAPK信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。此研究也表明在2%拉伸条件下，粗糙度为(13.51±2.11) µm的PDMS-1000M微观表面形貌促进骨髓间充质干细胞成骨分化与SIRT1激活有关。
下一步将细化研究拉伸条件下粗糙度对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，实现体外小应变条件下对间充质干细胞成骨分化的促进作用。该研究检测的是机械拉伸对骨髓间充质干细胞整体的影响，单细胞受到的具体力的大小及影响有待进一步研究。体内细胞所处微环境的力学因素及生物环境等更加复杂，其他细胞及通路对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响有待进一步研究。在合适的粗糙度下，更小的应变(< 1.5%)也可能达到大应变成骨分化的效果，对此将进行进一步的研究。
结论：粗糙度为(13.51±2.11) µm的PDMS-1000M微观表面形貌可以更好地促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。一定粗糙度的PDMS-1000M表面形貌可以使机械拉伸促进骨髓间充质干细胞成骨分化的最佳拉伸幅度减小；拉伸条件下粗糙PDMS-1000M表面促骨髓间充质干细胞成骨分化的作用与激活SIRT1信号通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

机械刺激在人体骨关节研究及体外骨细胞生物学实验中都起到了非常大的作用。例如体育锻炼所施加的机械刺激会增加骨密度，而缺乏身体活动会导致骨密度降低。运动疗法因其不良反应少、安全性高、实用性强、操作简单等特点而受到重视。而体外实验中，细胞对机械力感应则发生在5%-20%的大应变区间，尤其是在5%的机械拉伸幅度可以较好地促进间充质干细胞成骨分化。但研究发现，体内和体外的机械刺激在应变量上存在较大的区别，主要由于体内间充质干细胞对机械力的感应受其附着的骨骼约束，其极限为骨折断裂时的骨应变(1.5%)，因此体外实验中较大拉伸幅度促成骨分化效果很难在临床中应用。探索两者差异存在的原因和机制，对体外细胞实验更合理地模拟体内环境以及将此规律应用于体内的机械物理治疗，具有重要意义。本研究结果有望为进一步的临床研究和应用提供理论参考和依据，这些结果为开发具有一定表面形貌的新型生物材料平台提供了积极的见解。本研究检测的是机械拉伸对间充质干细胞整体的影响，但单细胞受到的具体力的大小及对细胞的影响有待进一步研究。体内细胞所处微环境的力学因素及生物环境等更加复杂，如何更加精确的在体外表征体内细胞所处微环境的力学刺激，以及其他细胞及通路对间充质干细胞成骨分化的影响有待进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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