骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层修饰提高聚醚醚酮表面活性

doi:10.12307/2025.422

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (16): 3318-3325.doi: 10.12307/2025.422

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层修饰提高聚醚醚酮表面活性

秦敬杰1，郭子歌2，李睿2，3，马士卿4，卢瑞杰2，李梦君2

1天津市黄河医院口腔科，天津市 300110；2天津医科大学口腔医院修复科，天津市 300070；3 石嘴山市第二人民医院口腔科，宁夏回族自治区石嘴山市 753000；4天津医科大学第二医院口腔科，天津市 300211

收稿日期:2024-02-03 接受日期:2024-04-09 出版日期:2025-06-08 发布日期:2024-09-02
通讯作者: 李睿，博士，副教授，天津医科大学口腔医院修复科，天津市 300070；石嘴山市第二人民医院口腔科，宁夏回族自治区石嘴山市 753000
作者简介:秦敬杰，男，1982年生，天津市人，汉族，硕士，主要从事口腔修复学方向的研究。
基金资助:
吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金项目(320.6750.2021-07-21)，项目负责人：马士卿

Modification with bone forming peptide 1 and polydopamine coating to improve bioactivity of polyetheretherketone surface

Qin Jingjie1, Guo Zige2, Li Rui2, 3, Ma Shiqing4, Lu Ruijie2, Li Mengjun2

1Department of Stomatology, Huanghe Hospital of Tianjin, Tianjin 300110, China; 2Department of Prosthodontics, Stomatological Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 3Department of Stomatology, Shizuishan Second People’s Hospital, Shizuishan 753000, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 4Department of Stomatology, Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211, China

Received:2024-02-03 Accepted:2024-04-09 Online:2025-06-08 Published:2024-09-02
Contact: Li Rui, PhD, Associate professor, Department of Prosthodontics, Stomatological Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; Department of Stomatology, Shizuishan Second People’s Hospital, Shizuishan 753000, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Qin Jingjie, Master, Department of Stomatology, Huanghe Hospital of Tianjin, Tianjin 300110, China
Supported by:
Wu Jieping Medical Foundation Clinical Research Special Grant Fund, No. 320.6750.2021-07-21 (to MSQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨形成肽1：骨形态发生蛋白是转化生长因子β超家族中的成员，大量研究表明骨形态发生蛋白可以调节血管和新骨形成。骨形成肽1是从骨形成蛋白7未成熟区结构提取出的一条短肽，相较于蛋白大分子来说具有更好的稳定性和低免疫原性。
聚多巴胺：是由多巴胺在碱性环境中氧化自聚合形成的，具有类似贻贝黏附蛋白的功能，可以黏附在多种材料表面。同时，聚多巴胺涂层中大量的邻苯二酚基团可以与多肽发生反应，从而形成牢固稳定的化学结合。

背景：聚醚醚酮具有与人体皮质骨相近的弹性模量及良好的射线透射性、化学稳定性和生物相容性等优点，有望应用于口腔种植领域，然而其具有生物惰性，难以与周围组织形成骨结合，因此如何提高聚醚醚酮的表面活性是目前的主要问题。
目的：分析聚醚醚酮表面骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层的促成骨和成血管作用。
方法：将聚醚醚酮片浸泡于多巴胺溶液中24 h，制备聚醚醚酮-聚多巴胺材料；将聚醚醚酮-聚多巴胺材料浸泡于骨形成肽1溶液中24 h，制备聚醚醚酮-聚多巴胺-骨形成肽1材料，表征材料的微观形貌、亲水性与元素组成。将骨髓间充质干细胞分别接种于聚醚醚酮、聚醚醚酮-聚多巴胺、聚醚醚酮-聚多巴胺-骨形成肽1材料表面，通过活死细胞染色和细胞骨架染色评估细胞活性与黏附状态，茜素红和骨钙素免疫荧光染色检测细胞成骨分化能力。将人脐静脉内皮细胞分别接种于3组材料表面，通过活死细胞染色和细胞骨架/血管内皮生长因子免疫荧光染色评估细胞活性及成血管水平。
结果与结论：①扫描电镜下可见聚醚醚酮材料表面光滑，聚醚醚酮-聚多巴胺材料表面出现凹凸不平的沉积物，聚醚醚酮-聚多巴胺-骨形成肽1材料表面有小颗粒突起；接触角测试结果显示，聚醚醚酮-聚多巴胺-骨形成肽1材料的亲水性优于其他两种材料；X射线光电子能谱测试结果显示，骨形成肽1成功修饰于聚醚醚酮材料表面；②活死细胞染色和细胞骨架染色显示，相较于其他两种材料，聚醚醚酮-聚多巴胺-骨形成肽1材料可提高骨髓间充质干细胞的活性与黏附；茜素红和骨钙素免疫荧光染色显示，相较于其他两种材料，聚醚醚酮-聚多巴胺-骨形成肽1材料可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化；③活死细胞染色和免疫荧光染色显示，相较于其他两种材料，聚醚醚酮-聚多巴胺-骨形成肽1材料可提高人脐静脉内皮细胞的活性与黏附及血管内皮生长因子蛋白的表达；④结果表明，骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层可提高聚醚醚酮表面的促成骨和成血管活性。
https://orcid.org/0000-0002-4079-8008 (秦敬杰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 聚醚醚酮, 表面改性, 聚多巴胺, 涂层, 骨形成肽1, 成骨分化, 成血管

Abstract: BACKGROUND: Polyether ether ketone has the advantages of elastic modulus close to human cortical bone, good ray transmission, chemical stability, and biocompatibility. Polyether ether ketone is expected to be applied in the field of oral implants. However, polyether ether ketone is bioinert and is difficult to integrate with surrounding bone tissue. Therefore, how to improve the surface bioactivity of polyether ether ketone remains a major issue.
OBJECTIVE: To analyze the osteogenic and vasogenic effects of polyether ether ketone surface bone forming peptide 1 and polydopamine composite coating.
METHODS: Polyether ether ketone titanium sheets were immersed in dopamine solution for 24 hours to prepare polyether ether ketone-polydopamine materials. Polyether ether ketone-polydopamine material was immersed in the bone forming peptide 1 solution for 24 hours to prepare polyether ether ketone-polydopamine-bone forming peptide 1 material. The micromorphology, hydrophilicity, and elemental composition of the material were characterized. Bone marrow mesenchymal stem cells were injected on the surface of polyether ether ketone, polyether ether ketone-polydopamine, and polyether ether ketone-polydopamine-bone forming peptide-1 materials. Cell viability and adhesion status were evaluated by live/dead cell staining and cytoskeleton staining. Cellular osteogenic differentiation ability was detected by alizarin red and osteocalcin immunofluorescence staining. Human umbilical vein endothelial cells were inoculated on the surface of three groups of materials. Cell viability and angiogenesis level were assessed by live/dead cell staining and immunofluorescence staining of cytoskeleton/vascular endothelial growth factor.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under scanning electron microscope, the surface of polyether ether ketone material was smooth; the surface of polyether ether ketone-polydopamine material had uneven deposits, and the surface of polyether ether ketone-polydopamine-bone forming peptide 1 material had small particles protruding. The results of contact angle test showed that the hydrophilicity of polyether ether ketone-polydopamine-bone forming peptide-1 material was better than the other two materials. X-ray photoelectron spectroscopy results showed that bone forming peptide 1 had been successfully modified on the surface of polyether ether ketone material. (2) Live/dead cell staining and cytoskeleton staining exhibited that compared with the other two materials, polyether ether ketone-polydopamine-bone-forming peptide 1 material could improve the viability and adhesion of bone marrow mesenchymal stem cells. Alizarin red and osteocalcin immunofluorescence staining showed that compared with the other two materials, polyether ether ketone-polydopamine-bone forming peptide-1 materials could promote the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. (3) Live/dead cell staining and immunofluorescence staining showed that compared with the other two materials, polyether ether ketone-polydopamine-bone forming peptide 1 material could improve the viability and adhesion of human umbilical vein endothelial cells and the expression of vascular endothelial growth factor protein. (4) The results show that the modification of bone forming peptide 1 and polydopamine composite coating on polyether ether ketone surface can improve the osteogenesis and angiogenesis.

Key words: polyether ether ketone, surface modification, polydopamine, coating, bone forming peptide 1, osteogenic differentiation, angiogenesis

中图分类号:

秦敬杰, 郭子歌, 李睿, 马士卿, 卢瑞杰, 李梦君. 骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层修饰提高聚醚醚酮表面活性[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(16): 3318-3325.

Qin Jingjie, Guo Zige, Li Rui, Ma Shiqing, Lu Ruijie, Li Mengjun. Modification with bone forming peptide 1 and polydopamine coating to improve bioactivity of polyetheretherketone surface[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(16): 3318-3325.

图/表（结果） 9

2.1 各组样品的表面表征
2.1.1 扫描电镜观察各组样品的表面形貌扫描电镜下可见空白组样品表面相对光滑，仅见抛光留下的细小纹理；对照组样品表面呈现出沉积物的块状突起，说明多巴胺牢固聚合于聚醚醚酮表面；实验组样品表面可见均匀散在分布的细小颗粒，见图1。

2.1.2 接触角测试评估各组样品的表面亲水性空白组样品表面的水接触角较大，为(81.6±4.6)°，相对疏水；对照组样品表面的水接触角较空白组减小，为(48.9±5.8)°；实验组样品表面的水接触角进一步减小，为(24.5±4.1)°，见图2。实验组样品表面的水接触角低于对照组和空白组(P < 0.05)，说明骨形成肽1改善了聚醚醚酮材料表面的亲水性。

2.1.3 X射线光电子能谱分析各组样品表面元素组成见图3。空白组样品表面元素为C1s(285.0 eV)和O1s(533.0 eV)，
对照组样品表面出现了N1s(399.8 eV)，实验组样品表面N1s、O1s的峰值明显升高，说明该样品表面N元素和O元素的占比增多，证实了骨形成肽1成功修饰于材料表面。

2.2 各组样品对骨髓间充质干细胞活性与黏附的影响
2.2.1 细胞活性检测结果活死细胞染色结果显示，空白组样品表面活细胞数量较少且分布不均匀，呈团状生长；对照组样品表面活细胞数量有所增加，并开始与周围细胞形成接触；实验组样品表面活细胞数量较多，均匀分布于材料表面并形成广泛的细胞间接触，有良好的细胞活性，见图4。

2.2.2 细胞黏附形态观察结果鬼笔环肽染色结果显示，空白组样品表面的细胞基本呈圆形，肌动蛋白微丝伸展面积小且伪足较少；对照组样品表面的细胞形态开始伸展并伸出伪足；实验组样品表面积的细胞形态以多边形为主，细胞中的肌动蛋白微丝多且明显，并向多个方向伸出伪足与周围细胞形成接触，见图5。

2.3 各组样品表面骨髓间充质干细胞的成骨分化能力 2.3.1 茜素红染色结果茜素红染色结果显示，空白组样品表面基本没有钙结节，对照组样品表面出现一些散在的钙结节，实验组样品表面形成的钙结节数量最多，见图6，说明多肽和聚多巴胺复合涂层修饰的聚醚醚酮表面更能促进骨髓间充质干细胞内基质的矿化。

2.3.2 骨钙素免疫荧光染色分析结果免疫荧光染色显示，空白组样品表面骨钙素表达最弱，实验组样品表面骨钙素表达最强，见图7。结果表明，多肽和聚多巴胺复合涂层修饰的聚醚醚酮表面可促进骨髓间充质干细胞的成骨向分化，这与之前茜素红染色结果一致。

2.4 各组样品对人脐静脉内皮细胞活性、黏附与成血管能力的影响
2.4.1 细胞活性检测结果活死细胞染色结果显示，空白组样品表面活细胞附着较少，细胞呈椭圆形；对照组表面活细胞数量有所增加，开始出现短梭形的细胞；实验组样品表面附着的活细胞数量较多，细胞形态规则呈现扁平长梭形，见图8。

2.4.2 细胞骨架/血管内皮生长因子免疫荧光染色结果细胞骨架染色结果显示，空白组样品表面细胞数量较少且细胞间没有明显的接触；对照组样品表面细胞见肌动蛋白微丝，细胞间有少量的丝状伪足连接；实验组样品表面细胞呈现良好的伸展，细胞内肌动蛋白微丝清晰且密集，细胞间形成紧密的伪足连接，见图9。
血管内皮生长因子是内皮细胞的标志性蛋白，在血管形成中发挥重要的作用。免疫荧光染色结果显示，实验组样品表面呈现出最高的血管内皮生长因子荧光强度，见图9，表明骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层的修饰显著促进了人脐静脉内皮细胞中血管内皮生长因子蛋白的表达，增强了聚醚醚酮材料表面的促成血管作用。

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引言

钛及其合金目前已被广泛用作修复牙列缺损及牙列缺失的种植体材料，但受限于其弹性模量远高于颌骨骨组织，会导致种植体与骨结合界面产生应力遮蔽，进而造成周围骨吸收和植入物的折断[1-2]。有报道指出，与种植体常用的金属合金材料相比，聚醚醚酮拥有与人体皮质骨(7-30 GPa)更为接近的弹性模量(3.0-4.0 GPa)[3]；另外，聚醚醚酮还具有良好的射线透射性、化学稳定性和生物相容性，使其有望作为一种新型的种植修复材料[4-6]。然而，聚醚醚酮材料表面具有生物惰性，与周围骨组织结合能力不强[7]，因此，增强聚醚醚酮的生物活性、提高植入后的成功率成为目前研究的重要方向。
表面改性可以在保持聚醚醚酮机械性能的基础上改善材料表面与周围骨组织的相互作用能力。通过蛋白质或多肽修饰提高材料的生物活性，是目前组织工程研究的热点之一[8-9]。有研究表明，具有生物活性的蛋白质和多肽对材料表面细胞的黏附、增殖和分化均具有促进作用[10-11]。但蛋白质存在免疫原性和易分解的缺点，而多肽片段较易合成、无免疫原性，并且同样具有生物大分子的活性功能。骨形态发生蛋白是转化生长因子β超家族的成员，可以有效发挥骨诱导作用[12-13]。骨形态发生蛋白7是骨形态发生蛋白中的一类，参与调节骨和软骨形成[14]。骨形成肽1作为一条从骨形态发生蛋白7未成熟区域衍生的多肽，其成骨活性和稳定性均更高[15]。已有研究将骨形成肽1应用于组织工程技术或材料表面修饰，发现骨形成肽1具有促进成骨和诱导血管形成的活性[16-17]。
目前可以通过物理吸附和化学偶联等方法将活性多肽引入聚醚醚酮材料表面。物理方法主要是通过非共价键的作用将多肽吸附到材料表面，此方法操作简单，但是由于多肽与材料的结合力较弱导致稳定性及重复性均较差，无法作为一种可靠的改性方法。化学偶联法是在材料表面引入功能基团后以共价键接枝多肽，结合牢固且稳定。前期研究表明，受贻贝黏附蛋白启发制备的聚多巴胺涂层具有高黏附能力，可以应用于多种材料的表面功能化[18-19]。同时，依靠聚多巴胺涂层提供的活性平台，多肽可以通过希夫碱反应或迈克尔加成反应对材料表面进行二次修饰[20]。
此次实验拟在聚醚醚酮表面利用聚多巴胺涂层接枝骨形成肽1，以期提高聚醚醚酮表面的促成骨和成血管作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料合成表征与体外细胞学实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点材料制备于2023年4月在天津医科大学口腔医学院中心实验室完成，材料表征于2023年5-6月在天津医科大学基础医学研究中心完成，细胞实验于2023年7-10月在天津医科大学口腔医学院中心实验室完成。

1.3 材料
1.3.1 主要材料与试剂聚醚醚酮(君华特种工程塑料，中国)；大鼠骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞(普诺赛生命科技有限公司，中国)；丙酮、无水乙醇、盐酸多巴胺、Tris-HCl缓冲液(Solarbio，中国)；骨形成肽1(序列为GQGFSYPYKAVFSTQ，贝斯特比奥生物科技有限公司，中国)；DMEM培养基、0.25%胰酶、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗(Gibco公司，美国)；多聚甲醛、茜素红染液(Solarbio，中国)；地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油、TritonX-100、氯化十六烷基吡啶(Sigma公司，美国)；罗丹明B标记的鬼笔环肽(Sigma-Aldrich公司，美国)；活死细胞染色试剂盒、DAPI染液(碧云天，中国)；牛血清白蛋白溶液(BD Biosciences公司，美国)；骨钙素抗体、血管内皮生长因子抗体、FITC标记的二抗(Abcam公司，英国)。
1.3.2 主要仪器扫描电镜(蔡司Gemini 300，德国)；接触角测定仪(崇达智能科技有限公司，厦门)；X射线光电子能谱仪(Ulvac-Phi公司，日本)；倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)；激光共聚焦显微镜(蔡司LSM900，德国)；紫外分光光度计(Eppendorf公司，德国)。
1.4 方法
1.4.1 聚醚醚酮材料表面改性聚醚醚酮片(10 mm×10 mm×1 mm)经600#、1 000#、1 500#、3 000#、5 000#和10 000#硅砂纸逐级打磨抛光后，依次用丙酮、无水乙醇和去离子水各超声清洗10 min，烘干备用。该样品记为空白组。
将盐酸多巴胺溶解在10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，配制成pH=8.5、质量浓度为2 mg/mL的多巴胺溶液。将空白组样品浸泡在多巴胺溶液中，然后置于37 ℃恒温摇床(振荡频率100 r/min)中避光反应24 h。取出样品，用去离子水冲洗去除材料表面残留的多巴胺，烘干备用。该样品记为对照组。
将5 mg骨形成肽1充分溶解于10 mL去离子水中，配成质量浓度0.5 mg/mL的骨形成肽1溶液。将对照组样品浸泡在骨形成肽1溶液中，置于4 ℃冰箱中静置反应24 h。取出样品，用去离子水冲洗去除材料表面残留的多肽，晾干备用。该样品记为实验组。
1.4.2 聚醚醚酮改性材料的表征
扫描电镜观察：将3组样品表面进行1 min的喷金处理，在扫描电镜下观察样品表面的微观形貌。
水接触角测试：用接触角测量仪检测3组样品对去离子水的水接触角，评估样品表面的亲水性。每个样品取3个不同部位进行测量，取平均值为待测样品的水接触角。
X射线光电子能谱检测：用X射线光电子能谱仪对3种样品表面的元素组成进行检测，以验证多肽是否成功结合于材料表面。
1.4.3 细胞培养将大鼠骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞接种于培养皿内，加入含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基(基础培养基)，置于体积分数5%CO2恒温湿润培养箱中培养。当细胞融合至培养皿底面积的80%-90%时，用0.25%胰酶溶液进行消化传代。选用第3代后的细胞进行计数和接种。
1.4.4 各组样品对骨髓间充质干细胞活性、黏附与成骨能力的影响
细胞活性检测：活死细胞染色实验是一种分析细胞活性和材料毒性的简便方法，灵敏度高且对细胞无损伤。将3组样品分别置于24孔板底部，随后将骨髓间充质干细胞接种于样品表面，细胞密度1×104/孔，置于体积分数5%CO2恒温湿润培养箱内培养。培养3 d后，使用活死细胞染色试剂盒进行细胞活性染色，倒置荧光显微镜下观察并拍照。
细胞黏附形态观察：将3组样品分别置于24孔板底部，随后将骨髓间充质干细胞接种于样品表面，细胞密度1×104/孔，置于体积分数5%CO2恒温湿润培养箱内培养。培养3 d后，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.1%TritonX-100溶液透化处理5 min，用PBS清洗3次；避光条件下加入200 μL罗丹明B标记的鬼笔环肽溶液室温孵育30 min，加入DAPI溶液染色10 min，用PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜下观察细胞伸展及黏附情况。
茜素红染色：将3组样品分别置于24孔板底部，随后将骨髓间充质干细胞接种于样品表面，细胞密度1×104/孔，置于体积分数5%CO2恒温湿润培养箱内培养。培养3 d后，将原培养基更换为成骨诱导培养基(基础培养基中加入100 mmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和
50 µmol/L抗坏血酸)。诱导培养21 d后，用PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，加入茜素红染液染色10 min，用PBS清洗去掉多余染液，倒置显微镜下观察并拍照；另外，加入10%氯化十六烷基吡啶溶解钙结节，取上清，使用紫外分光光度计测定样品在562 nm波长处的吸光度值。
骨钙素免疫荧光染色：将3组样品分别置于24孔板底部，随后将骨髓间充质干细胞接种于样品表面，细胞密度1×104/孔，置于体积分数5%CO2恒温湿润培养箱内培养。培养3 d后，将原培养基更换为成骨诱导培养基。诱导培养7 d后，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.1%TritonX-100透化5 min，用PBS清洗3次；加入3%牛血清白蛋白溶液37 ℃下封闭1 h，以阻断非特异性结合；加入骨钙素一抗(1∶200稀释)4 ℃下孵育过夜，用PBS清洗3次，加入荧光二抗(1∶200稀释)室温孵育1 h，加入DAPI染液染色10 min，激光共聚焦显微镜下观察细胞内的染色信号，使用Image J软件检测相应蛋白的荧光强度。
1.4.5 各组样品对人脐静脉内皮细胞活性、黏附与促成血管能力的影响
细胞活性检测：将3组样品分别置于24孔板底部，随后将人脐静脉内皮细胞接种于样品表面，细胞密度1.5×104/孔，置于体积分数5%CO2恒温湿润培养箱内培养。培养1 d后，使用活死细胞染色试剂盒进行细胞活性染色，倒置荧光显微镜下观察并拍照。
细胞骨架/血管内皮生长因子免疫荧光染色：将3组样品分别置于24孔板底部，随后将人脐静脉内皮细胞接种于样品表面，细胞密度1.5×104/孔，置于体积分数5%CO2恒温湿润培养箱内培养。培养3 d后，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.1%TritonX-100透化5 min，用PBS清洗3次；加入3%牛血清白蛋白溶液37 ℃下封闭1 h；加入血管内皮生长因子一抗(1∶200稀释)4 ℃下孵育过夜，用PBS清洗3次，加入荧光二抗(1∶200稀释)室温孵育1 h，PBS清洗3次；加入200 μL罗丹明B标记的鬼笔环肽溶液室温孵育30 min，加入DAPI染液染色10 min，激光共聚焦显微镜下观察细胞内的染色信号，使用Image J软件检测相应蛋白的荧光强度。
1.5 主要观察指标各组样品的表面形貌、亲水性及元素组成，各组样品表面骨髓间充质干细胞的活性、黏附及成骨分化能力，各组样品表面人脐静脉内皮细胞的活性、黏附及成血管能力。
1.6 统计学分析采用Graph Pad Prism 9统计分析软件对所得数据进行分析，定量结果均以x±s来表示。组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05时认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经天津医科大学生物统计学专家审核。

讨论

理想的植入物材料除了要具备优异的机械性能外，还需要具有良好的生物活性，以促进植入物与周围骨组织形成稳固的结合[21-23]。近年来，口腔种植领域最常用的植入物材料是以钛及钛合金为主的医用金属，然而经过临床长期观察发现，钛植入物与骨组织弹性模量的不匹配会导致周围骨吸收，而且钛长期磨损和腐蚀产生的金属离子容易引起周围组织炎症，影响植入物的长期效果[24]。聚醚醚酮高分子材料的发展为植入物材料的选择提供了新的方向。与钛及钛合金相比，聚醚醚酮与骨组织的弹性模量更加接近，具有射线可穿透性和化学稳定性，因而成为一种有潜力的替代植入材料[25]。但是，聚醚醚酮具有的生物惰性会影响其植入后的骨整合效果。此次实验旨在通过表面的功能化修饰探索出一种简单且高效的提高聚醚醚酮表面活性的方法，从而为聚醚醚酮植入物在口腔种植领域的应用提供理论基础。
由于聚醚醚酮的化学稳定性，物理吸附很难有效发挥作用，因此通过化学接枝将生物活性分子共价偶联到聚醚醚酮表面是一种可行的方法。聚多巴胺涂层是由多巴胺在碱性环境中自聚合形成的，具有类似贻贝黏附蛋白的特性，可以黏附在各种材料表面[20，26]。同时，聚多巴胺涂层中含有大量的邻苯二酚基团，这些基团易被氧化为醌基，进而与多肽基团发生席夫碱反应或者通过苯环上的碳发生迈克尔加成反应，形成牢固稳定的化学结合[27-28]。WANG等[29]通过聚多巴胺涂层将DJK-5肽共价固定在多孔钛合金上，赋予材料表面抗菌和抗炎等功能特性。YANG等[30]通过聚多巴胺涂层沉积和离子溶液浸泡的方法，赋予了聚醚醚酮材料表面多种生物活性。因此，为了获得具有表面生物活性的聚醚醚酮材料，此次实验针对其表面改性提出了实验构想：首先制备聚多巴胺涂层以获得功能化的表面，接着骨形成肽1可以借助聚多巴胺反应位点进行二次修饰，从而作用于周围的细胞和组织发挥促成骨和成血管作用。通过扫描电镜对制备的聚醚醚酮改性材料进行观察，未改性的聚醚醚酮表有明显的打磨痕迹，多巴胺聚合后可见块状的沉积物，接枝骨形成肽1后表面呈现均匀分布的小颗粒。X射线光电子能谱图显示，聚多巴胺涂层修饰的聚醚醚酮表面出现了N1s峰，这是由于引入了较多的氨基[31]，而实验组N1s和O1s峰值明显增加，是由于接枝多肽后又引入了较多的肽键及氨基[32]，这些结果从元素组成的角度证实了多肽的成功修饰。材料表面的亲水性同样显著影响细胞的生物学行为。研究表明，高亲水性的材料会促进周围细胞中多种蛋白质的吸附，进而影响细胞在材料表面的黏附[33-34]。由于多肽是一种亲水性的物质，因此与其他组相比，实验组材料表面的水接触角较小，亲水性显著改善。
骨形成肽1作为来源于骨形态发生蛋白7未成熟区的一个多肽序列，能促进骨髓间充质干细胞的成骨向分化，同时还能上调内皮细胞中血管内皮生长因子受体的表达[35]，因此，接下来通过体外骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞实验研究聚醚醚酮改性材料的生物活性。骨髓间充质干细胞活死染色及骨架染色结果显示，未经修饰的聚醚醚酮表面细胞伸展较差；聚多巴胺修饰后聚醚醚酮材料表面细胞形态更为伸展并伸出少量丝状伪足与周围细胞连接；而多肽修饰后聚醚醚酮材料表面细胞层层堆叠，伸出大量丝状伪足且细胞呈扁平多角形，说明骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层能促进聚醚醚酮材料表面骨髓间充质干细胞的黏附和伸展，呈现出良好的生物相容性。细胞行为受其微环境中细胞密度和细胞间接触的影响，因此骨髓间充质干细胞的大量黏附不仅促进了细胞的存活和增殖，同时也为进一步的成骨分化奠定基础[36]。茜素红染色是评估成骨分化水平的一个重要指标，其表达强度可以在一定程度上反映骨髓间充质干细胞的骨矿化能力[37]。此次实验茜素红染色结果显示，未改性聚醚醚铜组表面基本没有钙结节，而聚多巴胺与骨形成肽1复合涂层改性聚醚醚酮组表面钙盐沉积数量最多。对细胞中成骨相关蛋白骨钙素的表达进行免疫荧光染色，结果也呈现出一致的趋势，骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层改性聚醚醚酮组荧光强度最高，证明骨形成肽1能有效促进聚醚醚酮材料表面骨髓间充质干细胞的成骨分化。
针对骨形成肽1促进血管形成的研究较少。WANG等[17]构建了负载内皮祖细胞和骨形成肽1的磷酸三钙支架并将其植入到兔股骨中，结果证明内皮祖细胞与骨形成肽1能协同促进骨的血管化。此实验对聚醚醚酮改性材料体外促成血管活性进行了初步探索，人脐静脉内皮细胞活死染色结果表明，多肽和聚多巴胺复合涂层修饰的聚醚醚酮表面细胞活性增加，改善了聚醚醚酮材料的生物相容性。血管内皮细胞分泌的血管内皮生长因子蛋白在血管生成过程中发挥重要作用[38]，许多研究通过血管内皮生长因子基因和蛋白的表达水平来评估成血管能力[39-40]。此次实验通过免疫荧光染色观察到多肽和聚多巴胺复合涂层聚醚醚酮组的细胞骨架形态最伸展并形成细胞间接触，细胞中血管内皮生长因子蛋白的表达也最多，证明成血管活性最强，因此改性后的聚醚醚酮材料具有良好的促成血管活性。
综上所述，实验构建了一种骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层修饰的聚醚醚酮材料，该改性材料具有良好的生物相容性、优异的促成骨能力和成血管活性，为克服聚醚醚酮材料表面生物惰性提供一个新的思路。当然，该实验目前还存在着一些不足，例如聚醚醚酮改性材料促成骨和成血管作用的具体机制还需要深入研究，同时还要进一步验证聚醚醚酮改性材料在体内的骨整合能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

骨形成肽1和聚多巴胺复合涂层修饰提高聚醚醚酮表面活性

Modification with bone forming peptide 1 and polydopamine coating to improve bioactivity of polyetheretherketone surface

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