雌激素受体在骨疏康治疗绝经后骨质疏松症中的作用与机制

doi:10.12307/2024.298

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (16): 2574-2578.doi: 10.12307/2024.298

• 组织构建相关数据分析 Date analysis of organization construction • 上一篇下一篇

雌激素受体在骨疏康治疗绝经后骨质疏松症中的作用与机制

柴爽，马江涛，杨岩冰，苏晓川，谢艳，滕军燕，秦娜

河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省郑州市 450016

收稿日期:2023-03-17 接受日期:2023-04-15 出版日期:2024-06-08 发布日期:2023-07-31
通讯作者: 秦娜，药学博士，主任药师，河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省郑州市 450016
作者简介:柴爽，女，1989年生，河南省新乡市人，2019年广州中医药大学毕业，博士，主治医师，主要从事中医药防治骨质疏松研究。
基金资助:
河南省自然科学基金青年科学基金项目(202300410555)，项目负责人：柴爽；河南省自然科学基金青年科学基金项目(222300420198)，项目负责人：马江涛；国家自然科学基金面上项目(82174413)，项目负责人：秦娜；项目参与人：柴爽

The role and mechanism of estrogen receptor in the treatment of postmenopausal osteoporosis by Gushukang

Chai Shuang, Ma Jiangtao, Yang Yanbing, Su Xiaochuan, Xie Yan, Teng Junyan, Qin Na

Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital of Henan Province (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Zhengzhou 450016, Henan Province, China

Received:2023-03-17 Accepted:2023-04-15 Online:2024-06-08 Published:2023-07-31
Contact: Qin Na, PharmD, Chief pharmacist, Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital of Henan Province (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Zhengzhou 450016, Henan Province, China
About author:Chai Shuang, MD, Attending physician, Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital of Henan Province/Henan Provincial Orthopedic Hospital, Zhengzhou 450016, Henan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Henan Province (Youth Science Foundation Project), Nos. 202300410555 (to CS) and 222300420198 (to MJT); National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82174413 (to QN and CS [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨疏康：由淫羊藿、骨碎补、熟地黄、黄芪、丹参、木耳和黄瓜子共7种中药配伍而成，具有补肾益气、活血壮骨之功效，被收录于《中国药典》2015年版，被绝经后骨质疏松症(骨痿)中医药诊疗指南(2019年版)推荐用于绝经后骨质疏松症肾虚血瘀证。
雌激素受体：是一种配体依赖的转录因子，属于类固醇激素受体家族。研究表明雌激素受体表达水平在骨骼生长和维持骨量方面起重要作用。雌激素受体α和雌激素受体β是经典的核受体蛋白，与雌激素结合后被激活并发生构象改变，调控特异性靶基因转录发挥骨保护作用。

背景：骨疏康作为治疗绝经后骨质疏松症肾虚血瘀证的中成药，其具体作用机制需深入研究。

目的：研究骨疏康对去卵巢大鼠血清雌激素、骨微结构和雌激素受体的影响。
方法：首先进行网络药理学分析，分别获取骨疏康有效成分、作用靶点和绝经后骨质疏松症的靶点，利用Cytoscape构建骨疏康有效成分-靶点网络，利用STRING 数据库和Cytoscape进行蛋白互作分析(PPI)及核心靶点的筛选，利用DAVID数据库对交集靶点进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。然后建立去卵巢SD大鼠动物模型，骨疏康灌胃3个月，ELISA检测血清雌激素水平，microCT检测骨微结构，Western blot检测骨组织雌激素受体ERα和ERβ蛋白表达。

结果与结论：①网络药理学分析显示，骨疏康中共有132个有效成分，150个作用靶点，与1 155个绝经后骨质疏松症靶点取交集，获得87个骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的作用靶点。②构建骨疏康有效成分-靶点网络图发现处于核心位置的有效成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素和异鼠李素，处于核心位置的靶点有NCOA2，ESR2，AR，F2，ESR1，PTGS1。③PPI分析及筛选后最终获得的靶点有MAPK8，ESR1，JUN，R3C1，RELA和FOS，其中ESR1为两次分析获得的共同核心靶点。④随后的KEGG富集分析显示雌激素、TNF、凋亡等信号通路，因此动物实验重点关注骨疏康对雌激素信号通路中不同亚型的雌激素受体的影响。⑤动物实结果显示，骨疏康组骨微结构明显改善，血清雌激素无明显变化，但骨组织中ERα和ERβ蛋白量明显升高，说明骨疏康治疗绝经后骨质疏松症可能与其雌激素样作用和提高雌激素受体蛋白的表达有关。

https://orcid.org/0000-0002-4675-3193(柴爽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨疏康, 绝经后骨质疏松症, 雌激素受体α, 雌激素受体β, 雌激素信号通路, 网络药理学, 中医药

Abstract: BACKGROUND: The specific mechanism of Gushukang, as a Chinese traditional patent medicine for the treatment of postmenopausal osteoporosis of kidney deficiency and blood stasis, needs further studies.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Gushukang on serum sex hormones, bone microstructure and estrogen receptor in postmenopausal osteoporosis.
METHODS: Firstly, network pharmacological analysis was performed. The active ingredients and action targets of Gushukang and the targets of postmenopausal osteoporosis were obtained respectively. Cytoscape was used to construct the active ingredient - target network. STRING database and Cytoscape were used for protein-protein interaction analysis and screening of core targets. DAVID database was used for Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses of intersection targets. Then the ovariectomized Sprague-Dawley rats were used in the animal experiment. Gushukang was administered by gavage for 3 months. The serum estrogen level was detected by ELISA, the bone microstructure was detected by microCT, and the protein expression of estrogen receptor α and estrogen receptor β in bone tiusse was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The network pharmacological research results identified 132 active ingredients and 150 targets of Gushukang and 1155 targets of postmenopausal osteoporosis. After intersections with 1155 postmenopausal osteoporosis targets, 87 targets of active ingredients of Gushukang against postmenopausal osteoporosis were obtained. By constructing the active ingredient - target network, it was found that the active ingredients at the core were quercetin, kaempferol, luteolin, naringin and isorhamnetin, and the targets at the core were NCOA2, ESR2, AR, F2, ESR1 and PTGS1. The final targets obtained after the protein-protein interaction analysis and screening included MAPK8, ESR1, JUN, R3C1, RELA and FOS, of which ESR1 was the common core target obtained from the two analyses. KEGG enrichment analysis showed estrogen, tumor necrosis factor, apoptosis and other signaling pathways. Therefore, animal experiments focused on the effect of Gushukang on different subtypes of estrogen receptors in the estrogen signaling pathway. The results showed that in the Gushukang group, bone microstructure was significantly improved, serum estrogen level had no significant change, but the protein expression of estrogen receptor α and β in bone tissue was significantly increased. All the findings indicate that the mechanism of Gushukang in the treatment of postmenopausal osteoporosis may be related to its hormone-like effect and the enhancement of estrogen receptor expression.

Key words: Gushukang, postmenopausal osteoporosis, estrogen receptor α, estrogen receptor β, estrogen signaling pathway, network pharmacology, traditional Chinese medicine

中图分类号:

柴爽, 马江涛, 杨岩冰, 苏晓川, 谢艳, 滕军燕, 秦娜. 雌激素受体在骨疏康治疗绝经后骨质疏松症中的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2574-2578.

Chai Shuang, Ma Jiangtao, Yang Yanbing, Su Xiaochuan, Xie Yan, Teng Junyan, Qin Na. The role and mechanism of estrogen receptor in the treatment of postmenopausal osteoporosis by Gushukang[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(16): 2574-2578.

图/表（结果） 7

2.1 骨疏康和绝经后骨质疏松症共同靶点利用各数据库收集筛选共获得骨疏康有效成分132种，其中淫羊藿23种、骨碎补18种、熟地黄2种、黄芪20种、丹参65种、木耳1种和黄瓜子3种；初步获得有效成分对应的靶点1 155个。删除UniProt数据库中无法查询到对应基因的和重复数据后，共获得150个靶点。利用GeneCards，OMIM，PharmGkb，TTD数据库共获得绝经后骨质疏松症疾病靶点1 155个(图1A)。采用Venny 2.1.0筛选骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的靶点87个(图1B)。

2.2 骨疏康有效成分-靶点网络图将前一步获得的87个骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的靶点及对应的有效成分导入Cytoscape软件(V3.7.1)构建骨疏康有效成分-靶点网络图，如图2所示，网络图共包含186个点，579个边，处于核心的有效成分有MOL000098(quercetin，槲皮素)，MOL000422(kaempferol，山柰酚)，MOL00006(luteolin，木犀草素)，MOL004328(naringenin，柚皮素)，MOL00354(isorhamnetin，异鼠李素)，分别与51，25，21，14，14个靶点相连。在所有成分中，MOL000449(Stigmasterol)、MOL000359(sitosterol)、山柰酚、槲皮素、MOL001771(poriferast-5-en-3beta-ol)、MOL000569(digallate)、木犀草素为两味及两味以上中药的共有成分，靶点NCOA2，ESR2，AR，F2，ESR1，PTGS1与多种有效成分相连(图中较大的蓝色方形)，可能是骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的核心靶点。

2.3 PPI网络图及核心靶点筛选然后，进一步分析87个靶点之间的关系。首先利用STRING数据库构建PPI网络图(图3A)。然后，将PPI网络导入Cystoscap 3.7.1中进行拓扑分析，以点度中心性、中介中心性、接近中心性、特征向量中心性、局部边连通性、网络中心性大于中位数进行2次筛选，最终获得MAPK8，ESR1，JUN，R3C1，RELA和FOS共6个核心靶点，14种相互作用关系(图3B)。

2.4 基因功能和信号通路富集分析结果对87个靶点进行富集分析，共富集获得GO条目1 797个，其中细胞组分(cellular component，CC)61个，分子功能(molecular function，MF)107个，和生物学过程(biological process，BP)1 629个。图4显示了各条目前10位，BP主要富集在对类固醇激素的反应、对抗生素的反应，CC主要富集在膜筏、膜微区、膜区等；MF主要富集在DNA 结合转录激活因子活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性、泛素蛋白连接酶结合和核受体活性。KEGG富集分析共获得134条信号通路，排除明显不相关的疾病途径，如化学致癌-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化等，发现骨疏康可能通过雌激素、TNF、凋亡、内分泌抵抗、IL-17、甲状腺激素、甲状旁腺激素的合成、分泌和作用和P53信号通路治疗绝经后骨质疏松症(图5)。

2.5 骨疏康对动物模型中的雌激素水平、骨微结构的影响为了验证骨疏康对动物模型中的雌激素水平、骨微结构的影响，采用ELISA检测各组血清中雌激素水平，采用micro-CT扫描各组股骨远端。结果如图6所示，与假手术组相比，模型组大鼠雌激素水平和骨体积分数、骨表面积和体积比、骨小梁厚度和骨小梁数量显著下降(P < 0.05)，骨小梁分离度升高(P < 0.05)，两种药物治疗均可以明显改善骨微结构参数(P < 0.05)。戊酸雌二醇组血清雌激素水平明显升高(P < 0.05)，骨疏康组血清雌激素水平有所升高，但与模型组比差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 骨疏康对雌激素信号通路的影响网络药理学分析结果表明，骨疏康可以调节雌激素信号通路。因此，进一步探讨了骨疏康对雌激素信号通路的影响，以戊酸雌二醇为阳性对照，采用Western blot检测ERα和ERβ的表达，结果如图7所示，模型组ERα和ERβ水平均低于假手术组(P < 0.05)；骨疏康组和戊酸雌二醇组ERα和ERβ水平高于模型组(P < 0.05)。

参考文献

[1] GKASTARIS K, GOULIS DG, POTOUPNIS M, et al. Obesity, osteoporosis and bone metabolism. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2020;20(3):372-381.
[2] SLUPSKI W, JAWIEN P, NOWAK B. Botanicals in Postmenopausal Osteoporosis. Nutrients. 2021;13(5):1609.
[3] 中华中医药学会.绝经后骨质疏松症(骨痿)中医药诊疗指南(2019年版)[J].中医正骨,2020,32(2):1-13.
[4] 侍方,李欣,张蕊.骨疏康胶囊联合鲑鱼降钙素、戊酸雌二醇对绝经后骨质疏松患者的临床疗效[J].中成药,2020,42(12):3188-3192.
[5] CHAI S, WAN L, WANG JL, et al. Gushukang inhibits osteocyte apoptosis and enhances BMP-2/Smads signaling pathway in ovariectomized rats. Phytomedicine. 2019;64:153063.
[6] THOMPSON DD, SIMMONS HA, PIRIE CM, et al. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 1995;17(S4):125S-133S．
[7] LI XL, WANG L, BI XL, et al. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating vitamin D and calcium metabolism in ovariectomized mice. J Bone Miner Metab. 2019;37(2):224-234.
[8] 杨骏杰,赵永见,王强,等.骨疏康颗粒对去卵巢小鼠体重、血清骨代谢指标和组织形态学的影响[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(9):1212-1216.
[9] 郑志坚,舒冰,赵世天,等.骨疏康颗粒对去卵巢小鼠骨质疏松模型骨丢失和破骨细胞凋亡的影响[J].中华中医药杂志,2020,35(7):3647-3651.
[10] GE YW, FENG K, LIU XL, et al. Quercetin inhibits macrophage polarization through the p-38alpha/beta signalling pathway and regulates OPG/RANKL balance in a mouse skull model. J Cell Mol Med. 2020;24(5):3203-3216.
[11] VAKILI S, ZAL F, MOSTAFAVI-POUR Z, et al. Quercetin and vitamin E alleviate ovariectomy-induced osteoporosis by modulating autophagy and apoptosis in rat bone cells. J Cell Physiol. 2021;236(5):3495-3509.
[12] HUANG YY, WANG ZH, DENG LH, et al. Oral Administration of Quercetin or Its Derivatives Inhibit Bone Loss in Animal Model of Osteoporosis. Oxid Med Cell Longev. 2020;2020:6080597.
[13] SONG JE, TIAN J, KOOK YJ, et al. A BMSCs-laden quercetin/duck’s feet collagen/hydroxyapatite sponge for enhanced bone regeneration. J Biomed Mater Res A. 2020;108(3):784-794.
[14] LI X, JIANG Q, WANG T, et al. Comparison of the Antioxidant Effects of Quercitrin and Isoquercitrin: Understanding the Role of the 6’’-OH Group. Molecules. 2016;21(9):1246.
[15] CORDOBA A, MANZANARO-MORENO N, COLOM C, et al. Quercitrin Nanocoated Implant Surfaces Reduce Osteoclast Activity In Vitro and In Vivo. Int J Mol Sci. 2018;19(11):3319.
[16] WONG SK, CHIN KY, IMA-NIRWANA S. Quercetin as an Agent for Protecting the Bone: A Review of the Current Evidence. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6448.
[17] YANG L, TAKAI H, UTSUNOMIYA T, et al. Kaempferol stimulates bone sialoprotein gene transcription and new bone formation. J Cell Biochem. 2010;110(6):1342-1355.
[18] LIU H, YI X, TU S, et al. Kaempferol promotes BMSC osteogenic differentiation and improves osteoporosis by downregulating miR-10a-3p and upregulating CXCL12. Mol Cell Endocrinol. 2021;520:111074.
[19] XIE B, ZENG Z, LIAO S, et al. Kaempferol Ameliorates the Inhibitory Activity of Dexamethasone in the Osteogenesis of MC3T3-E1 Cells by JNK and p38-MAPK Pathways. Front Pharmacol. 2021;12:739326.
[20] ADHIKARY S, CHOUDHARY D, AHMAD N, et al. Dietary flavonoid kaempferol inhibits glucocorticoid-induced bone loss by promoting osteoblast survival. Nutrition. 2018;53:64-76.
[21] LIANG G, ZHAO J, DOU Y, et al. Mechanism and Experimental Verification of Luteolin for the Treatment of Osteoporosis Based on Network Pharmacology. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:866641.
[22] JING Z, WANG C, YANG Q, et al. Luteolin attenuates glucocorticoid-induced osteoporosis by regulating ERK/Lrp-5/GSK-3beta signaling pathway in vivo and in vitro. J Cell Physiol. 2019;234(4):4472-4490.
[23] ORSOLIC N, NEMRAVA J, JELEC Z, et al. Antioxidative and Anti-Inflammatory Activities of Chrysin and Naringenin in a Drug-Induced Bone Loss Model in Rats. Int J Mol Sci. 2022;23(5):2872.
[24] EASTELL R, O’NEILL TW, HOFBAUER LC, et al. Postmenopausal osteoporosis. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16069.
[25] ABU-AMER Y. NF-kappaB signaling and bone resorption. Osteoporos Int. 2013;24(9):2377-2386.
[26] CHENG CH, CHEN LR, CHEN KH. Osteoporosis Due to Hormone Imbalance: An Overview of the Effects of Estrogen Deficiency and Glucocorticoid Overuse on Bone Turnover. Int J Mol Sci. 2022;23(3):1376.
[27] SHARMA AR, NAM JS. Kaempferol stimulates WNT/beta-catenin signaling pathway to induce differentiation of osteoblasts. J Nutr Biochem. 2019; 74:108228.
[28] WU W, FU J, GU Y, et al. JAK2/STAT3 regulates estrogen-related senescence of bone marrow stem cells. J Endocrinol. 2020;245(1):141-153.
[29] WANG Z, BAO HW, XU YJ. Cnidium lactone prevents bone loss in an ovariectomized rat model through the estrogen-alpha/BMP-2/Smad signaling pathway. J Gene Med. 2020;22(8):e3198.
[30] LIU Y, WANG X, CHANG H, et al. Mongolian Medicine echinops prevented postmenopausal osteoporosis and induced ER/AKT/ERK pathway in BMSCs. Biosci Trends. 2018;12(3):275-281.
[31] 李晓曦,陈宇恒,唐秀凤,等.基于雌激素作用的淫羊藿女贞子配伍对绝经后骨质疏松症大鼠的影响研究[J].中国中医骨伤科杂志,2019,27(9): 1-6.
[32] 张则业,杨佳迪,颜倩,等.基于网络药理学结合体内实验研究探讨四物汤的植物雌激素样效应及其分子机制[J].中国中药杂志,2022,47(10): 2750-2758.
[33] WANG T, WANG Y, ZHUANG X, et al. Interaction of Coumarin Phytoestrogens with ERalpha and ERbeta: A Molecular Dynamics Simulation Study. Molecules. 2020;25(5):1165.

引言

材料方法

1.1 网络药理学分析
1.1.1 分别获取骨疏康有效成分、潜在靶点及绝经后骨质疏松症靶基因利用TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/tcmsp.ph)，BATAMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，分别检索骨疏康所包含的7味中药淫羊藿、骨碎补、熟地黄、黄芪、丹参、木耳和黄瓜子的成分，骨疏康为口服药物，因此在TCMSP数据库中采用口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug likeness，DL)筛选有效成分，设置口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18为筛选标准，在BATAMAN-TCM数据库中设置评分≥80为筛选标准，综合获取各味中药的有效成分和靶点。
利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，OMIM数据库(https://omim.org/)，PharmGkb数据库(https://www.pharmgkb.org/)，TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)，以“Postmenopausal Osteoporosis”“Osteoporosis，Postmenopausal”为检索词，检索各数据库中绝经后骨质疏松症的靶基因。
1.1.2 骨疏康有效成分-靶点网络图构建利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)，将物种限定为“Human”。检索骨疏康有效成分潜在靶点和绝经后骨质疏松症靶基因对应的官方名称，进行统一化处理，然后采用Venny 2.1.0筛选骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的靶点。利用Cytoscape软件(V3.7.1)构建骨疏康有效成分-靶点网络图。
1.1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建及核心靶点的筛选将骨疏康和绝经后骨质疏松症的共同靶点导入STRING在线数据库(https://string-db.org)用于PPI分析。数据库中的物种被设置为“Homo sapiens”，筛选置信度为≥0.90，得到PPI网络图。然后，将PPI网络导入Cystoscap 3.7.1中，通过NetworkAnalyzer，CytoNCA工具进行拓扑分析以筛选关键靶点。以点度中心性、中介中心性、接近中心性、特征向量中心性、局部边连通性、网络中心性大于中位数为筛选条件进行2次筛选，获得核心靶点。
1.1.4 基因功能和信号通路富集分析将骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的靶点上传到DAVID数据分析平台进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析，设置物种为“Homo sapiens”。设定P < 0.05的条目为显著富集。
1.2 动物实验验证
1.2.1 实验动物、药物与试剂 SPF级3月龄雌性SD大鼠32只，体质量180-230 g，购自河南省实验动物中心，合格证号SCXK(豫)2017-0001。所有实验方案均经河南省洛阳正骨医院动物实验伦理委员会批准(批准号：KY2021-003-01)。
骨疏康胶囊(辽宁康辰药业有限公司，国药准字Z20060270)，戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司，国药准字J20171038)，Western及IP裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(CW0014S)购自康为世纪生物科技有限公司，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、电泳液、转膜液及大鼠雌激素检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。抗ERα抗体(21244-1-AP)、ERβ(BS-0116R)、GAPDH(10494-1-AP)、羊抗兔二抗(SA00001-2-500)、羊抗鼠二抗(SA00001-1-500)均购自武汉三鹰生物技术有限公司。
1.2.2 动物分组与给药适应性饲养1周后，将32只大鼠随机分为假手术组、模型组、骨疏康组和戊酸雌二醇组，每组8只。模型组、骨疏康组和戊酸雌二醇组采用摘除双侧卵巢法进行造模[6]，假手术组同样采取背侧入路，但是仅切除卵巢周围等体积大小脂肪，术后给予一次肌肉注射苄星青霉素(200 U/g)预防感染，术后1个月开始灌胃给药。给药剂量按照人与大鼠体表面积折算，骨疏康组给药剂量为0.27 g/kg，戊酸雌二醇组给药剂量为0.104 mg/kg，其他组给予等体积生理盐水，1次/d，连续灌胃3个月。给药结束后采用3%戊巴比妥(1.5 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，然后采集标本进行指标检测。
1.2.3 骨疏康对去卵巢大鼠血清雌激素水平的影响各组大鼠腹主动脉采血，4 ℃静置2 h，然后3 000 r/min，4 ℃离心15 min，获得上层血清，按照大鼠雌激素检测试剂盒说明书检测血清雌激素水平。
1.2.4 骨疏康对去卵巢大鼠骨微结构的影响分离获取双侧股骨，将附着的肌肉、肌腱等组织完全剔除，左侧股骨用液氮保存备用，右侧股骨进行microCT扫描，扫描部位：股骨远端，感兴趣区：以股骨远端生长板为参考，选取近端1 mm范围的松质骨；扫描条件：55 kV，145 mA。使用自带软件分析骨体积分数(bone volume/total volume，BV/TV)、骨表面积和体积比(bone surface/total volume，BS/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)和骨小梁分离度(trabecular separation，Tb.Sp)，然后进行三维图像重建。
1.2.5 骨疏康对去卵巢大鼠骨组织雌激素信号通路的影响 Western blot法检测ERα，ERβ蛋白表达。取去卵巢大鼠左侧股骨，咬骨钳剪取约150 mg骨组织，液氮研磨至粉状，加入裂解液进行裂解，离心获取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度后制备蛋白样品。然后进行 SDS-PAGE凝胶电泳及转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，洗膜后4 ℃孵育ERα，ERβ和GAPDH抗体(1∶1 000稀释)过夜，洗膜3次后室温孵育二抗1 h，洗膜3次后显影，采用Image J软件分析条带的灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。
1.2.6 统计学分析实验结果采用SPSS 20.0统计分析软件，计量资料采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验，以P < 0.05 为差异有显著性意义。

讨论

既往研究表明，骨疏康可以通过调节血清骨代谢指标、促进破骨细胞凋亡来治疗骨质疏松症[5，7-9]。但中药复方成分复杂，作用靶点众多，难以一次研究清楚作用机制。此次研究结合网络药理学和实验验证，探讨骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的机制。
通过网络药理学对骨疏康和疾病相关靶点的预测，构建骨疏康有效成分-靶点网络图，分析发现槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、异鼠李素为关键成分，这5种关键成分均为植物类黄酮，槲皮素可能通过调节Wnt、NF-κB、Nrf2以及内源性和外源性凋亡途径，抑制RANKL介导的破骨细胞生成[10]、成骨细胞凋亡[11]、氧化应激和炎症反应[12]，同时促进成骨[13]、血管生成、抗氧化表达和破骨细胞凋亡[14-15]，对骨骼产生积极影响[16]。山柰酚在新生大鼠[17]、卵巢切除诱导和糖皮质激素诱导的骨质疏松模型以及骨折模型中均显示出保骨作用[18-20]。木犀草素可通过 PI3K/Akt信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，减少骨质疏松大鼠的骨丢失[21]，通过ERK/Lrp-5/GSK-3β通路促进成骨细胞分化治疗激素性骨质疏松症[22]。柚皮素则通过抗氧化、抗炎和植物雌激素活性作用改善药物诱导的继发性骨质疏松症[23]。此外，分析网络图还发现靶点NCOA2，ESR2，AR，F2，ESR1，PTGS1与骨疏康的多种有效成分相连，可能是骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的核心靶点，表明骨疏康的治疗作用通过多成分、多靶点协同实现。
然后，对筛选的87个骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的靶点进行了PPI网络构建和拓扑分析，发现了MAPK8，ESR1，JUN，R3C1，RELA和FOS共6个核心靶点。两次分析处理获得的核心靶点中，ESR1为共同靶点，这引起了作者的关注。ESR1基因编码ERα，是雌激素受体的一种亚型。雌激素受体在成骨细胞、破骨细胞和骨细胞中高度表达，对骨骼具有保护作用。雌激素受体调节编码白细胞介素1、胰岛素样生长因子1和转化生长因子β等蛋白质的雌激素靶基因的表达[24]；还可以抑制核因子κB配体(RANKL)的作用，从而抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性[25]。绝经后雌激素缺乏会改变雌激素靶基因的表达，增加白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子的分泌[23]，造成骨转换增加和骨吸收增强，从而导致骨质疏松[26]。另一种常见的亚型是ERβ，由ESR2基因编码。两种亚型均在骨组织中表达，参与骨代谢，协同在骨骼发育和维持过程中起重要作用，可能是骨疏康的作用靶点。
随后的GO富集分析发现，骨疏康治疗靶点富集的条目包括对类固醇激素的反应、膜区、核受体活性的生物过程。KEGG途径富集分析结果表明骨疏康可能通过雌激素、TNF、凋亡等信号通路发挥关键作用。以上结果表明骨疏康可以通过多种靶点和途径调节绝经后骨质疏松症的生物学过程。GO富集和KEGG途径富集分析结果表明，雌激素信号通路富集程度较高，这可能是骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的重要途径。雌激素信号通路主要由雌激素受体介导，可能通过介导WNT[27]、JAK2/STAT3[28]、BMP-2/Smad[29]、AKT/ERK等多条信号通路产生抗骨质疏松作用[30]。骨疏康方中淫羊藿味辛性温，专壮肾阳，熟地黄滋阴补血、益精填髓，骨碎补补肾强骨，共为君药；黄芪助气，丹参活血，为臣，助君药壮筋骨；木耳、黄瓜子补肾益气、活血壮骨为佐使，共奏补肾壮骨、活血通络之功效。方中淫羊藿[31]、熟地黄有雌激素样作用[32]，分析发现的槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、异鼠李素5种关键成分均为植物类黄酮，属于植物雌激素的一种，植物雌激素由于与雌激素共同的酚环结构，能够与雌激素受体结合发挥作用[33]。因此，在接下来的实验验证中，重点关注骨疏康对雌激素信号通路中不同亚型的雌激素受体的影响。
此次研究建立去卵巢大鼠绝经后骨质疏松症模型，通过检测骨微结构、血清雌激素水平及雌激素信号通路关键蛋白的表达水平，探索骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的作用机制。与既往研究结果一致[5]，骨疏康可有效改善去卵巢大鼠小梁骨的微观结构，增加骨密度，恢复小梁骨的组织形态。卵巢是雌激素的主要来源，去除卵巢后血清雌激素水平骤然下降，导致绝经后骨质疏松的发生。检测血清雌激素水平发现，骨疏康不能提高血清雌激素水平。但Western blot结果显示骨疏康可显著增强因去卵巢而减少的ERα，ERβ蛋白的表达，提示骨疏康发挥类雌激素样作用，通过ERα，ERβ抗绝经后骨质疏松症。
综上所述，此次研究分析了骨疏康治疗绝经后骨质疏松症的靶点及作用通路，并佐以实验验证，结果表明骨疏康在不影响血清雌激素水平的情况下，增强ERα，ERβ蛋白的表达发挥治疗作用，为日后更深入研究骨疏康的作用机制提供了理论参考和科学依据。但由于中药复方具有多通路、多靶点的作用特点，且雌激素信号通路经雌激素受体介导可调控下游信号转导途径，如PI3K/Akt、HIF1α/VEGF、MAPK等，因此骨疏康对上述下游信号通路的作用，及这些通路间是否存在交叉对话还有待于进一步研究，后续可针对这些方面展开探索，并对分析的关键成分进行体内外实验验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

雌激素受体在骨疏康治疗绝经后骨质疏松症中的作用与机制

The role and mechanism of estrogen receptor in the treatment of postmenopausal osteoporosis by Gushukang

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	章晓云, 刘桦, 柴源, 陈锋, 曾浩, 高振罡, 黄有荣. 益肾固疏方干预老年性骨质疏松症患者骨代谢标志物的变化及临床疗效[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1155-1160.
[2]	毕玉杰, 马笃军, 彭力平, 周紫琼, 赵静, 朱厚均, 钟秋辉, 杨玉鑫. 中医药联合医用水凝胶治疗疾病的策略及意义[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 419-425.
[3]	刘宝方, 徐斌, 陈雷. 葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 193-199.
[4]	冉磊, 韩海慧, 徐博, 王建业, 沈军, 肖涟波, 施杞. 补骨脂-淫羊藿对类风湿关节炎抗炎机制的分子对接分析：动物实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 208-215.
[5]	左俊, 马少林. β-谷甾醇对增生性瘢痕成纤维细胞作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 216-223.
[6]	张景涛, 胡珉华, 刘世涛, 李树源, 江泽欣, 曾文星, 马路遥, 周琦石. 中药复方治疗原发性骨质疏松用药规律及作用机制分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(16): 2555-2560.
[7]	高振罡, 章晓云, 蒋文. 铁死亡在骨关节炎中的作用机制及其中医药干预研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2242-2247.
[8]	徐康丽, 安兰花, 张金生, 杜晓燕, 尹乐乐, 张希贤. 功能磁共振在中医药治疗缺血性脑卒中领域的研究热点与前沿[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(11): 1789-1796.
[9]	刘浩, 杨红胜, 曾智谋, 王力平, 杨坤海, 胡永荣, 屈波. 腰椎MRI椎体骨质量评分评价绝经后女性骨质疏松的严重程度[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 606-611.
[10]	杨超强, 张虎林, 汪小敏, 王亮, 王宜灿. 中医药调控巨噬细胞防治骨相关疾病[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 5064-5070.
[11]	万哲, 杜军, 胡杨. 骨疏康干预Beagle犬磨牙压低过程中转化生长因子β1及β-连环蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4502-4506.
[12]	张金生, 田力, 李三强, 张希贤. 基于功能磁共振成像可视化解码中医药促进脑卒中后脑功能的重塑[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3747-3754.
[13]	林适, 袁嘉尧, 林贤灿, 杨彬彬, 吴建军, 东智卓玛, 唐子佳, 杨志杰, 万雷, 黄宏兴. 外周血干扰素γ、单核细胞趋化蛋白1对绝经后骨质疏松症的预测价值[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 165-170.
[14]	王雅欣, 林一璨, 郭伊诺, 张博, 马玉滢, 贺小平. 中医药调控细胞自噬治疗脊髓损伤的方法、技术及未来[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(13): 2116-2123.
[15]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.