LncRNA SNHG4调控牙周膜干细胞成骨分化过程中的miR-152-3p

doi:10.12307/2023.791

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (1): 38-43.doi: 10.12307/2023.791

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

LncRNA SNHG4调控牙周膜干细胞成骨分化过程中的miR-152-3p

周明华1，胡晓宇2

1河南财经政法大学医院口腔科，河南省郑州市 450046；2平顶山学院附属口腔医院，河南省平顶山市 467000

收稿日期:2022-12-16 接受日期:2023-01-18 出版日期:2024-01-08 发布日期:2023-06-28
通讯作者: 周明华，主治医师，河南财经政法大学医院口腔科，河南省郑州市 450046
作者简介:周明华，女，1984年生，汉族，2008年郑州大学毕业，主治医师，主要从事牙周黏膜方面的研究。

LncRNA SNHG4 regulates miR-152-3p during osteoblastic differentiation of periodontal ligament stem cells

Zhou Minghua1, Hu Xiaoyu2

1Department of Stomatology, Henan University of Economics and Law Hospital, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; 2Stomatological Hospital, Pingdingshan College, Pingdingshan 467000, Henan Province, China

Received:2022-12-16 Accepted:2023-01-18 Online:2024-01-08 Published:2023-06-28
Contact: Zhou Minghua, Attending physician, Department of Stomatology, Henan University of Economics and Law Hospital, Zhengzhou 450046, Henan Province, China
About author:Zhou Minghua, Attending physician, Department of Stomatology, Henan University of Economics and Law Hospital, Zhengzhou 450046, Henan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

长链非编码RNA：是一类长度大于200个碱基的RNA，其可参与许多生物过程，例如基因表达的转录、转录后调控等。长链非编码RNA可作为miRNA海绵发挥作用，影响miRNA的表达水平和活性。越来越多的证据表明，长链非编码RNA的失调与牙周膜干细胞的成骨分化有关。

miRNAs：是一类内源性非编码小RNA分子，长度为18-22个核苷酸。成熟的miRNA与目标mRNA 的3’-非翻译区(UTR)结合并抑制其翻译或诱导其降解。通过基因表达的转录后调控，miRNA已被证明可以调节许多生物过程，包括肿瘤发生、细胞增殖和分化。miRNA与成骨分化密切相关。

背景：研究表明长链非编码RNA核仁小RNA宿主基因4(LncRNA SNHG4)参与了多种炎症性疾病的进展，而关于LncRNA SNHG4对牙周炎治疗过程中人牙周膜干细胞成骨分化的影响尚不明确。
目的：探讨LncRNA SNHG4通过调节miR-152-3p对人牙周膜干细胞成骨分化的影响。
方法：从因正畸需要而拔除的前磨牙牙周膜组织中分离出人牙周膜干细胞，将其进行成骨诱导分化0，7，14 d后，qRT-PCR检测Runt相关转录因子2、骨钙素、LncRNA SNHG4及miR-152-3p表达。取第3代人牙周膜干细胞，将其分为NC组、pcDNA组、pcDNA-SNHG4组、inhibitor NC组、miR-152-3p inhibitor组、pcDNA-SNHG4+mimic NC组、pcDNA-SNHG4+miR-152-3p mimic组，qRT-PCR检测各组人牙周膜干细胞中LncRNA SNHG4、miR-152-3p表达，CCK-8法检测细胞增殖情况；比色法检测碱性磷酸酶活性；茜素红染色检测矿化结节形成情况；Western blot检测Runt相关转录因子2、骨钙素、碱性磷酸酶蛋白表达；双荧光素酶报告基因实验验证LncRNA SNHG4与miR-152-3p的关系。

结果与结论：①与成骨诱导0 d比较，成骨诱导7，14 d后人牙周膜干细胞中Runt相关转录因子2、骨钙素、LncRNA SNHG4表达升高， miR-152-3p表达降低(P < 0.05)；②过表达LncRNA SNHG4或抑制miR-152-3p均可提高人牙周膜干细胞的增殖能力及碱性磷酸酶活性、矿化结节形成量和Runt相关转录因子2、骨钙素、碱性磷酸酶的蛋白表达(P < 0.05)；miR-152-3p mimic减弱了过表达LncRNA SNHG4对人牙周膜干细胞成骨分化的促进作用；LncRNA SNHG4与miR-152-3p存在靶向关系；③结果表明，过表达LncRNA SNHG4可能通过抑制miR-152-3p促进人牙周膜干细胞成骨分化。

https://orcid.org/0000-0002-0107-9756 (周明华)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 长链非编码RNA, 核仁小RNA宿主基因4, 牙周膜干细胞, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 4 (lncRNA SNHG4) is involved in the progress of many inflammatory diseases, but the effect of lncRNA SNHG4 on the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells during the treatment of periodontitis is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of lncRNA SNHG4 on the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells by regulating miR-152-3p.
METHODS: Human periodontal ligament stem cells were isolated from periodontal membranes of premolars extracted for orthodontic purposes. After human periodontal ligament stem cells were induced to differentiate into osteoblasts for 0, 7, and 14 days, the expression levels of RUNX family transcription factor 2, osteocalcin mRNA, lncRNA SNHG4 and miR-152-3p in human periodontal ligament stem cells were detected by qRT-PCR. The third-generation human periodontal ligament stem cells were divided into the NC group, pcDNA group, pcDNA-SNHG4 group, inhibitor NC group, miR-152-3p inhibitor group, pcDNA-SNHG4+mimic NC group, and pcDNA-SNHG4+miR-152-3p mimic group. The expression of lncRNA SNHG4 and miR-152-3p in human periodontal ligament stem cells was detected by qRT-PCR. The proliferation of human periodontal ligament stem cells was detected by CCK-8 assay. Alkaline phosphatase activity was detected by colorimetry. The formation of mineralized nodules was detected by alizarin red staining. Western blot assay was used to detect the expression of RUNX family transcription factor 2, osteocalcin and alkaline phosphatase proteins. A double luciferase reporter gene experiment was applied to verify the relationship between lncRNA SNHG4 and miR-152-3p.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of RUNX family transcription factor 2, osteocalcin mRNA and lncRNA SNHG4 in human periodontal ligament stem cells after 7 and 14 days of osteogenic induction was higher than that after 0 days of osteogenic induction, while the expression of miR-152-3p was lower (P < 0.05). (2) Overexpression of lncRNA SNHG4 or inhibition of miR-152-3p was able to enhance the proliferation of human periodontal ligament stem cells, the alkaline phosphatase activity, mineralized nodule formation, the expression of RUNX family transcription factor 2, osteocalcin, and alkaline phosphatase proteins (P < 0.05). miR-152-3p mimic attenuated the promoting effect of overexpression of lncRNA SNHG4 on osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells. LncRNA SNHG4 had a targeting relationship with miR-152-3p. (3) These findings indicate that overexpression of lncRNA SNHG4 may promote the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells by inhibiting miR-152-3p.

Key words: long non-coding RNA, small nucleolar RNA host gene 4, periodontal ligament stem cell, osteogenic differentiation

中图分类号:

周明华, 胡晓宇. LncRNA SNHG4调控牙周膜干细胞成骨分化过程中的miR-152-3p[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 38-43.

Zhou Minghua, Hu Xiaoyu. LncRNA SNHG4 regulates miR-152-3p during osteoblastic differentiation of periodontal ligament stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(1): 38-43.

图/表（结果） 8

2.1 hPDLSCs的鉴定结果细胞免疫荧光染色结果显示，vimentin、CD90染色的hPDLSCs细胞质呈绿色，细胞核呈蓝色，表明vimentin、CD90呈阳性表达，而CD45染色的hPDLSCs细胞质无染色，细胞核呈蓝色，表明CD45呈阴性表达，见图1。

2.2 hPDLSCs中Runx2、骨钙素、LncRNA SNHG4及miR-152-3p的表达比较与成骨诱导0 d比较，成骨诱导7，14 d后hPDLSCs中Runx2、骨钙素、LncRNA SNHG4表达升高，miR-152-3p表达降低(P < 0.05)，见图2。

2.3 各转染组hPDLSCs中LncRNA SNHG4、miR-152-3p表达及hPDLSCs增殖能力的比较与NC组、pcDNA组比较，pcDNA-SNHG4组LncRNA SNHG4表达、A450值升高，miR-152-3p表达降低(P < 0.05)；与NC组、inhibitor NC组比较，miR-152-3p inhibitor组LncRNA SNHG4表达变化无显著性意义(P > 0.05)，miR-152-3p表达降低，A450值升高(P < 0.05)；与pcDNA-SNHG4组、pcDNA-SNHG4+mimic NC组比较，pcDNA-SNHG4+miR-152-3p mimic 组LncRNA SNHG4表达变化差异无显著性意义(P > 0.05)，miR-152-3p表达升高，A450值降低(P < 0.05)，见图3。

2.4 经成骨诱导后各转染组hPDLSCs碱性磷酸酶活性比较与NC组、pcDNA组比较，pcDNA-SNHG4组hPDLSCs碱性磷酸酶活性升高(P < 0.05)；与NC组、inhibitor NC组比较，miR-152-3p inhibitor组hPDLSCs碱性磷酸酶活性升高(P < 0.05)；与pcDNA-SNHG4组、pcDNA-SNHG4+mimic NC组比较，pcDNA-SNHG4+miR-152-3p mimic 组hPDLSCs碱性磷酸酶活性降低(P < 0.05)，见图4。

2.5 经成骨诱导后各转染组hPDLSCs 矿化结节形成比较与NC组、pcDNA组比较，pcDNA-SNHG4组矿化结节形成量升高(P < 0.05)；与NC组、inhibitor NC组比较，miR-152-3p inhibitor组矿化结节形成量升高(P < 0.05)；与pcDNA-SNHG4组、pcDNA-SNHG4+mimic NC组比较，pcDNA-SNHG4+miR-152-3p mimic 组矿化结节形成量降低(P < 0.05)，见图5。

2.6 经成骨诱导后各转染组hPDLSCs 中Runx2、骨钙素、碱性磷酸酶蛋白表达比较与NC组、pcDNA组比较，pcDNA-SNHG4组Runx2、骨钙素、碱性磷酸酶蛋白表达升高(P < 0.05)；与NC组、inhibitor NC组比较，miR-152-3p inhibitor组Runx2、骨钙素、碱性磷酸酶蛋白表达升高(P < 0.05)；与pcDNA-SNHG4组、pcDNA-SNHG4+mimic NC组比较，pcDNA-SNHG4+miR-152-3p mimic 组Runx2、骨钙素、碱性磷酸酶蛋白表达降低(P < 0.05)，见图6。

2.7 LncRNA SNHG4调控miR-152-3p表达 Starbase网站预测LncRNA SNHG4与miR-152-3p的结合位点，见图7。与mimic NC和LncRNA SNHG4-WT共转染组比较，miR-152-3p mimic和LncRNA SNHG4-WT共转染组荧光素酶活性降低(P < 0.05)；与mimic NC和LncRNA SNHG4-MUT共转染组比较，miR-152-3p mimic和LncRNA SNHG4-MUT共转染组细胞的荧光素酶活性差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，单因素方差分析多组间的差异。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年9月在平顶山学院附属口腔医院完成。
1.3 材料
1.3.1 组织来源收集2020年8月至2021年8月期间在平顶山学院附属口腔医院因正畸需要拔除的13-18岁青少年患者的前磨牙，所有患者及监护人均知情并提供了知情同意书，该研究获得平顶山学院附属口腔医院伦理委员会的批准，医院伦理批件号：2021(9)。
1.3.2 主要试剂 LncRNA SNHG4过表达的慢病毒(pcDNA-SNHG4慢病毒)及其阴性对照(pcDNA慢病毒)、miR-152-3p抑制物的慢病毒(miR-152-3p inhibitor 慢病毒)及其阴性对照(inhibitor NC 慢病毒)、miR-152-3p模拟物的慢病毒(miR-152-3p mimic 慢病毒)及其阴性对照(mimic NC 慢病毒)均购自重庆英茂盛业生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自深圳市纽邦生物技术有限公司；碱性磷酸酶比色法试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；兔源一抗vimentin、CD90、CD45、Runt相关转录因子2 (runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨钙素、碱性磷酸酶、GAPDH一抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。
1.4 实验方法

1.4.1 hPDLSCs的分离与培养用体积分数为75%乙醇对牙齿进行消毒，分离出牙周膜组织后用PBS清洗，将组织剪碎后用含有3 mg/mLⅠ型胶原酶和4 mg/mL分散酶的混合消化液消化60 min，使用70 μm过滤器获得单细胞悬液。将细胞在含有2%青霉素/链霉素、200 mmol/L L-谷氨酰胺和体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基中培养。培养1 d后开始换液，之后每3 d更换1次培养液，待细胞汇合度达到80%左右时采用有限稀释法挑选单克隆进行传代培养。

1.4.2 hPDLSCs的鉴定取第3代hPDLSCs，调整细胞浓度为2×106 L-1，接种于放置有盖玻片的培养皿中，待细胞达到80%左右汇合度时，取出盖玻片，PBS洗涤，丙酮固定，然后采用细胞免疫荧光染色法加入一抗vimentin(1∶1 000)、CD90(1∶500)、CD45(1∶500)在4 ℃孵育过夜，再加入绿色荧光标记的二抗(1∶1 000)在37 ℃下孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min，荧光显微镜观察细胞成像情况。
1.4.3 细胞分组取第3代hPDLSCs，将其分为NC组(不做任何处理)、pcDNA组(转染pcDNA慢病毒)、pcDNA-SNHG4组(转染pcDNA-SNHG4慢病毒)、inhibitor NC组(转染inhibitor
NC慢病毒)、miR-152-3p inhibitor组(转染miR-152-3p inhibitor慢病毒)、pcDNA-SNHG4+mimic NC组(共同转染pcDNA-SNHG4和mimic NC慢病毒)、pcDNA-SNHG4+miR-152-3p mimic 组(共同转染pcDNA-SNHG4和miR-152-3p mimic 慢病毒)，转染48 h后用于后续实验。
1.4.4 成骨诱导分化将各组hPDLSCs以每孔2×105个接种到6孔板中，用α-MEM培养基培养，待细胞达到80%汇合度后，将培养基更换为含2 mmol/L β-甘油磷酸盐、100 μmol/mL抗坏血酸、10 nmol/L地塞米松和1.8 mmol/L KH2PO4的成骨诱导培养基，每3 d换液1次。
将hPDLSCs分别经成骨诱导分化0，7，14 d后检测Runx2、骨钙素、LncRNA SNHG4及miR-152-3p的表达；经成骨诱导分化14 d后检测碱性磷酸酶活性及矿化结节形成。
1.4.5 qRT-PCR检测hPDLSCs中Runx2、骨钙素、LncRNA SNHG4及miR-152-3p表达成骨诱导分化0，7，14 d，Trizol试剂用于提取hPDLSCs中总RNA，将RNA反转录为cDNA后进行qRT-PCR反应。GAPDH作为Runx2、骨钙素、LncRNA SNHG4的内参基因，U6作为miR-152-3p的内参基因，通过2-ΔΔCt法计算Runx2、骨钙素、LncRNA SNHG4、miR-152-3p的相对表达量。引物的序列：Runx2：正向，5ʹ-GTC TTA CTA CTA CTG TGG AA-3ʹ；反向，5ʹ-TTC TGG AAC TCT GAT ATG G-3ʹ；骨钙素：正向，5’-CAG AGT CCA GCA AAG GTG-3’；反向，5’-AGC CAT TGA TAC AGG TAG C-3’；LncRNA SNHG4：正向，5’-ACC GAA GCC ACG CCC AGT A -3’；反向，5’-TCA CCT GCC ACT ATT TCC TCC C-3’；miR-152-3p：正向，5’-GCA TGA CAG AAC TTG GGT CG-3’；反向，5’-GTG TCG TGG AGT CGG CAA TT-3’；GAPDH：正向，5’-CTC TGG TAA AGT GGA TAT TGT-3’；反向，5’-GGT GGA ATC ATA TTG GAA CA-3’；U6：正向，5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’；反向，5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。
1.4.6 CCK-8法检测hPDLSCs的增殖情况将各组hPDLSCs (2×104个/孔)接种于96孔板中，孵育48 h后，向每孔加入10 µL CCK-8试剂，孵育2 h后利用酶标仪测量450 nm处的吸光度(A450)值。
1.4.7 碱性磷酸酶活性检测将各组hPDLSCs进行成骨诱导14 d，严格按照碱性磷酸酶比色法试剂盒进行染色，利用酶标仪测量405 nm处的吸光度值，以吸光度值表示碱性磷酸酶活性。
1.4.8 茜素红染色检测hPDLSCs 矿化结节形成情况将各组hPDLSCs进行成骨诱导14 d，用40 g/L多聚甲醛固定
30 min，然后用0.5%茜素红(pH=8.8)室温染色1 h，倒置显微镜下观察并拍照。利用Image J软件定量矿化结节形成量。矿化结节形成量=矿化结节形成面积/hPDLSCs面积×100%。
1.4.9 Western blot检测hPDLSCs中Runx2、骨钙素、碱性磷酸酶蛋白表达将各组hPDLSCs进行成骨诱导14 d，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从hPDLSCs中提取总蛋白。将蛋白质进行定量、电泳、转膜、封闭后，将膜与一抗Runx2(1∶2 000)、骨钙素(1∶1 000)、碱性磷酸酶(1∶2 000)、GAPDH(1∶2 000)在4 ℃孵育过夜，随后将膜和HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)共同孵育1 h，应用Tanon-5200化学发光成像仪进行蛋白质条带的可视化，使用Image J软件对条带密度进行分析。
1.4.10 双荧光素酶报告基因实验分别构建LncRNA SNHG4野生型质粒LncRNA SNHG4-WT、突变型质粒LncRNA SNHG4-MUT，将LncRNA SNHG4-WT和LncRNA SNHG4-MUT分别与mimic NC或miR-152-3p mimic共转染于hPDLSCs，48 h后观察荧光素酶活性变化。
1.5 主要观察指标 hPDLSCs的增殖能力、碱性磷酸酶活性、矿化结节形成、成骨相关基因(Runx2、骨钙素)mRNA及蛋白表达、双荧光素酶活性变化。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析，数据表示为x±s。单因素方差分析多组间的差异，进一步两组间的比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过平顶山学院附属口腔医院生物统计学专家审核。

讨论

牙周炎是一种常见的慢性炎症，是成人牙齿脱落的重要原因。近年来，基于干细胞的牙周炎治疗显示出广阔的医学前景，hPDLSCs是这类治疗的关键干细胞[10-12]。据报道，PDLSCs表面标志物vimentin、CD90呈阳性表达，而CD45呈阴性表达[13-14]。在该研究中，通过免疫荧光染色发现分离培养的细胞vimentin、CD90呈阳性，而CD45阴性，表明分离的细胞为hPDLSCs，可用于后续实验。
越来越多的研究表明，LncRNA参与了牙周炎的进展。如在牙周膜成纤维细胞中上调LncRNA-KAT7可抑制脂多糖诱导的炎性因子表达[15]；过表达LncRNA Nron可抑制牙周炎中的骨吸收[16]；过表达LncRNA HHIP-AS1可促进hPDLSCs成骨分化[17]。SNHG4作为近年来新发现的一种LncRNA，对其研究大多集中于肿瘤方面[18-19]，而关于LncRNA SNHG4对hPDLSCs成骨分化的影响鲜有报道。Runx2作为RUNX家族转录因子中的一员，其表达水平与一些编码骨基质蛋白的基因呈正比[20-21]；骨钙素是主要存在于骨组织中的基因，其可直接参与骨重建与矿化过程[22]；Runx2、骨钙素是能够代表骨新陈代谢过程的标志性基因[23-24]。该研究发现经成骨诱导7，14 d后hPDLSCs中Runx2、骨钙素、LncRNA SNHG4表达水平明显高于成骨诱导0 d，提示LncRNA SNHG4可能参与了hPDLSCs成骨分化过程。碱性磷酸酶是成骨细胞分化成熟的标志，其活性越高表明细胞的成骨分化能力越强[25-26]；钙化结节是hPDLSCs发生矿化时形成的，通过检测hPDLSCs形成钙结节的数量可以衡量hPDLSCs成骨分化的程度[27]。该研究显示，过表达LncRNA SNHG4可提高成骨诱导后hPDLSCs 的碱性磷酸酶活性、钙结节形成及Runx2、骨钙素、碱性磷酸酶蛋白表达，表明过表达LncRNA SNHG4可促进hPDLSCs成骨分化，提示LncRNA SNHG4可能成为促进hPDLSCs成骨分化的潜在有效靶点。
lncRNAs可作为竞争性内源RNA与miRNA结合调控骨再生和重塑[28-29]。为了进一步探究过表达LncRNA SNHG4促进hPDLSCs成骨分化的分子机制，该研究通过生物信息学分析及双荧光素酶报告基因实验证实LncRNA SNHG4可靶向结合miR-152-3p。miR-152-3p为miRNAs家族成员之一，据报道，低表达miR-152-3p可促进激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞成骨分化[30]。该研究表明miR-152-3p参与了成骨分化的过程。研究显示，经成骨诱导7，14 d后hPDLSCs中miR-152-3p表达水平明显低于成骨诱导0 d，提示miR-152-3p可能参与了hPDLSCs成骨分化过程。此外，下调miR-152-3p促进了hPDLSCs成骨分化，而过表达LncRNA SNHG4可以抑制hPDLSCs中的miR-152-3p表达，推测过表达LncRNA SNHG4可能通过抑制miR-152-3p促进hPDLSCs成骨分化。为了验证该猜想，该研究在过表达LncRNA SNHG4的基础上再加上miR-152-3p mimic干预hPDLSCs，经成骨诱导后发现，miR-152-3p mimic减弱了过表达LncRNA SNHG4对hPDLSCs成骨分化的促进作用，证实了作者猜想是正确的，即过表达LncRNA SNHG4可能通过抑制miR-152-3p促进hPDLSCs成骨分化。
综上所述，过表达LncRNA SNHG4可能通过抑制miR-152-3p促进hPDLSCs成骨分化。LncRNA SNHG4可能成为治疗牙周炎的潜在有效靶点。然而该研究仅仅进行了体外实验，未进行体内实验进一步验证是该研究的不足之处，后期将会进一步深入探究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

LncRNA SNHG4调控牙周膜干细胞成骨分化过程中的miR-152-3p

LncRNA SNHG4 regulates miR-152-3p during osteoblastic differentiation of periodontal ligament stem cells

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