双上肢去势联合椎间盘刺破诱导建立大鼠椎间盘退变模型

doi:10.12307/2023.845

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (35): 5616-5621.doi: 10.12307/2023.845

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

双上肢去势联合椎间盘刺破诱导建立大鼠椎间盘退变模型

孙孝先1，白雪1，2，刘孟敏1，2，郭杨1，林顺3，吴雯轩2，马勇1，2，刘锦涛3

南京中医药大学，1骨伤修复与重建新技术实验室，2中医学院·中西医结合学院，江苏省南京市 210023；3南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏省苏州市 215008

收稿日期:2022-10-08 接受日期:2022-11-30 出版日期:2023-12-18 发布日期:2023-06-02
通讯作者: 马勇，博士，教授，主任医师，南京中医药大学，骨伤修复与重建新技术实验室；中医学院·中西医结合学院，江苏省南京市 210023 刘锦涛，博士，硕士研究生导师，副主任医师，南京中医药大学附属苏州中医医院，江苏省苏州市 215008
作者简介:孙孝先，男，1995年生，江苏省宿迁市人，汉族，在读硕士，主要从事中医药治疗椎间盘退行性疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82074467)，项目负责人：刘锦涛；2022年大学生创新创业训练计划省级重点项目(202210315108Z)，项目负责人：吴雯轩

Establishing a rat model of intervertebral disc degeneration by castration of both upper limbs combined with intervertebral disc puncture

Sun Xiaoxian1, Bai Xue1, 2, Liu Mengmin1, 2, Guo Yang1, Lin Shun3, Wu Wenxuan2, Ma Yong1, 2, Liu Jintao3

1Laboratory of New Techniques of Restoration & Reconstruction of Orthopedics and Traumatology, 2School of Chinese Medicine/School of Integrated Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China; 3Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China

Received:2022-10-08 Accepted:2022-11-30 Online:2023-12-18 Published:2023-06-02
Contact: Ma Yong, MD, Professor, Chief physician, Laboratory of New Techniques of Restoration & Reconstruction of Orthopedics and Traumatology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China; School of Chinese Medicine/School of Integrated Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China Liu Jintao, MD, Master’s supervisor, Associate chief physician, Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China
About author:Sun Xiaoxian, Master candidate, Laboratory of New Techniques of Restoration & Reconstruction of Orthopedics and Traumatology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Project), No. 82074467 (to LJT); 2022 Provincial Key Project of Student Innovation and Entrepreneurship Training Program, No. 202210315108Z (to WWX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

椎间盘退变：是指椎间盘组织随着年龄增长及异常应力刺激下出现的退行性病变，表现为腰痛及神经根刺激或压迫症状，其病理表现为髓核细胞的活力下降、凋亡，细胞外基质分解与合成代谢的失衡，胶原蛋白表达量的减少等。
双上肢去势联合椎间盘刺破：通过截去大鼠双上肢联合椎间盘纤维环刺破制备大鼠椎间盘退变动物模型。

背景：寻求一种相对合适的椎间盘退变动物模型，对深入研究椎间盘退变的发病机制有着重要意义。
目的：探索一种新的椎间盘退变动物模型，希望为椎间盘退变疾病的基础研究提供新的造模方式选择。
方法：将20只雄性SD大鼠随机分为假手术组与模型组。采用双上肢去势联合椎间盘刺破的方式制备椎间盘退变模型，于造模当天及造模后4周、8周进行MRI检查，观察造模前后椎间盘形态变化并评估Pfirrmann分级；造模4，8周后取出大鼠L4-L5及L5-L6椎间盘，运用苏木精-伊红染色、Masson染色法观察椎间盘病理学变化及免疫组化观察Ⅱ型胶原蛋白表达量。

结果与结论：①模型组在造模当天仅呈现轻微退变；②在造模第4周时与假手术组相比，模型组MRI上T2加权信号降低，在Pfirrmann分级上可见明显差异(P < 0.05)，在造模第8周时与假手术组相比，模型组MRI上T2加权信号明显降低，与纤维环边界模糊不清，且髓核向后纵韧带膨出，在Pfirrmann分级上可见显著差异(P < 0.01)；③病理染色结果显示，在造模第4周时，与假手术组相比，模型组髓核细胞减少，纤维环排列紊乱，Ⅱ型胶原表达量下降；在造模第8周时，与假手术组相比，模型组髓核细胞皱缩、基质凝结，纤维环破裂，结构遭到破坏且与髓核界限模糊，髓核部分Ⅱ型胶原表达量下降更为明显；④此方法可成功建立大鼠椎间盘退变模型，且动物模型退变明显，为研究椎间盘退变模型提供一种新思路。

https://orcid.org/0000-0002-2791-1280(孙孝先)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 椎间盘退变, 动物模型, 大鼠, 双上肢去势, 纤维环穿刺

Abstract: BACKGROUND: Seeking a relatively suitable animal model of intervertebral disc degeneration is of great significance for an in-depth study of the pathogenesis of intervertebral disc degeneration.
OBJECTIVE: To seek a relatively suitable animal model of intervertebral disc degeneration, providing a new modeling option for basic research into degenerative disc disease.
METHODS: Twenty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group and model group. The intervertebral disc degeneration model was prepared by castration of both upper limbs combined with intervertebral disc puncturing. MRI examination was performed on the day of modeling and at 4 and 8 weeks after modeling to observe the morphological changes of the intervertebral discs and evaluate the Pfirrmann grade before and after modeling. The L4-L5 and L5-L6 intervertebral discs were removed from the rats at 4 and 8 weeks after modeling. The pathological changes of the intervertebral discs were observed by hematoxylin-eosin and Masson staining and the expression of type II collagen was observed by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: The model group showed only slight degeneration on the day of modeling. Compared with the sham operation group, the T2-weighted signal on MRI was decreased in the model group, and there was a significant difference in the Pfirrmann grading at 4 weeks after modeling (P < 0.05). Compared with the sham operation group, the T2-weighted signal on MRI was significantly decreased and the boundary with the annulus fibrosa was blurred in the model group at 8 weeks after modeling. The nucleus pulposus in the model group was expanded in the posterior longitudinal ligament and there was a significant difference in the Pfirrmann grading between the two groups (P < 0.01). The results of pathological staining showed that compared with the sham operation group, the model group had a reduction in the number of nucleus pulposus cells, disordered annulus fibrosus, and decreased expression of type II collagen at the 4th week after modeling. While at the 8th week after modeling, the nucleus pulposus cells were shrunk, the matrix was condensed, the annulus fibrosus was ruptured, the structure was damaged and the boundary between the nucleus pulposus and the nucleus pulposus was blurred, and the expression of type II collagen in the nucleus pulposus was decreased more obviously in the model group compared with the sham operation group. To conclude, this method can successfully establish the rat model of intervertebral disc degeneration, and the animal model develops obvious degeneration, which provides a new idea for the study of intervertebral disc degeneration model.

Key words: intervertebral disc degeneration, animal model, rat, castration of both upper limbs, annulus fibrosus puncture

中图分类号:

孙孝先, 白雪, 刘孟敏, 郭杨, 林顺, 吴雯轩, 马勇, 刘锦涛. 双上肢去势联合椎间盘刺破诱导建立大鼠椎间盘退变模型[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(35): 5616-5621.

Sun Xiaoxian, Bai Xue, Liu Mengmin, Guo Yang, Lin Shun, Wu Wenxuan, Ma Yong, Liu Jintao. Establishing a rat model of intervertebral disc degeneration by castration of both upper limbs combined with intervertebral disc puncture[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(35): 5616-5621.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验选用20只SD大鼠，随机分为2组，造模成功后未出现死亡，全部进入后续实验结果分析。
2.2 影像学改变在模型制备当天随机取2只模型组大鼠及在造模后第4，8周各组分别随机取3只大鼠行MRI影像学检查，见图3，4。模型组大鼠在造模当天的MRI T2加权下信号变化不明显，4周后模型组较假手术组L4-L5，L5-L6信号强度明显降低，髓核与纤维环边界模糊不清，椎间盘结构不均，椎间盘高度变化不明显，其Pfirrmann评分较假手术组相比明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；8周后模型组较假手术组髓核与纤维环的信号强度区别不明显，椎间盘高度明显下降，髓核明显向后方膨出，其Pfirrmann评分较假手术组相比显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.3 腰椎间盘病理学观察
2.3.1 苏木精-伊红染色结果术后4周与假手术组相比，模型组髓核细胞数量明显减少、基质凝结成团簇状，纤维环排列紊乱，结构不均；术后8周与假手术组相比，模型组髓核细胞皱缩，脊索细胞消失，基质凝结散漫，与纤维环界限不清，纤维环结构破坏，见图5。

2.3.2 Masson染色结果术后4周与假手术组相比，模型组髓核细胞数量减少、与纤维环边界模糊，纤维环排列结构混乱，终板有一定程度的破裂，终板细胞排列紊乱，细胞核丢失；术后8周与假手术组相比，模型组髓核细胞数量减少，排列混乱成团簇状，与纤维环界限模糊，纤维环破裂，终板细胞堆叠，有新的血管增生，细胞核丢失，见图6，7。

2.4 Ⅱ型胶原免疫组化观察结果应用Image J 5.0软件分析各组Ⅱ型胶原平均灰度值，比较各组间差异，结果显示：4周时，模型组较假手术组阳性细胞数量减少，Ⅱ型胶原表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；相对4周而言，8周时模型组阳性细胞数量减少的更为明显，Ⅱ型胶原表达显著降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图8，9。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，比较假手术组与模型组间影像学、病理学及免疫组化指标，组间差别用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2022年5-8月在南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康雄性SD大鼠20只，8周龄，SPF级，体质量220-250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物使用许可证号为SCXK(京)2021-0011。此次实验在南京中医药大学实验动物伦理委员会的批准及监督下进行，动物伦理批准编号：ACU210902。实验动物在南京中医药大学实验动物中心饲养，分笼喂养，每笼三四只，自由摄食饮水，每日喂食，隔日换水，明暗时间交替饲养各12 h，室温控制在24-26 ℃，湿度50%左右。
1.3.2 实验器械小号剪刀、止血钳(直、弯)、拉钩、手术刀柄、持针器、精细镊、咬骨钳、11#手术刀片，21G穿刺针、无菌缝合针、无菌缝合线、5 mL注射器、无菌铺巾、一次性手套、纱布等。
1.3.3 实验试剂异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司，20220320)；苏木素-伊红染液(上海茹创生物科技有限公司，RC0062)；Masson染液(上海茹创生物科技有限公司，G1006)；Ⅱ型胶原一抗(Abcam有限公司，Ab16667)；Ⅱ型胶原二抗(通灵生物，K212141D)；DAB显色剂(上海茹创生物科技有限公司，RC062)。

1.3.4 实验仪器小动物活体Micro CT影像系统(美国PerkinElmer公司)；PharmaScan7.0T小动物磁共振成像系统(德国Bruker公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；正置光学显微镜(日本NIKON公司)；生物显微镜-图像分析系统(日本NIKON公司)；全自动硬组织切片机(德国Leica公司)。

1.4 实验方法
1.4.1 实验分组将实验动物用耳标编号后，按照随机数字表分为模型组、假手术组，每组10只，适应性饲养1周后开始干预。

1.4.2 实验造模 ①所有动物术前一晚禁食禁水。采用体积分数2.0%异氟烷吸入诱导麻醉，先将大鼠左上肢备皮及碘伏常规消毒，取前臂近端1/3处横切开皮肤，切开肌肉，钝性剥离筋膜，暴露三角肌下血管神经束及伴行肱动脉，用3号缝合线结扎，在结扎处远端用咬骨钳咬断肱骨，离断左上肢，再将肌肉、筋膜、皮肤逐层缝合，右侧采用相同方法。②椎间盘纤维环穿刺。模型组大鼠取俯卧位，借助CT及3D重建辅助定位L4-L5，见图1，穿刺针刺入并确定穿刺深度及位置。定位L4、L5及L6(髂嵴平对L5-L6椎间盘或L6椎体)，背部区域备皮及碘伏常规消毒，于后背正中线一侧做一纵向切口，用弯钳钝性分离皮肤和筋膜，暴露关节突，将大鼠调整成侧卧位，沿L5/L6脊柱旁缓慢剥离腰大肌(手术刀沿肌肉纹理切口后钝性分离肌间隙)，直至暴露L4-L5椎间盘横突，沿L5椎间盘横突下缘确定L5椎体，向上循行确定L4椎体，在L4-L5椎体连接处取21G穿刺针沿L4-L5椎间隙呈0-30°进针，进针深度约2.2 mm，有突破感后针尖置于椎间盘停留3-5 s，刺破L4-L5椎间盘后纵韧带及纤维环，同法刺破L5-L6椎间盘，穿刺成功后，依序缝合肌肉、筋膜、皮肤，完整流程见图2。③假手术组双上肢与背部备皮、常规消毒同上，但仅切开双上肢皮肤，不切开肌肉，保留双上肢；背部区域暴露步骤同上，在穿刺椎间盘时，穿刺针仅刺破表层肌肉，不刺破纤维环。

1.4.3 术后处理大鼠苏醒后放入笼中常规饲养，切口处涂红霉素软膏并连续肌注抗生素(青霉素钠)3 d以预防感染。
1.5 主要观察指标
1.5.1 影像学检查造模当天先在CT及3D重建辅助下确定定位及穿刺深度。造模成功后取2只大鼠行MRI检查，并在4，8周时每组分别随机取3只大鼠行MRI检查，在MRI T1、T2及T2加权下观察椎间盘退变情况，进行Pfirrmann评分[7-8]。
1.5.2 组织病理学检查
(1)苏木精-伊红染色观察椎间盘病理变化：术后4，8周，每组每个时间点随机抽取3只大鼠，麻醉处死后取标记位置的L4-L5椎间盘组织，在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，常规脱钙，再经梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，浸蜡，常规包埋，石蜡切片，厚度约3 μm，60 ℃烘箱烤片；再行石蜡切片脱蜡至水，苏木素染细胞核，盐酸乙醇分化，1%氨水返蓝，伊红染细胞质，脱水封固，显微镜下观察，比较各组椎间盘组织病理学变化。
(2)Masson染色观察椎间盘病理变化：术后4，8周，每组每个时间点随机抽取3只大鼠，麻醉处死后取标记位置的L5-L6椎间盘组织，在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，常规脱钙，再经梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，浸蜡，常规包埋，石蜡切片，厚度约3 μm，60 ℃烘箱烤片；再行石蜡切片脱蜡至水，苏木素染细胞核，盐酸乙醇分化，丽春红染色，流水冲洗，磷钼酸处理3-5 s后，不水洗直接放入苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸分化，脱水封固，显微镜下观察，比较各组椎间盘组织病理学变化。
(3)免疫组化染色观察Ⅱ型胶原(COL2A1)在髓核中的表达量：利用Masson染色前切的石蜡切片白片进行Ⅱ型胶原免疫组化染色。石蜡切片脱蜡至水，组织切片浸于柠檬酸钠抗原修复液中进行抗原修复，滴加体积分数为3%过氧化氢溶液室温避光孵育25 min以阻断内源性过氧化物酶，再向切片滴加3%牛血清白蛋白，室温封闭30 min，漂洗后滴加一抗(1∶100)，4 ℃孵育过夜，漂洗后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，再经二氨基联苯胺显色液染色5 min，流水冲洗终止显色，苏木素复染3 min，流水冲洗，脱水封固，显微镜下观察，每组各取3张切片，且在每张切片随机选取3个不重复的高倍视野拍照，利用Image J 5.0软件对图像进行分析比较阳性细胞表达量。
1.6 统计学分析采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析。对符合正态分布的实验计量资料以x±s表示，用独立样本t检验比较组间差别，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过南京中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

3.1 造模动物选择在造模动物选择方面，鉴于人类特殊的行走方式，为了充分还原模拟人类椎间盘退变的动物模型，灵长类动物为最理想的选择，但因其昂贵的饲养成本及更严格的伦理要求，致使多数研究者转向其他动物[9-14]。O’CONNELL等[15]通过对狒狒、绵羊、牛、兔、大鼠和小鼠的椎间盘几何形状进行测量与标准化比较，得出小鼠及大鼠腰椎最符合人类椎间盘形态的结论，且因大鼠与小鼠获取与饲养条件较容易，致使大鼠与小鼠在椎间盘退变模型中应用最为广泛。但因小鼠腰椎过小，在构建椎间盘退变模型时难度较大，因而大鼠成为此次动物模型构建的首要选择。
3.2 造模方式及评价在造模方式选择方面，可分为结构损伤、自发退变、生物力学变化及基因敲除等方式，该研究将主要与结构损伤中的物理损伤模型及生物力学模型展开比较。
3.2.1 物理损伤模型物理损伤模型多通过造成椎间盘损伤以诱导椎间盘退变，如纤维环损伤模型、髓核损伤模型、终板损伤模型。物理损伤模型中以纤维环穿刺模型较为多见，该模型是通过破坏椎间盘结构的完整性，促使神经与血管通过破裂的纤维环侵入髓核。由于纤维环中含有大量的蛋白聚糖及胶原纤维，纤维环损伤后Ⅰ型胶原表达升高，Ⅱ型胶原表达降低，基质金属蛋白酶13表达增加，致使纤维环抗牵张力下降，细胞外基质降解，破坏了细胞外基质的合成与分解代谢平衡，从而诱发椎间盘退变[16]。然而该模型在构建过程中一定程度上忽略了人类椎间盘垂直受力的特点，即人类站立状态下受到的椎间盘压缩力[17]。髓核损伤模型多是在纤维环损伤的基础上抽吸髓核以进一步促进椎间盘退变，但该方法不符合人类椎间盘退变发生的病理过程。终板损伤模型则是通过阻断椎间盘营养途径及血供来诱导椎间盘退变，HUTTON等[18]在犬的椎间盘终板下方注射骨水泥阻断营养途径，长达70周的干预过程中均未发现任何退化征象；而YIN等[19]通过骨水泥阻断山羊L2-L4节段，并用同组L1-L2及L4-L5做正常对照，在48周时观察到明显的影像学和组织学退变；但该种造模方式在造模周期及效果上差别较大，目前仍存在一定争议。
3.2.2 生物力学模型生物力学模型则多通过模拟人体在过度负荷下的椎间盘退变过程，即向椎间盘施加轴向牵引或动态负荷压缩以促其退变，如异常应力模型、腰椎不稳模型、双足直立模型，LAO等[20]通过特制的热板笼迫使小鼠直立跳跃对椎间盘施加脊髓轴向压力来诱导小鼠腰椎椎间盘退变，该模型在3个月时出现明显椎间盘退变的迹象；郭小惠等[21]通过弹性压缩应力装置对山羊椎间盘施加可调节的轴向应力来诱导椎间盘退变，随着压缩时间增加而出现明显的椎间盘高度降低与影像学、组织学退变；LIU等[22]通过切除棘突以及棘上韧带制备腰椎不稳小鼠模型，通过小动物MRI、μCT测量椎间盘面积及组织病理学等方式来衡量模型的成功与否，该模型多用于研究椎间盘源性腰痛及椎间盘退变诱导的骨质疏松症，该模型忽略了造模过程中的手术应激及椎间盘退变的早期病理变化，且无法解释模型诱导的根源性疼痛与骨性疼痛的区别。双足直立模型通过改变实验动物脊柱的受力情况，模拟人类腰椎椎间盘退变时的特殊应力情境，借以异常应力的增加促进椎间盘退变的发生，但该模型造模周期过长，且需特制的饲养笼盒，对饲养条件要求较高[23]。生物力学模型造模过程中多需要一些特制器械辅助造模，普适性受到一定限制，且无法完全还原人体椎间盘退变过程中的复合应力[24]。
受此启发，该研究采用双上肢去势联合椎间盘刺破的方式来诱导大鼠椎间盘退变，一方面通过刺破纤维环破坏椎间盘结构完整性，打破了细胞外基质合成与分解代谢平衡，在第8周时，模型组与假手术组相比，髓核细胞皱缩、基质凝结，纤维环破裂，结构遭到破坏且与髓核界限模糊，髓核部分Ⅱ型胶原表达量下降更为明显，从而诱发椎间盘退变；另一方面联合双上肢去势迫使大鼠模拟人类椎间盘退变时的受力方式，成功诱导了椎间盘退变模型的建立，在4周时即可通过MRI观察到椎间盘一定程度的退变，8周时可见椎间盘明显退变征象，一定程度上缩短了造模时间。
椎间盘退变模型建立的成功与否主要从影像学方面评估Pfirrmann分级以判断椎间盘退变程度，通过苏木精-伊红染色及Masson染色来观察椎间盘细胞外基质及髓核变化等多方面来衡量，而Ⅱ型胶原作为椎间盘的重要组成部分在椎间盘退变过程中表达量明显降低[25-26]。故此次实验通过MRI直观评估其影像学变化，苏木精-伊红染色及Masson染色间接观察其病理学变化，并比较各组Ⅱ型胶原免疫组化表达量来评价模型建立的科学性。综合以上检测结果，发现模型组MRI在造模当天仅呈现轻微退变，在4周时与假手术组相比，MRI上T2加权信号有不同程度的降低及Pfirrmann分级上可见明显差异(P < 0.05)，在8周时与假手术组相比，MRI上T2加权信号明显降低、与纤维环边界模糊不清，且髓核向后纵韧带膨出，在Pfirrmann分级上可见显著差异(P < 0.01)；病理染色结果显示，较假手术组而言，模型组在第4周时髓核细胞有不同程度的减少，纤维环排列紊乱，终板有部分破裂及Ⅱ型胶原表达量下降；在第8周时，与假手术组相比，髓核细胞皱缩、基质凝结，纤维环破裂，结构遭到破坏且与髓核界限模糊，终板细胞核减少。免疫组化结果显示，模型组较假手术组，在4，8周时的阳性细胞数量均有一定程度减少及Ⅱ型胶原染色面积明显下降，差异有显著性意义。上述改变提示该造模方法能在一定程度上诱导椎间盘退变，且较常规纤维环穿刺及仅双上肢去势模型造模时间明显缩短[27-28]，为椎间盘退变模型提供了一种新的制备方法。
实验存在以下局限性：①仅使用了单一方法构建模型，缺少其他方法对照比较模型的优越性；②该模型在造模过程中创伤较大，手术时间较长，对实验操作有一定要求，且需注意术后抗感染护理。
综上所述，该实验建立了一种新的造模方法，即双上肢去势联合椎间盘刺破的方式来诱导大鼠椎间盘退变，造模方法退变明显，为构建椎间盘退变模型提供了一种新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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双上肢去势联合椎间盘刺破诱导建立大鼠椎间盘退变模型

Establishing a rat model of intervertebral disc degeneration by castration of both upper limbs combined with intervertebral disc puncture

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