构建内固定术后早期感染细菌生物膜形成灌注冲洗的动物模型

doi:10.12307/2024.400

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (23): 3704-3708.doi: 10.12307/2024.400

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构建内固定术后早期感染细菌生物膜形成灌注冲洗的动物模型

黄家成1，邵欣欣2，李浩淼1，杜少华1，戴双武1

1南方医科大学第三附属医院骨科医学中心骨肿瘤科，广东省广州市 510630；2中山大学附属第一医院麻醉科，广东省广州市 510080

收稿日期:2023-02-09 接受日期:2023-07-04 出版日期:2024-08-18 发布日期:2023-09-13
通讯作者: 戴双武，主治医师，南方医科大学第三附属医院骨科医学中心骨肿瘤科，广东省广州市 510630
作者简介:黄家成，1995年生，广东省河源市人，汉族，外科住培医师，主要从事骨感染方面的研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2020A1414050028)，项目负责人：戴双武

Construction of an animal model for treating early postoperative infected bacterial biofilms by irrigating after internal fixation

Huang Jiacheng1, Shao Xinxin2, Li Haomiao1, Du Shaohua1, Dai Shuangwu1

1Department of Musculoskeletal Oncology, Center for Orthopedic Surgery, The Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; 2Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2023-02-09 Accepted:2023-07-04 Online:2024-08-18 Published:2023-09-13
Contact: Dai Shuangwu, Attending physician, Department of Musculoskeletal Oncology, Center for Orthopedic Surgery, The Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Huang Jiacheng, Physician, Department of Musculoskeletal Oncology, Center for Orthopedic Surgery, The Third Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Province Science and Technology Plan, No. 2020A1414050028 (to DSW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细菌生物膜：也称为生物被膜，是指附着在有生命或无生命物体表面并被细菌胞外高分子包裹的有组织细菌集团。细菌生物膜多细胞结构的形成是一个动态过程，包括细菌起始黏附、细菌生物膜发展和成熟扩散等阶段。细菌生物膜存在蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等各种主要生物高分子，对抗生素和宿主免疫防御机制耐药性很强。
灌注冲洗：是病灶清除的基本治疗方法，其作用是在伤口闭合的条件下将腔中的炎性渗出物、积血持续引流出来，并可连续注入抗生素等药液提高局部灭菌药物浓度，以控制炎症的治疗方法。

背景：骨科内固定术后感染细菌生物膜形成的治疗是临床非常棘手的问题，建立内固定术后早期感染细菌生物膜形成的灌注冲洗动物模型对探索该病的治疗方法具有重要意义。

目的：建立可用不同药物灌注冲洗治疗内固定术后早期感染细菌膜形成的动物模型。
方法：选取6只新西兰大白兔，暴露双侧股骨表面并钻孔，将定植铜绿假单胞菌的接骨板(实验组)和空白接骨板(空白对照组)各植入一侧钻孔周围，留置2条引流管并固定分别作为“入口”和“出口”，模拟灌注后保留浸泡一定时间后再进行冲洗。术后5 d，观察兔体温、伤口情况、引流液细菌培养及接骨板结晶紫染色、扫描电镜检查结果。

结果与结论：①6只兔术后患肢活动不便，术后第2-4天出现体温升高，实验组部分伤口处可触及局部肿胀，空白对照组伤口愈合良好；②引流液细菌培养结果显示，实验组铜绿假单胞菌向周边扩散或蔓延；术后5 d，实验组接骨板结晶紫染色后呈紫色，酶标仪检测570 nm处吸光度值为2.621±0.088，提示存在细菌；③术后5 d的扫描电镜显示，实验组接骨板表面可见大量细菌微菌落，形成类似“磨菇样”“塔状”的高度组织不均匀性三维立体结构，高倍镜下可见“磨菇样”结构之间有丝状连接的水通道，是典型的生物膜结构且致密度极高，空白对照组未见明显菌落形成；④结果显示该动物模型模拟了内固定术后早期感染生物膜形成后的状态，提供了一种可用不同药物进行灌注冲洗的方法。

https://orcid.org/0009-0009-2632-3303(黄家成)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 细菌生物膜, 内固定术, 接骨板, 动物模型, 感染, 灌注冲洗

Abstract: BACKGROUND: The treatment for bacterial biofilms after internal fixation surgery is a very difficult problem in clinic. It is a great significance to establish an animal model of irrigation for treating bacterial biofilms in the early stage after internal fixation surgery.
OBJECTIVE: To establish an animal model for treating bacterial biofilms with different drugs through irrigation in early stage after internal fixation surgery.
METHODS: Six New Zealand white rabbits were selected. Bilateral femoral surfaces were exposed and drilled holes were made, and bone plates colonized with Pseudomonas aeruginosa (experimental group) and blank bone plates (blank control group) were implanted around the drilled holes on one side, and two drainage tubes were retained and fixed to serve as the “inlet” and “outlet,” respectively. The model was immersed for a certain period of time after simulated perfusion before rinsing. After the simulated irrigation, the plates were soaked for a certain time before washing. At 5 days postoperatively, the rabbits were observed for body temperature, wound condition, bacterial culture of drainage fluid, and crystalline violet staining and scanning electron microscopy of the bone plate.
RESULTS AND CONCLUSION: Six rabbits had difficulty in moving the affected limbs after surgery and showed elevated body temperature at 2-4 days after surgery. Local swelling could be touched at some wounds in the experimental group, and the wounds in the blank control group healed well. The results of bacterial culture of drainage fluid showed that Pseudomonas aeruginosa diffused or spread in the experimental group. At 5 days after surgery, the plate in the experimental group became purple shown by crystalline violet staining, and the absorbance value at 570 nm detected by the microplate reader was 2.621±0.088, indicating the presence of bacteria. Scanning electron microscopy at 5 days after surgery showed that a large number of bacterial microcolonies appeared on the surface of the plate in the experimental group, forming a highly inhomogeneous three-dimensional structure similar to the “mushroom-like” and “tower-like” structures, with filamentous water channels connecting the “mushroom-like” structures, which were typical biofilm structures with high densities, while no obvious colonies were seen in the blank control group. Overall, this animal model simulates the state of infected biofilm formation due to early infection after internal fixation and provides an available method of irrigation with different drugs.

Key words: bacterial biofilm, internal fixation, bone plate, animal model, infection, irrigation

中图分类号:

黄家成, 邵欣欣, 李浩淼, 杜少华, 戴双武. 构建内固定术后早期感染细菌生物膜形成灌注冲洗的动物模型[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3704-3708.

Huang Jiacheng, Shao Xinxin, Li Haomiao, Du Shaohua, Dai Shuangwu. Construction of an animal model for treating early postoperative infected bacterial biofilms by irrigating after internal fixation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(23): 3704-3708.

图/表（结果） 4

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引言

随着医学的进步和社会经济的发展，各种因素所致骨折的患者增多，骨科内固定物植入手术的应用也逐年增加，内固定术后感染发生率为0.4%-16.1%，平均为5%[1]，其中闭合性骨折内固定术后感染发生率为1%，开放性骨折则超过15%[2]，甚至达到30%[3]。不同部位的骨折感染发生率也略有不同，MACIEJCZAK等[4]研究发现脊柱内固定术后感染发生率在2%-5%之间；人工髋关节置换术后感染率为0.5%-3%，近年有增高的趋势，2012年NARA数据显示，自1999年以来人工髋关节置换术后感染风险增高了0.6倍[5]。总之各种内固定术后感染发生率较高，对于临床医生来说早期诊断及治疗都是一个很棘手的问题，加之感染复发率高，使病情发展为慢性骨髓炎等情况，显著增加了致残率、致死率[6]。
目前认为内固定术后感染主要有软组织感染和骨髓炎两种形式[7]。由于细菌生物膜的形成[8]，增加了对内固定术后感染治疗的困难性。临床上内固定术后引起的骨髓炎经常反复发作，目前对于内固定术后感染，一般认为应该早期取出内固定物，完全清除病灶和消灭细菌繁殖条件。但最近也有学者指出，感染对骨折的影响具有两面性，重度感染可造成局部组织坏死，影响骨折愈合；另一方面，当感染得到合理控制后，一定程度的感染能刺激局部组织增生而有助于骨折愈合[9-10]。因此在急性期时，如果患者内固定稳定，建议加强抗感染治疗，反复复查感染指标，如局部及全身感染得到有效控制可暂时考虑保留内固定，否则的话及早去除[11]。也有报道提示，在内固定术后感染早期保留内固定的情况下，通过灌注冲洗次氯酸[12]、碘伏等药物不仅可以治疗内固定术后感染，也有助于骨折愈合并减少患者再手术率[13]。
研究内固定术后感染细菌生物膜形成的治疗方法，建立有效的动物模型是研究的基础和关键。1998年，GRACIA等[14]为了研究抗生素对生物膜内细菌的作用，成功建立了鼠模型。近年WILLIAMS等[15]使用涂有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的钢板建立了羊胫骨近端开放性骨折动物模型。褚立涛等[16]通过兔胫骨开放骨折、断端菌液注射和小夹板外固定也成功建立了兔胫骨创伤后骨髓炎模型。这些相关研究大多研究的不是感染早期而是出现慢性骨髓炎后的动物模型，且没有提供一种可用不同药液进行灌注冲洗的方法，与临床感染的早期处理有明显差异。使用灌注冲洗的方法不仅可使药物直达患处，还可以冲刷死腔，彻底消灭微生物，反复冲洗可以清除坏死组织、促进肉芽组织生长。此次实验建立一种模拟内固定术后早期感染细菌生物膜形成且可用不同药物进行灌注冲洗的动物模型，评价不同冲洗液的效果，为内固定术后早期感染治疗提供了新的技术平台。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物自身对照实验。
1.2 时间及地点实验于2022年4-5月在暨南大学实验动物中心动物室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选用新西兰兔6只，一两岁龄，雌雄各半，体质量2.2-2.6 kg，由广东省医学实验动物中心(三水基地)提供，动物合格号：SCXK(粤)2019-0035。实验基地在暨南大学实验动物中心动物室，实验动物使用许可证号：SYXK (粤)2017-0174，所有动物接受标准实验饲养，保持饲养室温度为16-26 ℃和40%-70%相对湿度。实验得到暨南大学实验动物伦理委员会审核，批准编号：IACUC-20211125-04。
1.3.2 实验仪器和材料微型骨科接骨板(TA3，总长236.5 mm，宽5.0 mm，厚1.8 mm，常州市嘉锦医疗科技有限公司)；江扬一次性引流装置(扬州江扬特种橡塑制品有限公司)；场发射扫描电子显微镜(ZEISS，Ultra-55)；多功能酶标仪(TECAN，SPARK)；铜绿假单胞菌(编号：ATCC 9027，上海沪峥生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细菌毒株与带菌接骨板的制作在血琼脂板上接种铜绿假单胞菌，置于37 ℃恒温培养箱中孵育24 h后取出，以接种环无菌挑取单个菌落至15 mL氯化钠肉汤培养液中，置于37 ℃恒温摇菌箱中孵育18 h，调整细菌浓度到1×107 CFU/mL。将总长236.5 mm、宽5.0 mm、厚1.8 mm的接骨板切割为0.5 cm长度左右，再分别置于细菌悬液中，继续恒温摇菌箱中孵育18 h。接骨板做了随机抽取样本做鉴定，培养未见其他细菌。

1.4.2 内固定术后早期感染灌注冲洗动物模型的建立 6只新西兰兔适应饲养1周后，耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，切开双侧大腿皮肤，分离肌肉层到达股骨表面，用电钻直径1.5 mm克氏针在骨头上钻孔4个，将成功定植铜绿假单胞菌的接骨板随机植入一侧股骨处(实验组)，另一侧大腿股骨植入空白接骨板(空白对照组)，接骨板放置接触骨膜位置。留置2根引流管，一个作为“入口”，另一个作为“出口”，取生理盐水从“入口”注射，待引流管口出现将要“溢出”视为死腔全部填充满，立刻停止注射并夹闭“出口”，模拟灌注后保留浸泡30 min后再进行冲洗，伤口缝合固定。动物正常喂食、自由饮水，观察5 d，每天使用次氯酸溶液消毒伤口。内固定术后早期感染灌注冲洗动物模型的建立过程，见图1。

造模后兔子出现患肢活动不便，术后可出现体温升高等现象；引流液细菌培养可见菌落呈灰白色，菌落周围有黄绿色水溶性色素；结晶紫染色可见接骨板染色为紫色，酶标仪A570 nm范围在0-3之间；扫描电镜可见接骨板表面菌落生物的生成，高倍镜下可见细菌生物膜。以上为内固定术后早期感染动物模型成功建立的标准。
1.5 主要观察指标
1.5.1 临床观察从造模后第1天起，每天观察记录动物精神和饮食情况，早9：00测量并记录动物体温(肛温)，观察伤口情况。
1.5.2 引流液细菌培养
增菌培养：将1∶10样品稀释液10 mL加入90 mL SCDLP液体培养基中，在37 ℃下培养18-24 h，如果有铜绿假单胞菌，则培养液基面上薄菌膜较多、培养液呈黄绿色。
分离培养：采集培养物，在选择性营养琼脂平板培养基上划线接种，在37 ℃培养18-24 h，观察培养基的菌落形态及颜色。培养基配制和培养方法参照《GB/T 7918.4-1987化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌》。

1.5.3 结晶紫染色观察给药第5天结束后，从动物左右腿各取1块接骨板，以生理盐水冲洗2次，吸弃生理盐水，周围室温干燥下加入99%甲醇固定，吸引甲醇废弃，然后加入2%结晶紫溶液染色5 min，吸引结晶紫染液废弃，加入1 mL 33%乙酸溶解，混合；取96孔酶标板，每孔加入200 μL，每个样本制作3个复孔，酶标仪检测A570 nm值，观察染色结果。

1.5.4 扫描电镜观察给药第5天结束后，从动物左右腿各取1块接骨板，生理盐水冲洗2次，于2.5%戊二醛中固定，保存在4 ℃冰箱。用PBS漂洗3次，每次15 min。将1%锇酸固定液在室温下固定1 h左右，乙醇梯度脱水，体积分数50%，70%，85%，95%，100%各15 min。采用零界点干燥法干燥标本，将样品粘接在样品台上，用离子溅射装置镀膜，根据ZEISS Ultra-55型扫描电子显微镜进行多个放大倍率、多区域扫描，观察接骨板表明菌落形态。

讨论

内固定术后感染因素复杂，早期诊断重要但不易。许多研究证实，高龄、酗酒、吸烟、糖尿病、肥胖等是骨折内固定术后感染的好发因素[17]；同时，骨折类型、手术时间、住院时间、清创时间、术后引流、术中出血量以及外科医生操作水平也是内固定术后感染的影响因素[18-24]。邱双玲等[25]研究表明，骨折分度为Ⅲ度、受伤至医院就诊时间> 6 h、创口遗留死腔也是术后创口感染的危险因素。内固定术后早期感染不仅诊断困难、治疗也比较棘手，如果感染不能及时有效控制很容易发展成为慢性骨髓炎甚至截肢等[26]。总之，内固定术后感染影响因素及并发症多、后果严重，因此早期诊断及治疗显得尤为重要。
在临床上内固定术后感染的早期诊断、早期治疗是工作的重点和难点，其早期诊断主要通过临床症状以及实验室检查来评估，比如出现发热、疼痛、皮肤发红、伤口愈合障碍和伤口分泌物等情况，实验室检查中患者的白细胞计数、血沉、C-反应蛋白的增高、血清降钙素原等也是诊断患者处于感染的敏感指标。有研究表明，C-反应蛋白、血浆降钙素原不仅可作为判断内固定术后感染的重要检测指标，而且他们联合检测可提高诊断特异性[27]。由于临床早期感染表现较早，骨侵蚀与破坏在感染后的10-21 d才能表现出来，因此，影像学检查的作用很小[28-29]，所以临床上有丰富经验的临床医生查房时常常通过观察患者伤口情况及定期复查实验室指标及时作出相对应的措施。对内固定术后感染的患者，若感染诊断明确，主要依赖抗生素及早期清创和灌注冲洗，应立即应用足量敏感抗生素治疗，对尚无药敏结果者应该首先使用广谱、高效、足量抗生素治疗，并同时行药敏实验；应密切关注患者体温以及伤口情况，若两三天内症状无明显改善甚至加重或者切口周围已出现波动感时，立即行切口清创术并放置灌注冲洗管冲洗，术后继续使用全身敏感性抗生素，手术切口用敏感抗生素溶液冲洗等方法[30]。
临床上发现，即使对有内固定物伤口进行积极的处理，但由于细菌生物膜的存在感染复发率仍很高。抗生素治疗细菌感染失败的主要原因是细菌生物膜引起的抗菌药物耐药性通常是游离菌的10-1 000倍[31]。细菌生物膜的形成包括：起始的附着、细胞与细胞之间的吸附与增殖、生物膜的成熟、细菌的脱离过程等4个阶段[32]，这4个阶段是一个循环往复的过程，其中关键的第一步是细菌通过特定的黏素蛋白识别宿主表面受体完成黏附[33]。细菌生物膜耐药机制复杂，且不同机制之间存在协同作用，主要有：①透过屏障：细菌分泌的胞外聚合物形成天然屏障，阻碍抗菌药物的使用效果[34]；②微环境改变：菌膜中营养物质含量和氧气浓度等均自外向内减少，影响抗生素本身的杀菌能力[35]；③表型变更：为了适应环境，细菌出现了耐受多种抗生素的持留菌[36-37]；④基因平行转移：菌膜内细菌通过质粒的接合完成基因的水平转移和吸收[38]。所以从机制分析，细菌生物膜的预防有以下几点：一是有效清创，尽早从伤口床去除坏死或失活组织，清除细菌赖以生存的基床[39]；二是及时应用抗菌敷料和抗生素；三是结合负压封闭引流技术改善伤口组织血供[40]，改善伤口愈合的微环境，有助于抑制生物膜的形成。
因此，为了探索不同药物灌注冲洗对生物膜形成后的冲洗效果，建立一个内固定术后早期感染生物膜形成灌注冲洗的动物模型显得尤为重要。1998年，GRACIA等[14]为了研究抗生素对生物膜内细菌的作用，成功建立鼠动物模型。近年，WILLIAMS等[15]使用涂有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜钢板建立了羊胫骨近端的开放性骨折动物模型。褚立涛等[16]通过造成兔胫骨开放骨折、断端菌液注射和小夹板外固定也成功建立兔胫骨创伤后骨髓炎的动物模型。
然而，上述动物模型都未真正模拟内固定术后早期感染，大多都是模拟骨髓炎形成后的状态，且没有提供不同药物灌注冲洗的方法，而临床上大多是当患者出现术区疼痛加重、周围皮肤发红、复查血象升高等情况后，管床医生为避免出现慢性骨髓炎等严重后果，进行加强抗生素等级、对术腔进行灌注冲洗等治疗，所以，以往的动物模型与临床上医生在内固定术后感染的早期处理差距较大。此次研究的创新性在于：建立更加贴近临床的内固定术后早期感染细菌生物膜形成并可用不同药物灌注冲洗的动物模型，不仅可以使用通过灌注冲洗碘伏这些常用的药液，还可以探索一些新药物对内固定术后感染早期处理的效果，为临床的诊治提供了新方向。此次实验中，新西兰大白兔术后第2-4天出现体温升高，其后恢复正常，为体温系动物特有表现，与人不同，不能作为全身感染标准。由于某些条件限制，并没有用炎症指标进行对比。实验组在不同时间的引流液细菌培养中可以看出菌落生成，结晶紫染色呈紫色提示存在细菌，扫描电镜高倍镜下可见“磨菇状”结构之间有水通道，是典型的细菌生物膜结构，证实了这种造模方法成功模拟了内固定术后细菌生物膜形成的状态，且实验贴近临床、对兔子的创伤少、对全身状况影响也少、对动物术后活动等生理活动影响不大，体现了可行、实用、合理的特点。实验中留置2根引流管，一个“入口”，一个“出口”，待引流管口出现将要“溢出”视为死腔全部填充满，立刻停止注射并夹闭“出口”，模拟灌注后保留浸泡30 min后再进行冲洗。后期可以通过该动物模型使用不同药物灌注浸泡后冲洗，寻找治疗内固定术后细菌生物膜形成的新方法。
综上所述，此次研究通过将定植铜绿假单胞菌的接骨板与空白接骨板分别植入双侧大腿股骨钻孔周围位置，留置2根引流管，分别作“入口”和“出口”，可进行不同药物灌注浸泡后冲洗，引流液细菌培养、结晶紫染色酶标仪检测、扫描电镜检查证实造模成功。这种方法方便可行，可为内固定术后早期感染生物膜形成的治疗提供新的技术平台。不足之处在于研究样本量偏小、没有进行数据统计分析。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

构建内固定术后早期感染细菌生物膜形成灌注冲洗的动物模型

Construction of an animal model for treating early postoperative infected bacterial biofilms by irrigating after internal fixation

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