有氧运动干预慢性肾功能衰竭模型大鼠的肾脏纤维化

doi:10.12307/2023.421

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (20): 3209-3215.doi: 10.12307/2023.421

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

有氧运动干预慢性肾功能衰竭模型大鼠的肾脏纤维化

刘芃1，马刚2，何瑞波2，彭朋2

1广西财经学院，广西壮族自治区南宁市 530003；2中国人民武装警察部队后勤学院卫生勤务系，天津市 300309

收稿日期:2022-02-28 接受日期:2022-07-09 出版日期:2023-07-18 发布日期:2022-11-19
通讯作者: 彭朋，博士，讲师，中国人民武装警察部队后勤学院卫生勤务系，天津市 300309
作者简介:刘芃，男，1975年生，广西壮族自治区北流市人，2011年北京体育大学毕业，硕士，副教授，主要从事运动健康促进方向的研究。
基金资助:
天津市自然科学基金项目(17JCYBJC27400)，课题名称：不同运动方式对自发性高血压大鼠心脏肥大的作用及机制，项目负责人：彭朋
引用本文：刘芃，

Effect of aerobic exercise on renal fibrosis in rats with chronic renal failure

Liu Peng1, Ma Gang2, He Ruibo2, Peng Peng2

1Guangxi University of Finance and Economics, Nanning 530003, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Health Service, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309, China

Received:2022-02-28 Accepted:2022-07-09 Online:2023-07-18 Published:2022-11-19
Contact: Peng Peng, MD, Lecturer, Department of Health Service, Logistics University of Chinese People’s Armed Police Forces, Tianjin 300309, China
About author:Liu Peng, Master, Associate professor, Guangxi University of Finance and Economics, Nanning 530003, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Tianjin, No. 17JCYBJC27400 (to PP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

有氧运动：是指全身主要肌群参与的、持续时间较长、以有氧代谢提供运动中所需能量的运动方式，对改善心血管疾病、代谢性疾病等慢性非传染性疾病具有一定疗效。
肾素-血管紧张素系统：是由一系列肽类激素及相应酶组成的重要体液调节系统，其主要功能是调节和维持人体血压及水、电解质的平衡，维持人体内环境的相对稳定。

背景：肾脏纤维化是慢性肾功能衰竭的主要特征与基本病理生理学变化，其中局部肾素-血管紧张素系统稳态失衡造成的胶原代谢异常可能起关键作用。有氧运动是防治各种类型组织纤维化的重要非药物手段，但其对肾脏纤维化的作用及机制尚未明确。
目的：阐明规律有氧运动对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏纤维化的影响，并探讨胶原代谢通路及肾素-血管紧张素系统在其间的作用机制。
方法：45只6周龄雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型安静组和模型运动组(n=15)，后两组利用5/6肾切除术制作慢性肾功能衰竭模型，假手术组和模型安静组于鼠笼内安静饲养，模型运动组进行18周跑台有氧运动训练(60 min/d，5 d/周)。运动训练结束后，利用无创血压仪测定尾动脉血压，代谢笼收集尿液测定24 h蛋白尿，心脏取血检测血清尿素氮和血清肌酐水平，采用PAS染色和Masson染色进行肾脏组织病理学观察并获取肾小球硬化指数和纤维化指数，取肾组织采用免疫印迹法测定Ⅰ型胶原、转化生长因子β1、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、金属蛋白酶组织抑制物1以及血管紧张素原、肾素、肾素受体、血管紧张素转换酶、血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 1型受体、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体蛋白表达量，明胶酶谱法检测肾脏基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9活性。
结果与结论：①与模型安静组比较，模型运动组血压降低、肾功能提高(P < 0.05)；肾小球硬化指数和肾脏纤维化指数降低(P < 0.05)；肾脏Ⅰ型胶原、转化生长因子β1、金属蛋白酶组织抑制物1、血管紧张素原、肾素、血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白表达量降低(P < 0.05)；基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9、血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体蛋白表达量上调(P < 0.05)；基质金属蛋白酶2/金属蛋白酶组织抑制物1比值、基质金属蛋白酶9/金属蛋白酶组织抑制物1比值和基质金属蛋白酶2活性升高(P < 0.05)；②提示长期有氧运动能够减轻5/6肾切除所致的大鼠肾脏纤维化并延缓肾功能衰竭进程，其机制可能与恢复肾素-血管紧张素系统稳态失衡、进而改善胶原代谢有关。

https://orcid.org/0000-0002-8519-3192(刘芃)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 有氧运动, 慢性肾功能衰竭, 肾脏纤维化, 细胞外基质, 肾素-血管紧张素系统

Abstract: BACKGROUND: Renal fibrosis is the main characteristic and basic pathophysiological change of chronic renal failure, in which local imbalance of renin-angiotensin system homeostasis induced abnormal collagen metabolism may play a key role. Aerobic exercise is an important non-drug method for the prevention and treatment of various types of tissue fibrosis; however, its effect and mechanism on renal fibrosis have not been clarified.
OBJECTIVE: To elucidate the effect of regular aerobic exercise on renal fibrosis in a rat model of chronic renal failure and to explore the mechanism of collagen metabolic pathway and renin-angiotensin system.
METHODS: Forty-five 6-week-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, model sedentary group, and model exercise group, with 15 rats in each group. Animal models of chronic renal failure were established by 5/6 nephrectomy in the latter two groups. The sham and model sedentary groups were caged and fed quietly, while the model exercise group received 18 weeks of treadmill aerobic exercise training (60 minutes a day, 5 days per week). After exercise, caudal artery blood pressure was measured by non-invasive sphygmomanometer; urine was collected from metabolic cage for 24-hour proteinuria measurement; and blood sample was taken from the heart to detect serum urea nitrogen and serum creatinine. Renal histopathology was observed by periodic acid–Schiff and Masson staining, and glomerular sclerosis index and fibrosis index were obtained. Protein expression of type I collagen, transforming growth factor-β1, matrix metalloproteinase-2, matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor of metalloproteinase-1, angiotensinogen, renin, renin receptor, angiotensin converting enzyme, angiotensin converting enzyme 2, angiotensin II type 1 receptor, angiotensin II type 2 receptor, and Mas receptor in kidney tissue was determined by western blot. The activity of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 in kidney tissue was detected by gelatin zymography.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model sedentary group, in model exercise group, blood pressure was decreased and renal function was improved (P < 0.05), glomerulosclerosis index and renal fibrosis index values were reduced (P < 0.05), the protein expressions of type I collagen, transforming growth factor-β1, tissue inhibitor of metalloproteinase-1, angiotensinogen, renin, angiotensin converting enzyme and angiotensin II type 1 receptor were downregulated (P < 0.05), the protein expression of matrix metalloproteinase-2, matrix metalloproteinase-9, angiotensin converting enzyme 2, angiotensin II type 2 receptor, and Mas receptor was upregulated (P < 0.05), the ratio of matrix metalloproteinase-2/tissue inhibitor of metalloproteinase-1, the ratio of matrix metalloproteinase-9/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and the activity of matrix metalloproteinase-2 in kidney tissue were increased (P < 0.05). To conclude, long-term aerobic exercise can alleviate renal fibrosis and delay the progression of renal failure induced by 5/6 nephrectomy in rats, and the mechanism may be related to the restoration of renin-angiotensin system homeostasis imbalance and improvement of collagen metabolism.

Key words: aerobic exercise, chronic renal failure, renal fibrosis, extracellular matrix, renin-angiotensin system

中图分类号:

刘芃, 马刚, 何瑞波, 彭朋. 有氧运动干预慢性肾功能衰竭模型大鼠的肾脏纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3209-3215.

Liu Peng, Ma Gang, He Ruibo, Peng Peng. Effect of aerobic exercise on renal fibrosis in rats with chronic renal failure[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(20): 3209-3215.

图/表（结果） 12

2.1 实验动物数量分析实验过程中由于造模失败、死亡、拒跑等原因，共剔除8只大鼠，因此最终纳入统计的样本量n=37，各组样本量分别为假手术组15只，模型安静组12只，模型运动组10只。
2.2 各组血压水平比较与假手术组比较，模型安静组收缩压、舒张压和平均动脉压均升高(P < 0.05)；与模型安静组比较，模型运动组收缩压、舒张压和平均动脉压降低(P < 0.05)。见表1。

2.3 各组肾功能比较与假手术组比较，模型安静组24 h尿蛋白、血清尿素氮和血清肌酐水平均升高(P < 0.05)；与模型安静组比较，模型运动组24 h尿蛋白、血清尿素氮和血清肌酐水平下降(P < 0.05)。见表2。

2.4 各组肾脏组织病理学观察 PAS染色以及肾小球硬化指数见图1，2。假手术组肾小球形态和肾小管结构完整；模型安静组肾小球基底膜增厚，肾小球萎缩，肾小管上皮细胞水肿坏死，管腔扩张或萎缩，间质增厚，肾小球硬化指数明显高于假手术组(P < 0.05)；模型运动组肾小球和肾小管的病变程度减轻，肾小球硬化指数较模型安静组下降(P < 0.05)。

Masson 染色和肾脏纤维化指数见图3，4。假手术组间质胶原分布稀疏，着色较淡；模型安静组肾小球、肾小管周围组织排列紊乱且蓝色深染胶原纤维增多，肾脏纤维化指数显著高于假手术组(P < 0.05)；模型运动组纤维化程度明显减轻，肾脏纤维化指数较模型安静组下降(P < 0.05)。

2.5 各组肾脏胶原代谢因子蛋白表达量及酶活性比较与假手术组比较，模型安静组Ⅰ型胶原、转化生长因子β1、MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白表达量升高(P < 0.05)，MMP-2/TIMP-1比值、MMP-9/TIMP-1比值和MMP-2活性降低(P < 0.05)；与模型安静组比较，模型运动组Ⅰ型胶原、转化生长因子β1和TIMP-1蛋白表达量降低(P < 0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表达量、MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比值以及MMP-2活性升高(P < 0.05)，见图5-7。各组均未检测到MMP-9活性。

2.6 各组肾脏RAS各组分蛋白表达量比较与假手术组比较，模型安静组血管紧张素原、肾素、肾素受体、血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白表达量升高(P < 0.05)，血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体蛋白表达量降低(P < 0.05)；与模型安静组比较，模型运动组血管紧张素原、肾素、血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白表达量降低(P < 0.05)，血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体蛋白表达量升高(P < 0.05)，见图8，9。

参考文献

[1] DJUDJAJ S, BOOR P. Cellular and molecular mechanisms of kidney fibrosis. Mol Aspects Med. 2019;65:16-36.
[2] MENN-JOSEPHY H, LEE CS, NOLIN A, et al. Renal interstitial fibrosis: an imperfect predictor of kidney disease progression in some patient cohorts. Am J Nephrol. 2016;44(4):289-299.
[3] MÜLLER-ORTIZ H, PEDREROS-ROSALES C, VERA-CALZARETTA A, et al. Exercise training in advanced chronic kidney disease. Rev Med Chil. 2019;147(11):1443-1448.
[4] VILLANEGO F, NARANJO J, VIGARA LA, et al. Impact of physical exercise in patients with chronic kidney disease: Sistematic review and meta-analysis. Nefrologia (Engl Ed). 2020;40(3):237-252.
[5] PEI G, TANG Y, TAN L, et al. Aerobic exercise in adults with chronic kidney disease (CKD): a meta-analysis. Int Urol Nephrol. 2019;51(10): 1787-1795.
[6] KOHZUKI M, KAMIMOTO M, WU XM, et al. Renal protective effects of chronic exercise and antihypertensive therapy in hypertensive rats with chronic renal failure. J Hypertens. 2001;19(10):1877-1882.
[7] LU H, KANAZAWA M, ISHIDA A, et al. Combination of chronic exercise and antihypertensive therapy enhances renoprotective effects in rats with renal ablation. Am J Hypertens. 2009;22(10):1101-1106.
[8] KANAZAWA M, KAWAMURA T, LI L, et al. Combination of exercise and enalapril enhances renoprotective and peripheral effects in rats with renal ablation. Am J Hypertens. 2006;19(1):80-86.
[9] TUFESCU A, KANAZAWA M, ISHIDA A, et al. Combination of exercise and losartan enhances renoprotective and peripheral effects in spontaneously type 2 diabetes mellitus rats with nephropathy. J Hypertens. 2008;26(2):312-321.
[10] 付常喜, 马刚, 李平, 等. 不同强度运动对自发性高血压大鼠肾脏纤维化的影响及作用机制研究[J]. 首都体育学院学报,2021,33(6): 638-648.
[11] 李爽, 李艳波, 师雅, 等. 糖尿病肾脏疾病中转化生长因子β作用机制的研究进展[J]. 中国糖尿病杂志,2021,29(12):941-944.
[12] 朱晓婷, 陈志强. 益气化湿通络方对实验性肾功能衰竭大鼠肾脏氧化应激损伤及纤维化的改善作用[J], 中国应用生理学杂志,2020, 36(1):67-72.
[13] BASSIOUNI W, ALI M, SCHULZ R. Multifunctional intracellular matrix metalloproteinases: implications in disease. FEBS J. 2021;288(24): 7162-7182.
[14] CABRAL-PACHECO GA, GARZA-VELOZ I, CASTRUITA-DE LA ROSA C, et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases. Int J Mol Sci. 2020;21(24):e9739.
[15] FU W, WANG Y, JIN Z, et al. Losartan alleviates renal fibrosis by down-regulating HIF-1α and up-regulating MMP-9/TIMP-1 in rats with 5/6 nephrectomy. Ren Fail. 2012;34(10):1297-1304.
[16] 刘菁, 曾筱茜, 程一鸣, 等. 肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂相关联合用药策略的降压疗效及肾脏保护作用[J]. 中国实用内科杂志,2019,39(5):470-473.
[17] PAZ OCARANZA M, RIQUELME JA, GARCÍA L, et al. Counter-regulatory renin-angiotensin system in cardiovascular disease. Nat Rev Cardiol. 2020;17(2):116-129.
[18] YOSYPIV IV. Renin-angiotensin system in mammalian kidney development. Pediatr Nephrol. 2021;36(3):479-489.
[19] PANDEY A, GAIKWAD AB. AT2 receptor agonist Compound 21: a silver lining for diabetic nephropathy. Eur J Pharmacol. 2017;815:251-257.
[20] ISHIGAKI S, OHASHI N, MATSUYAMA T, et al. Melatonin ameliorates intrarenal renin-angiotensin system in a 5/6 nephrectomy rat model. Clin Exp Nephrol. 2018;22(3):539-549.
[21] 付常喜, 李平, 秦永生, 等. 有氧运动抑制自发性高血压大鼠肾脏纤维化[J]. 现代预防医学,2020,47(13):2421-2425.
[22] 朱政, 付常喜, 马文超, 等. 有氧运动调控自发性高血压模型大鼠心脏重塑的机制[J]. 中国组织工程研究,2022,26(14):2231-2237.
[23] MEDEIROS RF, GAIQUE TG, BENTO-BERNARDES T, et al. Aerobic training prevents oxidative profile and improves nitric oxide and vascular reactivity in rats with cardiometabolic alteration. J Appl Physiol (1985). 2016;121(1):289-298.
[24] 孙旗, 徐琳, 叶朝阳, 等. 肾衰Ⅱ号方对5/6(A/I)肾切除慢性肾功能衰竭大鼠促红细胞生成素及铁调素25蛋白表达的影响[J]. 中华中医药杂志,2020,35(3):1512-1515.
[25] LU JR, HAN HY, HU J, et al. Mechanism research of Bu-Shen-Huo-Xue formula against renal fibrosis in rats with 5/6 nephrectomy via E-cadherin, α-SMA, and TGF-β1. Clin Nephrol. 2018;90(1):53-58.
[26] YANG DC, MA ST, TAN Y, et al. Imbalance of matrix metalloproteinases/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and loss of fibronectin expression in patients with congestive heart failure. Cardiology. 2010; 116(2):133-141.
[27] CHOI SY, CHANG HJ, CHOI SI, et al. Long-term exercise training attenuates age-related diastolic dysfunction: association of myocardial collagen cross-linking. J korean med sci. 2009;24(1):32-39.
[28] JOHNSON TS, HAYLOR JL, THOMAS GL, et al. Matrix metalloproteinases and their inhibitions in experimental renal scarring. Exp Nephrol. 2002; 10(3):182-195.
[29] SAMADI M, SHIRPOOR A, AFSHARI AT, et al. Chronic ethanol ingestion induces glomerular filtration barrier proteins genes expression alteration and increases matrix metalloproteinases activity in the kidney of rats. Interv Med Appl Sci. 2018;10(3):171-177.
[30] TAKAMIYA Y, FUKAMI K, YAMAGISHI S, et al. Experimental diabetic nephropathy is accelerated in matrix metalloproteinase-2 knockout mice. Nephrol Dial Transplant. 2013;28(1):55-62.
[31] DILAURO M, ZIMPELMANN J, ROBERTSON SJ, et al. Effect of ACE2 and angiotensin-(1-7) in a mouse model of early chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 2010;298(6):F1523-1532.
[32] AGARWAL D, ELKS CM, REED SD, et al. Chronic exercise preserves renal structure and hemodynamics in spontaneously hypertensive rats. Antioxid Redox Signal. 2012;16(2):139-152.
[33] CIAMPONE S, BORGES R, DE LIMA IP, et al. Long-term exercise attenuates blood pressure responsiveness and modulates kidney angiotensin II signalling and urinary sodium excretion in SHR. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2011;12(4):394-403.
[34] VAZIRI ND, BAI Y, NI Z, et al. Intra-renal angiotensin II/AT1 receptor, oxidative stress, inflammation, and progressive injury in renal mass reduction. J Pharmacol Exp Ther. 2007;323(1):85-93.
[35] OUDIT GY, LIU GC, ZHONG J, et al. Human recombinant ACE2 reduces the progression of diabetic nephropathy. Diabetes. 2010;59(2):529-538.

引言

肾脏纤维化是慢性肾脏病的主要病理特征，也是慢性肾脏病发展至尿毒症的共同途径[1]。调查发现，与肾小球硬化相比，肾脏纤维化与慢性肾脏病患者肾功能下降和预后的关系更为密切[2]。多项临床试验表明，中等强度运动可以改善慢性肾脏病患者的肾功能[3-5]。动物实验显示规律中等强度运动对慢性肾脏病模型大鼠具有肾脏保护作用[6-9]。然而，课题组前期以自发性高血压大鼠为实验动物的研究发现，18周高强度跑台运动加重自发性高血压大鼠肾脏纤维化[10]。上述研究表明，有氧运动对慢性肾功能衰竭大鼠模型具有肾脏保护作用，然而其具体分子机制尚不清楚。
转化生长因子β1可刺激促纤维化细胞因子表达上调，增强各种组织中细胞外基质(主要成分为胶原)的合成[11]。转化生长因子β1是介导肾脏纤维化的主要调控因子，在5/6肾切除的SD大鼠模型中，肾脏转化生长因子β1和Ⅰ型胶原表达量显著增加[12]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一类锌依赖的内肽酶家族，能够对细胞外基质中的各种组分进行蛋白水解[13]。MMPs的活性同时也受到内源性金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的调节[14]。此外，转化生长因子β1可上调TIMPs，参与各种病理过程中的组织重塑和纤维化[14]。动物实验证实，转化生长因子β1、MMP-2、MMP-9和TIMP-1在5/6肾切除大鼠肾脏中的表达量显著上调[15]。
肾素-血管紧张素系统(renin–angiotensin system，RAS)由肾素、血管紧张素原、血管紧张素转换酶、血管紧张素及其受体构成，血管紧张素受体包括血管紧张素Ⅱ1型受体和血管紧张素Ⅱ2型受体2种亚型[16]。血管紧张素转换酶/血管紧张素Ⅱ1型受体与血管紧张素Ⅱ2型受体、血管紧张素转换酶2/Mas受体相互制约并维持动态平衡，共同调节机体的内环境稳态[17]。最近的研究证实，RAS是肾脏纤维化的始动因素，在慢性肾功能衰竭中起关键作用[18]。血管紧张素转换酶/血管紧张素Ⅱ1型受体激活、血管紧张素Ⅱ2型受体和血管紧张素转换酶2/Mas受体受抑可能介导了5/6肾切除大鼠肾脏胶原代谢紊乱(合成增加和/或降解减少)。因此，RAS功能失衡是肾脏纤维化的潜在因素，可导致肾功能衰竭，而抑制血管紧张素转换酶/血管紧张素Ⅱ1型受体或激活血管紧张素Ⅱ2型受体、血管紧张素转换酶2/Mas受体则具有肾脏保护效应[15，19]。然而运动训练是否通过改善RAS稳态失衡抑制肾脏纤维化尚不得而知，因而此次研究采用5/6肾切除术制作慢性肾功能衰竭大鼠模型，旨在阐明规律有氧运动对肾脏纤维化的影响并探讨胶原代谢通路及RAS在其间的作用，揭示运动训练发挥肾脏保护效应的分子机制。作者假设运动训练可改善肾脏RAS失衡，进而通过改变胶原合成和降解代谢而抑制肾脏纤维化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析，多重比较使用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2020年7-12月在武警后勤学院军事训练医学教研室运动生理实验室完成。
1.3 材料 45只6周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量180-200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2018-0027。将大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型安静组和模型运动组(n=15)。模型安静组和模型运动组在无菌条件下行5/6肾切除术制作慢性肾功能衰竭模型[20]，方法为：用0.3%戊巴比妥钠(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后俯卧固定置于手术台上，常规消毒铺巾，从距左脊肋骨1.5 cm处切口暴露左侧肾脏，分离肾周脂肪，静脉夹夹住肾蒂后切除左肾上下极(切除2/3)，以明胶海绵压迫止血10 min后复位肾脏，分层缝合切口。1周后行2期手术，切除整个右侧肾脏。假手术组采取同样步骤，大鼠麻醉后仅暴露肾脏，剥离肾周脂肪后复位缝合。
大鼠饲养环境：温度24-26 ℃，湿度50%-60%，12/12 h光暗周期，分笼(5只/笼)常规饲料喂养，自由进食水。假手术组和模型安静组于鼠笼内安静饲养，模型运动组于术后3周(10周龄)进行18周跑台有氧运动训练。此次研究经广西财经学院伦理委员会审查和批准，批准号：E2021-05-009。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.4 方法
1.4.1 运动方案术后3周，通过测定大鼠最高跑速(即有氧运动能力)确定运动强度，进而制定运动方案。参照课题组建立的方法利用跑台递增负荷力竭运动实验测定大鼠最高跑速[21-22]：起始负荷(即跑台速度)为5 m/min，每2 min递增1.5 m/min，坡度始终为0°，直至力竭。动物力竭标准：用毛刷驱赶(未使用电刺激)仍处于跑台后1/3处超过10次[23]。
模型运动组的训练方案：先进行5 min准备活动，强度为最高跑速的30%；正式训练时，运动强度为最高跑速的60%[21-22]，运动时间为60 min/d(运动时间段为19：00-22：00)，每周训练5 d(周一至周五)，共18周。分别于运动干预的第4，8，12和16周重新测定最高跑速[第4周(17.5±3.8) m/min；第8周(20.5±3.1) m/min；第12周(22.8±4.0) m/min；第16周(25.7±3.3) m/min]以及时调整训练强度。
1.4.2 血压测定与组织取材最后一次训练结束48 h，采用智能无创血压仪(BP-2010E，日本)测定尾动脉血压(收缩压、舒张压和平均动脉压)。大鼠于清醒、安静状态下，尾部加温后将传感器置于尾根部监测血流量变化，当脉冲波形稳定时自动测量血压，重复3次取均值。
血压测定后开始禁食，但允许自由进水。用代谢笼(Columbus CLAMS，美国)持续收集24 h尿液，0 ℃、3 000 r/min离心15 min取上清，迅速转移至-80 ℃低温冰箱冻存待测24 h尿蛋白水平。大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠溶液(35 mg/kg)麻醉并仰卧固定，心脏取血3 mL，0 ℃、3 000 r/min离心15 min取血清，转移至-80 ℃低温冰箱冻存待测血清尿素氮和血清肌酐水平。随后断头处死动物，迅速取出模型安静组和模型运动组左残肾以及假手术组相应的肾组织。将肾组织分为2部分，一部分用40 g/L甲醛溶液固定12 h后经乙醇脱水、二甲苯透明、62 ℃浸蜡、包埋，制作成蜡块后置于4 ℃冰箱保存待进行组织病理学观察；另一部分转移至-80℃低温冰箱冻存待测蛋白表达量。

1.4.3 肾功能测定利用光栅分光光度计(722 型，中国)以双缩脲法检测尿液样本中24 h尿蛋白水平，采用全自动生化分析仪(AU680，美国)以酶法检测血清尿素氮和肌酐水平。严格按照试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)说明进行操作，重复3次取均值。
1.4.4 肾脏组织病理学观察取组织蜡块，用冰冻切片机(RM2255，德国)制作4 µm组织切片，脱蜡后分别进行PAS染色和Masson染色，中性树胶封固。每只动物取5张切片，每张切片随机选取10个不重复视野(×400)，光学显微镜(IX71，日本)下观察肾脏组织病理形态改变情况。PAS染色观察肾小球病理变化，采用半定量法评估肾小球硬化程度。肾小球硬化定义为肾小球毛细血管腔塌陷和/或玻璃样变性，依据肾小球硬化面积占肾小球比例分为0-4级[8]：0级为肾小球基本正常；1级为肾小球硬化面积小于25%；2级为肾小球硬化面积占25%-50%；3级为肾小球硬化面积占50%-75%；4级为肾小球硬化面积大于75%。肾小球硬化指数=[(1n1+2n2+3n3+4n4)/每张切片肾小球总数]×100%，其中n1，n2，n3，n4分别为1，2，3，4级肾小球硬化个数。每张PAS染色切片于高倍镜下随机观察40-60个肾小球来计算。Masson染色后心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色，观察肾脏间质胶原纤维的变化，用图像分析软件(Image Pro Plus 6.0，美国)测量切片中胶原纤维面积占所测视野面积的百分比作为肾脏纤维化指数。
1.4.5 蛋白表达量测定采用免疫印迹法检测肾脏血管紧张素原(1∶1 000，Abcam公司)、肾素(1∶2 000，Santa cruz公司)、肾素受体(1∶1 000，Santa cruz公司)、血管紧张素转换酶(1∶1 000，Abcam公司)、血管紧张素转换酶2(1∶500，Abcam公司)、血管紧张素Ⅱ 1型受体(1∶2 000，Santa cruz公司)、血管紧张素Ⅱ 2型受体(1∶1 000，Santa cruz公司)、Mas受体(1∶1 000，Abcam公司)、转化生长因子β1(1∶1 000，Santa cruz公司)、MMP-2(1∶1 000，Santa cruz公司)、MMP-9(1∶1 000，Santa cruz公司)、TIMP-1(1∶2 000，Santa cruz公司)和Ⅰ型胶原(1∶1 000，Abcam公司)蛋白表达量。

取适量肾组织匀浆后于4 ℃、12 000 ×g离心5 min，取上清，考马斯亮蓝测定总蛋白质浓度。取50 μg蛋白样品在垂直电泳仪上经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转移至聚偏二氟乙烯膜上。加入一抗后4 ℃静置孵育过夜，二抗(武汉博士德生物工程有限公司，1∶5 000)37 ℃孵育2 h。充分洗涤后，使用增强化学发光试剂盒发光成像，凝胶成像系统拍照，图像分析软件(Image Pro Plus 6.0，美国)测定各条带吸光度值。内参蛋白为α-tubulin(1∶10 000，Santa cruz公司)，将目的蛋白吸光度值与α-tubulin的比值作为相对表达量，计算各组各蛋白相对表达量与假手术组的比值作为相对表达率。
1.4.6 MMP-2和MMP-9活性检测采用明胶酶谱法检测肾脏MMP-2和MMP-9活性。组织匀浆后取20 μg蛋白样品在含1 μg/mL明胶的10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，待溴酚蓝到达凝胶底部，在室温下用含2.5% Triton X-100洗涤30 min，考马斯亮蓝R-250染色1 h。弃染色液，用脱色液(含10%乙酸和30%甲醇)在摇床上振荡脱色直到蓝色背景下出现白色条带，即为MMP-2/9。凝胶成像系统拍照，图像分析软件(Image Pro Plus 6.0，美国)定量分析各条带吸光度值。计算各组与假手术组的比值作为相对活性。
1.5 主要观察指标末次训练结束后48 h尾套法测定尾动脉血压；大鼠禁食收集24 h尿液以双缩脲法测定蛋白尿水平；大鼠麻醉后心脏取血以酶法检测血清尿素氮和血清肌酐水平；断头处死动物取肾脏组织，一部分利用PAS染色和Masson染色进行组织病理学观察，另一部分利用免疫印迹法测定Ⅰ型胶原、转化生长因子β1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1以及血管紧张素原、肾素、肾素受体、血管紧张素转换酶、血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 1型受体、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体蛋白表达量，明胶酶谱法检测肾脏MMP-2和MMP-9活性。
1.6 统计学分析采用SPSS软件(版本号20.0，美国SPSS公司)对数据进行统计学分析。实验数据以x±s表示。数据满足正态性和方差齐性时，3组间比较采用单因素方差分析，多重比较使用LSD检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经武警后勤学院生物统计学专家审核。

讨论

此次研究旨在观察规律运动训练对5/6肾切除诱导的慢性肾功能衰竭大鼠肾脏纤维化和RAS的影响，结果发现，18周跑台有氧运动可改善5/6肾切除所致的高血压、蛋白尿、肾功能障碍、肾小球硬化和肾脏纤维化；同时，肾脏组织中Ⅰ型胶原、转化生长因子β1和TIMP-1蛋白表达下调，而MMP-9蛋白以及MMP-2蛋白和活性进一步增加，说明运动训练抑制胶原合成并促进胶原降解；此外，肾脏血管紧张素原、肾素、血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白表达降低，血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体表达升高，提示有氧运动能够改善RAS紊乱。因此，长期有氧运动能够减轻慢性肾功能衰竭大鼠肾脏纤维化进程，其机制可能与恢复RAS稳态失衡并改善胶原代谢有关。
3.1 有氧运动对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏胶原代谢的影响 5/6肾切除可引起全身血压升高，残余肾脏出现肾小球硬化以及间质纤维化，肾功能进行性下降并发生肾功能衰竭[24]，这在此次研究中也得到了证实。既往研究发现，5/6肾切除后慢性肾功能衰竭大鼠肾脏转化生长因子β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、MMP-9和TIMP-1的蛋白表达量随间质纤维化的进展而增加[15, 25]，与此次研究结果一致。模型安静组转化生长因子β1表达上调提示肾脏胶原合成增加，而MMP-2和MMP-9增加似乎说明胶原降解同时增加。YANG等[26]的研究指出，TIMP-1作为MMPs的内源性抑制剂，能够与活化的MMPs结合形成酶-抑制剂复合物，从而抑制MMPs的蛋白水解活性，MMPs与TIMP-1之间的动态平衡(用两者的比值表示)是胶原代谢的决定因素。由于模型安静组TIMP-1显著上调，造成MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比值下降，提示TIMP-1对MMP-2和MMP-9的抑制作用加强，MMP-2活性下降也证实了这一点，进而造成胶原降解减少。总之，5/6肾切除所致肾脏纤维化是胶原合成增加以及降解减少所致。18周运动训练后，模型运动组纤维化指数下降，Ⅰ型胶原、转化生长因子β1和TIMP-1蛋白表达量下调，同时MMP-2和MMP-9蛋白表达量进一步上调，而MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比值以及MMP-2活性下降，提示长期运动能够抑制5/6肾切除术引起的胶原沉积和肾脏纤维化，其机制与胶原合成减少以及分解增加有关。此外，CHOI等[27]的研究还发现，有氧运动能够减少增龄引起的胶原交联，因此运动训练对胶原含量和空间结构均具有有益作用。
值得注意的是，此次研究并未检测到MMP-9活性。JOHNSON等[28]发现，在各种MMPs中，MMP-2是肾脏中最主要的明胶水解酶，其活性在5/6肾切除后增加；同时该研究同样未检测到健康以及5/6肾切除大鼠肾脏中的MMP-9活性。SAMADI等[29]利用酶联免疫吸附法证实，大鼠肾脏中MMP-2的含量较MMP-9高出20倍。TAKAMIYA等[30]利用模型动物以及基因敲除技术发现，MMP-2在糖尿病大鼠的肾小球、近端肾小管和远端肾小管中高表达，敲除MMP-2后糖尿病肾病加重，提示MMP-2对病理状态下的肾脏具有保护效应。结合此次研究结果以及前人的报道，推测MMP-2可能在运动诱导慢性肾功能衰竭大鼠肾脏胶原蛋白降解中发挥重要作用。
3.2 有氧运动对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏RAS的影响既往的研究证实，5/6肾切除诱导的慢性肾功能衰竭大鼠经过运动训练后肾脏纤维化相关因子的变化与氯沙坦(RAS抑制剂)治疗效果相似，提示肾脏局部RAS可能参与了运动对肾脏纤维化的改善作用[15]。肾素通过与肾素受体结合，激活血管紧张素转换酶/血管紧张素Ⅱ 1型受体信号，对维持血压和水电解质平衡等内环境稳态起关键作用，如收缩血管、升高血压、刺激肾上腺皮质分泌醛固酮进而促进肾脏对水和钠离子的重吸收、增加体液容量[17]。RAS通过上调转化生长因子β1和TIMP-1以及抑制MMPs活性导致胶原合成增加、降解减少，最终引发肾脏纤维化[17-18]。因而此次研究进一步评估运动对肾脏RAS各组分的影响，结果发现，5/6肾切除上调血管紧张素原、肾素、肾素受体、血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白表达，下调血管紧张素转换酶2和血管紧张素Ⅱ 2型受体表达，与文献报道一致[20]。关于Mas受体的变化，此次研究发现5/6肾切除降低Mas受体表达量，而在DILAURO等[31]的研究中，小鼠行5/6肾切除术后4周肾脏Mas受体表达量无明显变化。研究结果之间存在差异可能是由于实验中使用的动物种类以及术后时间不同所致。上述结果提示，在5/6肾切除的慢性肾功能衰竭大鼠肾脏中，血管紧张素转换酶-血管紧张素Ⅱ 1型受体系统被激活，血管紧张素Ⅱ 2型受体和血管紧张素转换酶2-Mas受体则被抑制，这可能是肾脏纤维化发生发展的重要机制。
运动对慢性肾功能衰竭时肾脏RAS的影响尚未明确。此次研究证实，运动训练能够阻止5/6肾切除诱导的血管紧张素原、肾素、血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ 1型受体表达上调以及血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体表达下调。先前的研究发现，健康大鼠有氧运动后肾脏RAS各组分并无改变[32]。AGARWAL等[32]证实，自发性高血压大鼠进行16周中等强度跑台运动，肾脏血管紧张素转换酶和血管紧张素Ⅱ 1型受体mRNA表达量下降，血管紧张素转换酶2和Mas受体mRNA表达增加。CIAMPONE等[33]
同样以自发性高血压大鼠为实验模型，结果发现10周游泳训练后肾脏血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白表达降低，但血管紧张素Ⅱ 2型受体表达量却无显著性差异，研究结果存在差异可能与动物模型、运动方式以及运动时间等因素有关。此次研究结果表明，长期规律运动对肾脏的保护作用与抑制血管紧张素转换酶-血管紧张素Ⅱ 1型受体系统以及激活血管紧张素Ⅱ 2型受体和血管紧张素转换酶2-Mas受体系统有关。
另有研究发现，单独服用氯沙坦虽能够下调5/6肾切除诱导的慢性肾功能衰竭大鼠肾脏血管紧张素Ⅱ 1型受体表达，但对血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体表达无显著影响[34]。药理学研究证实，人重组血管紧张素转换酶2或血管紧张素Ⅱ 2型受体激动剂能够使糖尿病肾病小鼠肾功能恢复正常[19，35]，提示血管紧张素转换酶2和血管紧张素Ⅱ 2型受体对慢性肾功能衰竭模型动物具有肾脏保护作用。在此次研究中，运动训练上调了血管紧张素转换酶2、血管紧张素Ⅱ 2型受体和Mas受体蛋白表达，而RAS抑制剂则无此效应。运动训练和RAS抑制剂对肾脏RAS组分的差异性调控结果提示，运动训练联合使用RAS抑制剂可能对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏保护起协同效应，然而这一推测有待进一步证实。
3.3 结论长期有氧运动可减轻大鼠5/6肾切除所致的高血压、蛋白尿、肾功能障碍、肾小球硬化和肾脏纤维化，延缓肾功能衰竭进程，运动训练的降压和肾脏保护作用可能是通过恢复RAS稳态失衡并改善胶原代谢实现的。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

有氧运动干预慢性肾功能衰竭模型大鼠的肾脏纤维化

Effect of aerobic exercise on renal fibrosis in rats with chronic renal failure

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 12

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王继, 张敏, 杨中亚, 张龙. 体力活动干预2型糖尿病肌少症的研究现状[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1272-1277.
[2]	张艳, 何瑞波, 王庆博, 皮亦华, 陆春敏, 徐传仪, 马刚, 彭朋. 不同负荷量有氧运动对肥胖大鼠骨骼肌炎症反应和胰岛素信号途径的影响及机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1237-1244.
[3]	李龙, 李光第, 石豪, 邓柯淇. 环状RNA作为内源性竞争RNA参与调控骨性关节炎的发生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 751-757.
[4]	张业廷, 付燕, 李雪, 魏翠兰, 李垂坤, 袁琼嘉. 有氧运动对阿尔茨海默症小鼠学习记忆及海马神经形态结构的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3188-3194.
[5]	凌华军, 崔瑞文, 王其友. 负载外泌体的3D明胶细胞外基质水凝胶促进皮肤损伤愈合[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1900-1905.
[6]	朱正桓, 邹红军, 宋志文, 刘锦波. 脊髓损伤后神经修复过程中的细胞微环境[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 114-120.
[7]	张皓博, 赵宇楠, 杨学军. 细胞焦亡在椎间盘退变中的作用及治疗意义[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1445-1451.
[8]	税晓平, 李春莹, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病大鼠骨骼肌脑源性神经营养因子、核因子κB及炎症指标的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 669-675.
[9]	陈晓旭, 罗雅馨, 毕浩然, 杨琨. 脱细胞支架制备及其在组织工程和再生医学中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 591-596.
[10]	王康, 智晓东, 张玉强, 龚超, 王晨亮, 王伟. 人羊膜上皮细胞激活EGFR/ERK1信号轴调节关节软骨细胞增殖、凋亡和细胞外基质的合成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(31): 4967-4974.
[11]	付玉, 尚画雨, 李顺昌. 有氧和抗阻运动可缓解2型糖尿病模型大鼠的肝脏炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4666-4671.
[12]	杨椅, 王坤, 刘恒旭, 张庭然, 卢文云, 陈佩杰, 罗炯. 有氧运动对老年轻度认知障碍患者认知功能的改善[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4716-4722.
[13]	阳金鑫, 王坤, 赵静, 陈佩杰, 张庭然, 卢文云, 罗炯. 有氧运动干预对阿尔茨海默患者突触可塑性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4216-4223.
[14]	董丽萍, 罗佳, 李广意, 袁衡. 增龄对大鼠髂总动脉超微结构的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4123-4126.
[15]	刘亚, 刘霞, 邓鹏辉, 季威, 李建平. 运动对糖尿病心肌纤维化大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原及血管紧张素Ⅱ/ 转化生长因子β1/Smad2通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4173-4179.