2.1   实验动物数量分析   36只兔均造模成功，无麻醉及手术意外导致实验动物死亡的情况，仅在造模后14 d对照组中有2只兔取材时因术区粘连严重，取材完毕后无条件结扎股动脉断端，导致出血过多而死亡。术后所有兔精神、肌力及饮食状态恢复良好，36只兔全部纳入结果分析。
2.2   两组兔术后大体观察结果   
2.2.1   术后切口感染及愈合情况   理想的手术切口愈合期间术区不应有红肿及硬结、局部皮温高于健侧或存在异常分泌物渗出等炎症反应情况。实验组中术后7 d有1只兔子术区切口出现红肿并伴有少量血性积液渗出等情况，定为乙级愈合；术后14 d观察到1只兔子术区切口乙级愈合，1只兔子术区切口化脓，定为丙级愈合；其余15只兔术区切口均愈合良好，属于甲级愈合。实验组术区切口感染情况见表2，术区切口愈合等级情况见表3。实验组组内术区切口感染情况及愈合等级情况对比差异均无显著性意义(P > 0.05)。

对照组中术后3，7 d分别有2，1只共计3只兔术区切口愈合良好，无任何感染表现，评定为甲级愈合。对照组中术后3，7，14 d时分别有4，5，6只共计15只兔术区切口出现炎症反应，其中7只术区切口出现红肿并伴不同程度的血性分泌物渗出的情况，但均无化脓表现，愈合情况定为乙级愈合，另外8只术区切口发生了明显的化脓，定为丙级愈合。对照组术区切口感染情况见表2，术区切口愈合等级情况见表3。对照组组内术区切口感染情况对比差异无显著性意义(P > 0.05)，对照组组内术区切口愈合等级情况对比差异有显著性意义(P < 0.05)。

两组之间术区切口感染的动物数量及术区切口愈合等级情况对比存在明显差异，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表2，3。
2.2.2   术后术区股动脉与周围组织粘连情况   结果显示，实验组中术区股动脉组织的粘连程度以0级为主，表现为1级粘连的在术后3个时间节点上各有1只兔，组内无粘连程度表现为3级的兔，见表4。实验组组内粘连程度在术后3，7，14 d上的表现没有明显变化，差异无显著性意义(P > 0.05)。实验组组内术区股动脉组织粘连的兔数量在术后3个时间节点无明显变化，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表5。

对照组中所有兔术区股动脉组织均有不同程度的粘连，且以2级和3级为主，0级粘连程度的动物数量为0。对照组组内粘连程度于术后3，7，14 d逐渐加重，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表4。

术后不同时间节点，两组之间术区股动脉与周围组织粘连程度相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，且实验组整体的粘连程度均轻于对照组，同时实验组中术区粘连的动物数量明显少于对照组(P < 0.05)，见表5。
2.3   两组兔术区股动脉组织苏木精-伊红染色结果    每组各时间选取染色结果满意且具有代表性的1张苏木精-伊红染色切片，共计6张切片进入分析。

未损伤的新西兰大白兔股动脉组织横断面的苏木精-伊红染色结果可见血管内皮细胞均匀地散布于血管管腔内侧，血管内弹力膜层连续无中断，血管内膜层及外膜层完好无损，均质红染的血管平滑肌层位于内膜及外膜层之间，见图3。

术后3 d时，对照组兔股动脉吻合口区域断裂的血管无修复迹象，未见血管内皮细胞生长，内弹力膜层消失，血管中膜平滑肌细胞坏死，纤维结缔组织和血管外膜层结缔组织少许生长。实验组中可见兔股动脉吻合口区域断裂的血管开始修复但不完全，可见部分血管内皮细胞生长，内弹力膜层部分恢复，血管内膜层结构出现，血管中膜平滑肌细胞坏死增殖，纤维结缔组织和血管外膜层结缔组织开始生长，见图4。

术后7 d时，对照组兔股动脉吻合口区域断裂的血管开始修复，可见部分血管内皮细胞生长，内弹力膜层部分恢复，血管内膜层大部分中断，血管中膜平滑肌细胞坏死开始增殖，纤维结缔组织和血管外膜层结缔组织生长明显。而实验组兔股动脉吻合口区域断裂的血管基本修复，血管内皮细胞生长活跃，内弹力膜层大部分恢复，血管内膜层基本连续，仅少部分中断，血管中膜平滑肌细胞逐渐修复，血管中膜、外膜结构恢复良好，界线基本清晰，见图4。

术后14 d时，对照组兔股动脉吻合口区域断裂的血管修复基本完整，血管腔内可见血栓形成，血管腔较为狭窄，血管内皮细胞生长活跃，内弹力膜层大部分恢复，血管内膜层部分是由平滑肌细胞增殖迁移构成，血管中膜平滑肌细胞过度增殖，纤维结缔组织和血管外膜层结缔组织生长明显，血管内膜、中膜、外膜结构紊乱，界线不清。实验组中观察到兔股动脉吻合口区域断裂的血管修复完整，无原有结构异位出现的现象，血管腔内未见血栓形成，无明显狭窄，血管内皮细胞生长良好，血管内弹力膜层基本恢复正常，血管内膜层连续且修复完整，血管中膜平滑肌细胞无过度增殖现象，血管中膜层及外膜层结构原位修复完好且界线清晰，见图4。

总之，苏木精-伊红染色结果显示：对照组中血管内皮细胞开始生长的时间为术后第7天，而实验组中术后第3天就观察到了血管内皮细胞生长现象；同样内弹力膜层开始出现的时间在对照组和实验组中分别为术后第7天和第3天；实验组中血管内皮细胞整体生长情况较对照组更为活跃，实验组血管内膜层的重建更为完善，对照组血管中膜平滑肌细胞坏死、迁移及创伤性过度增殖情况比实验组严重，实验组术后3，7，14 d时血管组织各层结构的恢复情况均优于对照组。
2.4   两组兔术区股动脉组织免疫组织化学染色结果   富血小板纤维蛋白成分中的VEGF、PDGF及转化生长因子β1在组织损伤的修复过程中起着重要作用。实验组与对照组在术后3，7，14 d分别进行VEGF、PDGF及转化生长因子β1的免疫组化实验，结果发现实验组的血管组织管腔结构大体上更加完整，于3个时间节点上均比对照组修复得完好。同时，实验组中3种生长因子所对应的棕色颗粒数量及表达面积均多于对照组，见图5-7。

对于两组生长因子表达量的对比，为了防止主观判断的偏倚，此次研究采取了一种客观的检验方法对比两组中3种生长因子表达水平的差异。两组各时点的6只兔手术取材后，将获得的股动脉组织进行免疫组化实验，所制备的切片置于光学显微镜下观察，选取制备满意的切片放大100倍后进行摄片，最终共计36张图像进入分析。用Image J 1.53e图像处理软件定量分析36张图像中相应生长因子的表达情况，分别得出AOD进行统计学处理。结果显示：实验组3种生长因子表达的水平均高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表6-8。











2.5   富血小板纤维蛋白与宿主的生物相容性   所有实验动物均未发生与自体血液离心制备的富血小板纤维蛋白相关的免疫及排斥反应。

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传统公认的显微血管吻合技术在具体实施中难以避免地会造成血管内皮细胞损伤，从而引起血管吻合口处血栓形成、管腔狭窄及血管生理功能紊乱等严重并发症，极大地影响了显微外科的手术疗效[1]。即便随着人们对显微血管吻合理论知识和实践技巧的不断提升及显微外科器械的日益改善，目前，血管吻合的失败率仍高达10%左右[2-3]。既往的研究大多聚焦于预防和处理血管内皮细胞损伤带来的并发症[4-5]。然而，鲜有对受损的血管内皮细胞进行处置的文献报道。考虑到血管内皮细胞在血管吻合术预后中的重要作用，利用各类生物制剂促进血管吻合术后损伤内皮的修复，有望成为改善显微血管吻合术后临床效果的重要治疗手段。

第2代自体血液浓缩物富血小板纤维蛋白是自体血液离心后得到的一种聚集了全血中大量血小板和白细胞的生物制剂，又被称为自体血小板浓缩物[6]。富血小板纤维蛋白通过其超生理浓度的血小板、白细胞以及承载各类生长因子和细胞的天然三维立体纤维蛋白支架，可有效促进各类软硬组织的修复及再生[7-8]。此外，富血小板纤维蛋白具备生产工艺规范简易、来源于自体且无任何外源性添加剂等优点，已被广泛应用于骨科学、运动医学、口腔医学、皮肤医学及神经医学等各大医学学科领域[9-10]。然而，目前尚缺少富血小板纤维蛋白在显微血管吻合领域的相关报道。

综上，此次研究拟通过建立新西兰大白兔股动脉离断-显微吻合模型，将富血小板纤维蛋白自体生物制剂用于实验动物血管吻合口区域，旨在探索富血小板纤维蛋白对血管吻合术后的影响，从而为显微血管吻合术后吻合口血管栓塞及狭窄的预防和治疗找到新的方向，同时，为提高临床组织修复中血管吻合的成活率提供新的思路和方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，计数资料采用非参数检验中的Mann-Whitney U检验比较两组之间及Kruskal-Wallis H检验比较组内在术后3个时间节点上是否存在差异；计量资料用中位数和上下四分位数M(P25，P75)表示，采用两独立样本的Wilcoxon符号秩和检验，即Mann-Whitney检验来对比两组之间是否存在差异。
1.2   时间及地点   实验于2019年4月至2021年4月在新疆石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   成年(大约6月龄)的健康新西兰大白兔36只，体质量 4.0-4.5 kg，雌雄各半，购自新疆石河子大学医学院实验动物中心，动物批号：045909。所有兔子均在转化医学实验动物房中饲养，单兔单笼，每天喂养2次，每隔12 h喂养一次，实验前6-8 h禁食水，定时打扫兔笼，适时房间消毒及通风换气，房间自然光线充足，室温保持在21-23 ℃，湿度控制在40%-70%。

实验方案经新疆石河子大学医学院第一附属医院伦理委员会批准，批准号：A2019-170-01。实验过程遵循国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   实验用主要材料、试剂   兔血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗体(上海艾博抗，货号ab1316)；兔血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)多克隆抗体(上海艾博抗，货号ab23914)；兔转化生长因子β1多克隆抗体(上海艾博抗，货号ab9758)；通用二步法检测试剂盒(小鼠/兔增强聚合物法检测系统，北京中杉金桥，编号PV-9000)；显微操作器械(宁波市成和显微器械厂)；显微缝合线(强生普理灵聚丙烯不可吸收10-0缝合线，爱惜康有限责任公司，型号：W2790)。
1.4   实验方法   
1.4.1   富血小板纤维蛋白的制备   麻醉后(同1.4.2)抽取兔耳缘静脉血约2 mL，置于无任何添加剂的干燥离心管内，放于离心机中，设置转速3 200 r/min(约400×g离心力)，时间10 min，进行离心，离心完毕后管内分3层，中层淡黄的白色凝胶物即为富血小板纤维蛋白。于无菌操作台上弃去顶层的贫血小板血浆，用镊子小心取出中层的凝胶物，去除其下端的红细胞凝聚物，即可得到新鲜的富血小板纤维蛋白(如制备效果不满意，则舍弃重新制备)，见图1，立即使用。 

1.4.2   实验动物造模及分组

实施动物全身麻醉：对兔子做术前麻醉评估，评估内容包括体质量、一般营养状况、外周血管条件及对刺激的反应能力等。取仰卧位，开放兔耳缘静脉，置入24 G留置针，缓慢静推阿托品(河南润弘制药股份有限公司)0.05 mg，缓慢静推艾思氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司)0.5 mg/kg，枸橼酸芬太尼注射液(宜昌人福药业有限责任公司)按5 μg/kg缓慢静推，用盐酸右美托咪定(扬子江药业集团有限公司)0.5 μg/(kg·h)，微量泵持续泵入；术中全程给予吸氧，并同时监护生命体征；待手术结束，兔子自然苏醒；术后连续2 d观察兔子的精神、饮食及活动情况。

造模过程及分组：36只兔麻醉满意后，取仰卧位，右下肢剃毛备皮，大腿内侧术区消毒，铺设洞巾，沿着腹股沟和大腿内侧纵行切开皮肤，在肌间隙寻找股动脉，分离股动脉，约3 cm，两端用血管夹夹闭，切断股动脉后显微镜下用10-0显微缝合线间断缝合法进行吻合，吻合完毕后通过勒血实验检查血管通畅度，防止手术意外影响实验结果。

36只新西兰兔造模完毕后使用掷硬币法随机分为2组(n=18)，实验组将自体耳缘静脉血离心后所制备的富血小板纤维蛋白凝胶立即涂抹于股动脉吻合口周围；对照组于血管吻合口周围注射同等容量的生理盐水。上述操作成功完毕后碘伏冲洗伤口，逐层关闭切口，无菌敷料包扎固定，术毕，整体操作流程如图2所示。术中及术后连续2 d对术区对侧肢体肌肉注射头孢呋辛钠(深圳立健药业有限公司)预防感染，按100 mg/(kg·d)分3次给药，术后所有兔单独饲养、自然饮食及活动，术区切口术后每天清洁换药一次，同时标记好手术日期，方便后续再次手术及记录结果。两组兔又随机于术后3，7，14 d取材，每亚组各6只。

1.4.3   大体观察   实验周期内记录实验动物存活的情况，观察所有实验动物的精神状态、饮食及活动情况，术后3，7，14 d分别观察两组实验动物手术一侧肢体缺血坏死情况、术区切口感染情况、术区切口愈合情况及术区股动脉与周围组织粘连情况。

根据切口愈合情况分为以下3种：①甲级愈合，是指切口愈合优良，没有不良反应的愈合；②乙级愈合，是指切口愈合欠佳，出现炎症反应，有红肿、硬结、积液等情况，但没有出现化脓症状；③丙级愈合，是指切口化脓，需拆除缝合线或切开引流。甲级愈合伤口定为非感染性切口，乙、丙级愈合伤口定为感染性切口。

按照新西兰大白兔股动脉与其周围组织的解剖关系，结合PHILLIPS等[11]对腹腔粘连程度分类方法，分为0，1，2，3级，数字越大说明粘连越严重，参考刘洋波[12]实验中对小鼠股动脉术后粘连程度的分级，制定如下标准，见表1。

将0级粘连程度定义术区切口无粘连，1-3级粘连程度定义为术区切口粘连。同时对比两组之间及两组组内术区股动脉组织在粘连程度及粘连数量有无差异。
1.4.4   苏木精-伊红染色切片制备   分别于术后3，7，14 d对两组兔再次手术取材，同造模方法显露吻合的股动脉，通过勒血实验检查血管通畅度，再次确保前期手术吻合成功。以吻合口为中心，截取术区股动脉血管长度约0.5 cm，结扎取材后的股动脉断端，于兔耳缘静脉行空气栓塞处死。取材完毕后将离体标本置于甲醛固定液中，脱水透明，浸蜡包埋，切片与贴片，脱蜡，苏木精-伊红染色，中性树胶封固，晾干后置于光学显微镜下观察并分析(选取显微镜下观察到有缝线的切片)。
1.4.5   免疫组化切片制备及观察分析   选取石蜡组织包埋的切片时以苏木精-伊红染色切片为参考，避免选取到吻合口之外的股动脉组织。按照免疫组化染色实验步骤进行烤片、二甲苯脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶活性、滴加一抗(比例1∶200)及二抗(比例1∶200)、DAB溶液显色、苏木精复染、中性树胶封固等操作。将制备完成的切片置于光学显微镜下观察各组切片VEGF、PDGF及转化生长因子β1阳性表达的细胞及部位，对所有制备的切片进行摄片，使用Image J 1.53e专业图像软件在设定统一测量参数下对采集的图像进行定量分析，得到平均光密度值(average optical density，AOD)，该值反映了目标物质的单位面积浓度，对免疫组化图片进行数字图像分析比较时，就是比较它们之间AOD的大小，对各组AOD值进行统计分析，对比两组术区吻合的股动脉组织中VEGF、PDGF及转化生长因子β1表达的特点及规律。
1.5   主要观察指标   术后兔存活的情况；术侧患肢缺血坏死的情况；术区切口感染及愈合的情况；吻合口区域股动脉与周围组织粘连的情况；苏木精-伊红染色实验观察血管组织中血管内皮细胞生长、内弹力膜层修复、内膜完整性、中膜平滑肌细胞坏死、增殖及迁移、外膜基质创伤性增生的情况；免疫组化实验观察吻合口股动脉组织中VEGF、PDGF及转化生长因子β1的表达水平。
1.6   统计学分析   采用SPSS 20.0统计软件进行分析，比较两组术后相关观察指标。术区切口感染、愈合等级及粘连分级应用计数资料表示，采用非参数检验中的Mann-Whitney U检验比较两组之间及Kruskal-Wallis H检验比较组内在术后3个时间节点上是否存在差异。3种生长因子的表达水平为计量资料，用中位数和上下四分位数M(P25，P75)表示，采用两独立样本的Wilcoxon符号秩和检验，即Mann-Whitney检验来对比两组之间是否存在差异。以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经石河子大学医学院第一附属医院生物统计学专家审核。

显微外科的发展依赖于血管吻合技术，理想的血管吻合技术应满足最大限度地减少供区的缺血时间以及对血管壁的损伤，确保血液在管腔内持久而通畅地流动，同时还应便于临床的实际操作以及教学工作的开展[13]。随着人们对组织工程及再生医学的研究，许多新型血管吻合技术不断问世，如血管吻合器法[13]、黏合剂吻合法[14]、血管吻合夹法等[15]，但上述方法对患者病损血管的条件要求苛刻，并强调某种特定的适应证。然而，临床患者病情复杂多样，使得其术后效果差异明显，外加新技术产生的高昂费用，导致这些技术在实际临床工作中难以广泛应用，其科学性也缺少临床实验数据的支持[16]。

显微器械手工间断缝合是目前公认且应用最为广泛的血管吻合技术。但术中不可避免地会损伤血管内皮细胞，导致吻合口处血栓形成、管腔狭窄以及血管舒缩功能障碍等严重术后并发症[4]。根据报道，这些并发症的发生主要围绕血管内皮细胞的损伤为核心，其病理生理学机制包括：①受损的血管内皮细胞释放大量的生长因子和炎性因子，刺激血管中膜平滑肌细胞增殖并向内膜迁移，使得损伤后形成的血管新内膜增厚、管腔狭窄[17-18]；②受损的血管内皮细胞促进血管中膜平滑肌细胞有丝分裂的原癌基因表达明显升高，使得其表型从胞内肌丝丰富、收缩能力强且几乎无分裂增殖能力的收缩型向胞内肌丝含量低、收缩能力弱、分裂增殖能力强且分泌功能旺盛的合成型转变，进而导致血管舒缩功能下降[19-20]；③受损的血管内皮细胞合成抗血栓因子，如一氧化氮、前列环素和组织纤溶酶原激活剂等的能力下降以及血管内皮下胶原暴露，使得血管内血栓形成[1]。总之，血管内皮细胞的损伤是影响血管吻合术后疗效的主要因素。在上述并发症中血管吻合口处血栓形成最为严重，目前临床中的干预措施主要为使用抗血小板、抗凝或溶栓药物如阿司匹林、低分子肝素、链/尿激酶等，但效果不佳且药物不良反应明显[5，21]。此外，这些药物对其他并发症也疗效甚微，当下尚无选用某种合适药物的统一临床共识，极大地影响了手术疗效。

鉴于既往研究的局限性及正常血管内皮细胞的重要性，更多的研究应聚焦于血管内皮细胞的修复。利用细胞因子、干细胞或各类生长因子等生物活性制剂促进血管内皮细胞的修复及再生可能是未来的研究方向，并已经被广泛报道[2，12，22]。

自体血液浓缩物是自体血液离心后得到的一种生物制剂，临床常见的产品有第1代富血小板血浆和第2代富血小板纤维蛋白[23]，其中富血小板纤维蛋白由法国科学家CHOUKROUN等[24]于2000年首次报道。在适宜的条件下，自体血经过一定转速离心后即可获取富血小板纤维蛋白，其含有高浓度的血小板、白细胞以及较为坚韧且立体规则的疏松纤维蛋白网状结构。此类网状结构能够作为细胞生长支架，负责承载、吸附并缓慢释放富血小板纤维蛋白中多种有利于组织修复及再生的干细胞和生长因子[25-26]。因其制备流程规范简单，血小板、白细胞及淋巴细胞富集率高，常见生长因子含量高且降解速率低等优势，富血小板纤维蛋白被认为具有极高的临床应用潜力。

近年来，富血小板纤维蛋白在预防炎症和组织损伤修复中的作用已经被广泛报道[27]。机体软硬组织结构的完整性受到破坏时，作为第一道防线，中性粒细胞及单核巨噬细胞会被招募迁移至受损部位发挥作用[28-30]。研究表明，富血小板纤维蛋白可以在这一过程中调节巨噬细胞的表型转换，加速炎症反应过程，发挥抗炎作用[31]。此外，富血小板纤维蛋白中含有丰富的杀菌蛋白及白细胞释放的多种炎症反应因子，如白细胞介素1、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α等，积极参与抗炎过程[32]。研究者发现，富血小板纤维蛋白的介入明显缓解了SD大鼠口腔软组织缺损局部炎症细胞浸润，并增加了其新生血管的数量，起到缺损修复效果[33]。富血小板纤维蛋白在体外可显著提高软组织愈合标志物的表达水平，徐海燕等[34]在对小鼠背部1.5 cm的圆形全层皮肤损伤创面行富血小板纤维蛋白干预后，其创面愈合速度以及伤口愈合质量得到了明显的提高和改善。此次研究中，富血小板纤维蛋白的处理明显改善了新西兰大白兔术区切口愈合情况；此外，在术后伤口感染方面，富血小板纤维蛋白组术区伤口感染的动物数量也远低于对照组。结果提示，富血小板纤维蛋白在实验动物股动脉吻合口术区发挥了强大的抗炎作用，改善了术区切口愈合情况，并预防了术后伤口感染。这些结果与上述文献报道一致，证实了富血小板纤维蛋白确实具有提高伤口愈合质量及预防感染的优势。

富血小板纤维蛋白中的血小板被激活后，可通过α颗粒释放超生理浓度的生长因子，包括VEGF、PDGF及转化生长因子β1等，这些成分是富血小板纤维蛋白在损伤早期发挥组织修复和重建作用的关键[28，35-37]。其中，VEGF是促进血管内皮生成的重要生长因子，积极地参与血管的病理生理学调控过程。一方面，VEGF能够加速血管内皮细胞有丝分裂、增殖及迁移，并抑制多种内外因素导致的血管内皮细胞调亡；同时，VEGF协助血管内皮细胞内分泌功能如促进血管内皮细胞合成和释放一氧化氮，起到抗血栓形成的作用[38]。有研究报道，在大鼠牙龈软组织愈合过程中，富血小板纤维蛋白能够显著上调VEGF的表达[33]。在此次研究中，苏木精-伊红染色结果显示，富血小板纤维蛋白处理组动物股动脉组织显微吻合术后血管内皮细胞开始修复的时间早且再生活跃，血管各层结构重建得更为完整，几乎接近正常血管组织。进一步的免疫组化结果发现，实验组动物股动脉组织中VEGF的表达水平远高于对照组，提示富血小板纤维蛋白处理不仅在损伤早期释放了VEGF促进内皮的功能修复，而且随后显著地诱导了吻合口局部VEGF的表达。这些因素共同在血管损伤后对于血管内皮细胞的修复及血管组织各层结构的恢复起到了正性调控的作用。

PDGF是一种促进细胞有丝分裂的强效生长因子，生理状态下，主要由内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞等分泌，另外还可通过血小板中的α-蛋白颗粒脱粒作用释放，并在机体缺氧、血管损伤、凝血酶或其他细胞因子刺激时表达上调[39-40]。KIM等[41]、CHEN等[42]及朱晋坤等[43]发现，PDGF可以明显促进血管平滑肌细胞的有丝分裂，调控其增殖、趋化及迁移，在血管损伤过程中扮演不可或缺的角色。在此次研究中，离断后的股动脉组织经富血小板纤维蛋白干预后，血管中膜平滑肌细胞的修复情况得到了明显改善，且没有表现出类似于对照组血管内膜过度增殖或迁移的趋势及管腔狭窄的征象；免疫组化结果也显示，实验组股动脉组织中PDGF表达的量高于对照组。这些结果提示富血小板纤维蛋白中的PDGF具有调控血管平滑肌细胞适宜的增殖、迁移及分化潜能。

转化生长因子β1主要由人体血小板在组织损伤时释放。近年来发现转化生长因子β1可通过调控成纤维细胞和成骨细胞的生长及分化，从而参与伤口愈合、炎症反应、血管生成、上皮再生和结缔组织合成等过程[44]。此外，转化生长因子β1还可上调VEGF的表达，协助VEGF促进血管生成和炎症细胞的招募[45]。WU等[46]通过大鼠跟腱切断-吻合的肌腱损伤模型发现，转化生长因子β1是肌腱愈合过程中瘢痕形成及肌腱粘连的重要因素。LIU等[47]发现转化生长因子β1的表达与肌肉纤维化的程度正相关，在肌肉组织损伤时转化生长因子β1可以降低成肌蛋白的表达，同时增强促进组织纤维化相关蛋白的表达。此次研究中，富血小板纤维蛋白作用后股动脉与周围组织无明显粘连，且术区组织未见明显的纤维化与瘢痕化。免疫组化实验结果显示，吻合后的股动脉组织中转化生长因子β1在实验组的表达明显高于对照组，这一结果似乎与上述文献报道相矛盾。一种可能的解释是富血小板纤维蛋白中其余的生物成分干扰了转化生长因子β1所引起的组织粘连及纤维化。有意思的是，也有研究发现，富血小板纤维蛋白能够有效地预防甲状腺术区切口粘连及减少瘢痕增生[48]。这些与此次实验结果相似，反映了术中富血小板纤维蛋白的干预切实能够降低软组织粘连发生率，促进术区伤口愈合。

利用多样化的生物制剂治疗各类软硬组织疾病是目前生物组织工程研究的热点。此次实验尝试将富血小板纤维蛋白凝胶用于新西兰大白兔股动脉显微吻合口区域，探究富血小板纤维蛋白对股动脉显微吻合术后的影响，结果肯定了富血小板纤维蛋白的显著疗效。然而，此次实验也存在一定局限性：①首先，涉及的实验动物数量相对较少，后期仍需要大样本量的实验进行长期观察。②其次，显微血管吻合术后临床上要求患者近期患肢制动甚至绝对卧床休息，以防体位变化造成血流动力学改变，采取多种镇痛模式，减轻疼痛对血管的应激刺激，尽最大可能避免因血管痉挛导致的血管危象发生，同时嘱患者大量饮水或给予补液来降低血液的黏稠度，加快血液流动的速度，以此来降低血栓形成的风险[49-53]。但以上干预措施在实验动物身上很难实现且无法做到统一化，可能会造成实验组及对照组实验结果与临床预期结果的偏离。③最后，富血小板纤维蛋白凝胶中的成分复杂，除了上述因子的作用外，富血小板纤维蛋白中是否还存在其他的生物活性因子、它们之间的相互作用如何、富血小板纤维蛋白究竟是通过何种信号机制调节受损血管内皮细胞的修复，以及富血小板纤维蛋白对于临床中患者血管显微吻合术后实际干预的效果如何等，有待于进一步研究。

总之，此次研究明确了富血小板纤维蛋白具有加速血管内皮细胞修复、促进血管组织各层结构原位重建及提高术区伤口愈合质量等特点。期望通过该研究为显微血管外科术后如何防治吻合口栓塞、预防血管再狭窄、提高血管吻合成功率以及改善临床疗效提供一部分实践案例和理论基础，为显微外科的综合治疗提供新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
自体血液浓缩物：自体血液与添加剂混合或直接离心后得到的血液制剂，其中聚集了大量参与组织修复和再生的细胞和生长因子。根据有无添加剂、成分及离心方式(时间、转速、次数等)不同等因素，可分为许多临床应用产品。
富血小板纤维蛋白：自体静脉血液置于干燥且无任何添加剂的离心管内，经一定转速及时间的一次离心后得到的富集了全血中大量血小板及白细胞的自体血液制剂，它还具有可吸附和缓释许多生长因子及细胞的立体疏松纤维蛋白结构，可以有效促进机体各类软硬组织的修复和再生。
平均光密度值：由光密度值得来，图像中被测物质的量越多，光密度值越高，透射出的光越少，反映在图片上就越黑。图像中各点的光密度值累加起来，得到平均光密度值，此值与目标物质的总量成正比，平均光密度值除以目标分布区域的面积，得到平均光密度值，此值反映了目标物质的单位面积浓度。对免疫组化实验图像中表达的物质进行定量分析比较时，就是比较它们之间光密度值的大小。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

富血小板纤维蛋白作为第2代血液浓缩物生物制剂，含有高浓度的血小板、白细胞以及规则的立体纤维蛋白结构，其中的血小板已被证实在激活后显著释放多种有利于组织修复的生物活性因子，包括血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子及转化生长因子β1等。近年来大量的基础实验及临床研究数据表明富血小板纤维蛋白可以促进机体软硬组织的再生及修复，然而在显微血管吻合领域尚缺少其作用的相关报道。此次研究旨在评估富血小板纤维蛋白对兔股动脉显微吻合术后效果的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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