2.1   实验动物数量分析   纳入28，42，56，70日龄的雌性SD大鼠各6只，全部进入结果分析，所有实验动物无脱失。
2.2   差异基因的筛选   GSE70459数据集包括3例出生后1 d样本和3例出生后7 d样本，基因注释之后共15 554个基因。根据adj P value < 0.05，∣logFC∣> 1为筛选条件进行差异基因鉴定，共计272个差异基因(122个基因上调，150个基因下调)，进一步使用火山图和热图对数据进行可视化处理，见图1，2。







2.3   富集分析    基因本体论和KEGG富集分析使用的是R语言的clusterProfiler包和org.Rn.eg.db包，筛选条件为P value < 0.05。基因本体论分析显示，在生物过程主要集中在小分子代谢过程的调控、肌肉系统过程、横纹肌细胞分化、骨骼肌器官发育、肌肉细胞发育等方面；细胞组分主要集中在染色体区、浓缩染色体，着丝粒区、肌原纤维、收缩纤维等方面；分子功能集中在肌肉的结构成分。KEGG信号通路富集分析显示主要参与的信号通路有心肌收缩、胆固醇代谢、PI3K-Akt 信号通路等，见图3，4。







2.4   跟腱力学性能分析   见图5。

通过对不同生长阶段大鼠的体质量、跟腱长度、跟腱截面积比较，结果显示随着生长发育的进行，28，42，56，70日龄大鼠的体质量、跟腱长度、跟腱截面积均呈现逐渐增长的趋势，见图5B-D。其中，体质量在各个阶段差异均极显著；跟腱长度和截面积均为28日龄时跟其他日龄比较差异均有显著性意义，42，56，70日龄跟腱长度与截面积变化差异不显著。通过体外拉伸实验，分别对不同阶段大鼠的跟腱进行拉伸，结果显示，不同生长阶段大鼠所能承受的最大载荷和刚度基本呈现逐渐增大的趋势，最大载荷在28，42，56日龄阶段时差异均极显著；刚度在28日龄与56日龄时差异极显著；最大拉伸长度在各组间基本一致，差异不显著。

综上所述，随着大鼠的生长发育，即使体质量发生了显著的变化，但其后肢跟腱的长度和截面积并不会呈现显著增大的趋势，到一定的生长阶段后将保持基本不变；其所能承受的最大载荷和跟腱组织刚度都随着大鼠生长发育到一定程度后，不再显著变化，见图5E-G。
2.5   苏木精-伊红染色   染色结果显示不同生长阶段的大鼠跟腱有着较为显著的形态学变化，见图6。跟腱组织细胞核着蓝色，核所占比重较小，细胞质及细胞外基质着红色，因此细胞大部分成分都是细胞外基质。从细胞的纤维结构、核圆度、细胞数量3个参数来进行半定量评价。

跟腱纤维结构：随着大鼠的生长发育，伴随着新纤维的沉积，组织结构变得更加致密和规则。28，42日龄时跟腱组织排列疏松，呈轻度微波浪卷曲状，但排列稍显紊乱且相邻之间的空隙比较大，而56，70日龄时跟腱组织排列规则整齐呈平行状，卷曲模式短，胶原纤维紧密相接，空隙较小，含量丰富且波浪状消失胶原纤维明显平行、致密，卷曲模式趋于消失。

核形态：28日龄时核形态基本仍呈圆形，42日龄时呈现出短纺锤形，第56，70日龄时转变为长纺锤形。

细胞数量：随着发育而减少，70日龄肌腱组织中细胞数量最少，它们被密集的胶原纤维包围。

比较上述3个参数在各时间点的组织学评分，见图7。除纤维结构外，各参数得分随时间下降；最低值出现在第70天。



2.6   基因表达分析   结果显示，随着大鼠的生长发育，跟腱中Thrsp和Thrβ的基因表达基本呈现逐渐增长的趋势。但不同生长阶段Thrsp表达差异不显著；28，42日龄的Thrβ表达量显著低于56，70日龄，见图8。



2.7   相关性分析   相关性分析结果显示Thrsp和Thrβ这2个基因都在组织学评分指标种具有较高的负相关性，见图9，在力学性能指标中：Thrsp与截面积和最大载荷中相关性较高，尤其以Thrβ在几种指标中的相关性最高，其中跟腱长度中的相关系数为0.88，截面积中的相关系数为0.89，最大载荷中的相关系数为0.86，刚度中的相关系数为0.68。

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甲状腺激素参与了氧、蛋白质、碳水化合物、脂质和维生素代谢等众多代谢过程，对各组织或器官的发育都有重要作用[1-2]。甲状腺激素的作用主要是通过T3介导的，T3通过与甲状腺激素受体[包括甲状腺激素受体α和甲状腺激素受体β(thyroid hormone receptor beta，Thrβ)]结合调控基因表达。甲状腺激素受体遍布全身机体各处，属于核激素受体的一个超大家族，包括类固醇激素、维甲酸、维生素D和过氧化物酶体增殖体受体[3]。甲状腺激素信号参与了骨骼肌发育、收缩功能和肌肉再生，最新研究表明甲状腺激素在调节肌腱细胞增殖和肌腱疾病中也起着关键作用[4]。早在20世纪六七十年代，就有研究发现甲状腺功能减退症会引起跟腱反射迟钝、跟腱反射松弛期时间延长[5]，之后相关研究一直进展相对缓慢[6]。迄今为止，甲状腺相关疾病也极少被认为与肌腱疾病和肌腱撕裂有关。直到近十年来，越来越多的证据表明甲状腺疾病可能与特发性肌腱疾病有关[7-9]。在肩部肌腱以及甲状腺疾病受累所引起的眼部肌腱中发现，发现甲状腺疾病与肩部肌腱病变之间存在潜在关系[4]；另有研究发现甲状腺功能减退可能引起肌腱炎，因此在显著甲状腺功能减退时，可通过甲状腺激素替代来缓解肌腱炎[10]；体外肌腱细胞的培养实验也证明甲状腺激素以剂量依赖性和时间依赖性的方式促进肌腱细胞的生长，并抵抗细胞凋亡[10]。此外，甲状腺激素对胶原蛋白的合成和基质代谢很重要。甲状腺功能减退会导致细胞外基质中糖胺聚糖的累积，进而导致肌腱钙化[11]。甲状腺功能亢进时，外眼中糖胺聚糖、白细胞介素6和肿瘤坏死因子升高[12-14]，其中糖胺聚糖与腕管综合征的发病机制有关[11]。尽管如此，甲状腺功能对跟腱的发育与力学性能的影响还鲜有报道。只有充分了解甲状腺功能对跟腱发育的潜在影响，才能针对性地在跟腱损伤修复中提出新的治疗思路。

此次研究中，利用生物信息学分析不同发育阶段大鼠跟腱的基因表达谱，筛选得到甲状腺功能相关的基因——Thrβ和甲状腺激素应答蛋白(thyroid hormone responsive，Thrsp)；选取不同生长发育阶段大鼠跟腱，拉伸试验测定其力学性能；苏木精-伊红染色法结合形态计量学进行组织学评价；荧光定量PCR方法测定Thrβ和Thrsp基因的表达量；最后相关性分析判断跟腱中Thrβ和Thrsp基因的表达量与跟腱力学性能和组织学形态之间的联系。该研究期望能为人类甲状腺功能与跟腱的力学性能、发育变化建立某种联系，为今后甲状腺功能相关的跟腱疾病治疗提供某种借鉴。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，组间比较采用LSD法。
1.2   时间及地点   实验于2021年4月至2022年1月在太原理工大学生物医学工程学院完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物及分组   24只健康雌性SD大鼠，购于山西医科大学实验动物中心，许可证号为：SLXK(晋)2019-0004，常规饲料喂养，自由饮水。分别于28，42，56和70日龄(每阶段6只)时取其跟腱组织进行后续实验。其中28，42，56，70日龄大鼠分别相当于人类儿童7，11，12，13岁，相应的年龄与人类年龄的对比换算在网站https://www.taletn.com/rats/age/进行。

动物实验于2021-04-10经太原理工大学实验动物伦理委员会批准，批号：TYUT-202104003。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   主要试剂与设备   Instron 5544万能材料试验机，游标卡尺(天津精密仪器厂，精确度0.02 mm)。Nikon倒置相差生物显微镜，ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪，生理盐水，40 g/L多聚甲醛固定液，苏木精-伊红染液，均由上海生工生物工程公司提供。
1.4   方法   
1.4.1   差异基因筛选   通过GEO(Gene Expression Omnibus)在线数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，选取GSE70459数据集，来比较出生后第1，7天大鼠跟腱的基因表达谱。使用R语言limma包[15]，检测差异基因DEGs。为保证数据集的完整性与可比性，对GEO数据库芯片数据进行校正、标准化和Log2转换处理，使用R语言pheatmap包和ggplot2包对质量控制后的数据进行火山图和热图的可视化[16-17]。以adj 
P value < 0.05，∣logFC∣> 1为筛选条件进行差异基因鉴定，其中logFC > 1表示基因表达上调，logFC < -1表示基因表达下调[18]。
1.4.2   基因富集分析   为了揭示差异基因相关的功能，使用R语言clusterProfiler包和org.Rn.eg.db进行富集分析[19-20]，使用pathview包进行代谢通路整合和可视化，富集分析包括基因本体论，提供了目前最全面的关于基因和基因产物功能的可计算知识资源和KEGG富集分析。基因本体论库由两个主要部分组成：第一个是基因本体论，它提供了生物功能的逻辑结构以及它们彼此之间的关系，表现为有向无环图；第二个是基因本体论注释的语料库，基于证据的陈述将特定的基因产物(蛋白质、非编码RNA或大分子复合物)与特定的本体术语相关联。基因本体论富集分析获得了生物过程、细胞成分和分子功能的基因本体论富集结果。其计算得到的P值，需要通过多重假设检验校正之后，以P value < 0.05为阈值用于差异表达基因显著富集的基因本体论条目。京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)是系统分析基因功能的数据库(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)，将基因组信息与通路信息联系起来[21]。基因组信息存储在基因数据库中，该数据库收集了所有完整测序的基因组和部分基因组的基因目录，并对基因功能进行了最新注释。通路信息存储在通路数据库中，其中包含细胞生长过程的图形展示，如代谢、膜运输、信号转导和细胞周期。KEGG富集分析统计学原理和分析方法与基因本体论富集分析相类似，得到差异基因显著差异的通路。
1.4.3   取材与处理   0.5%利多卡因溶液1.5 mL(太原理工大学动物实验室提供)麻醉后采用颈椎脱臼法处死大鼠，之后立即取其后腿两侧跟腱组织。用于力学性能测定的组织置于生理盐水中；用于苏木精-伊红染色的组织置于40 g/L多聚甲醛固定液中；用于mRNA测定的组织立即置于液氮罐中。
1.4.4   跟腱的力学性能测定   游标卡尺对跟腱组织材料的原长度和横截面直径进行测量记录，每只大鼠取3组跟腱进行测定，每组重复3次。测试时将跟腱组织两端夹于夹具中，在安静、恒温、恒湿的实验室中于万能材料试验机上进行测试。测试方式：预循环以0-0.05 N的力和5 mm/min的加载速率循环拉伸5次；正式拉伸以5 mm/min的加载速率逐渐加大载荷进行跟腱拉伸，以载荷掉落40%且跟腱在中间位置而不在两端的夹具处断裂为实验成功的标准。跟腱材料的力-位移曲线图、材料所能承受的最大载荷以及最大载荷下的应变等数据由系统自行计算输出[22]。
1.4.5   跟腱组织苏木精-伊红染色及盲法半定量评分   取固定后跟腱组织，进行常规组织切片，并用苏木精-伊红染色，在显微镜下观察。组织学评分采用盲法半定量评分系统，基于3个参数——纤维结构、核圆度和细胞数量。每个参数都按照0-3的“4分制”进行评分：0分正常，1分轻微异常，2分异常，3分明显不正常。其中核圆度和细胞数量采用Image-Pro Plus 6.0进行测量和计数，评分标准见表1。3个参数得分相加后得到总评分[23]。

1.4.6   荧光定量PCR测定基因的表达   总RNA按照Trizol(Invitrogen)操作说明书完成，检测RNA的纯度和浓度。然后按照Takara PrimeScriptTM反转录试剂盒说明进行反转录。SYBR Green Q-PCR Master Mix(TakaRa)和荧光定量仪(ABI StepOne Plus)进行QPCR，以β-actin为内参基因，2-ΔΔCt法比较基因的表达情况。引物序列、反应条件及产物大小见表2[24-25]。

1.5   主要观察指标   大鼠体质量，跟腱长度、横截面积、最大载荷、最大拉伸长度和刚度。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已由太原理工大学生物统计学专家审核。生物信息分析中使用R语言来处理实验数据，数据采用平均数和标准差表示，采用wilcoxon检验分析不同组别的数据进行比较[26]，P < 0.05表示差异有显著意义。动物实验中使用SPSS 22.0进行统计学分析，组间两两比较采用LSD法[27]，P < 0.05表示差异有显著意义。

此次研究在生物信息学分析中发现大鼠出生后7 d与1 d跟腱中的Thrsp、Thrβ两个基因显著上调，推断这2个跟甲状腺功能相关的基因可能在机体跟腱发育过程中发挥作用。通过在不同生长阶段大鼠跟腱中分析基因Thrsp和Thrβ的表达，结果显示Thrsp在大鼠28 d与56 d时存在显著差异，并在70 d时，表达量明显下降。Thrβ随着大鼠的生长发育，表达量基本呈现逐步上升的趋势，且在28，42 d时与56，70 d时差异极显著；大鼠跟腱力学性能分析发现，当大鼠生长发育到一定阶段时，跟腱的长度和横截面积、其所能承受的最大载荷和跟腱组织的刚度并不会随着体质量增长而继续增大；跟腱组织学评分发现，除纤维结构呈现上升趋势外，核圆度、细胞数量及总体评分呈现出逐步下降趋势。其中基因的表达量与跟腱力学性能和组织学评分存在一定的相关性，表明跟腱的发育对甲状腺激素的作用与应答较为敏感。

Thrsp是一种核蛋白，是Seelig在1981年从甲状腺功能低下、正常和甲状腺功能亢进3组动物中用体外转录产物进行双向电泳来研究甲状腺激素对大鼠肝脏基因表达的影响时，发现的第14个可被调节的蛋白点，即为Thrsp，因此也被称为甲状腺激素应答点14蛋白(spot14)，简称S14。在大鼠中其表达局限于肝脏和脂肪组织，受营养和激素因素控制，该基因已被证明在肝脏和脂肪细胞中表达，也在脂质性乳腺癌中表达，表明它在控制肿瘤脂质代谢中发挥作用[28]。Thrβ基因编码的蛋白质是T3核激素受体。T3是甲状腺激素的受体，可介导甲状腺激素的生物活动。有研究显示健康或病理状态下肩部肌腱的Thrβ均持续高表达，表明甲状腺激素在调节肌腱细胞增殖和肌腱病变的可能性中起着关键作用[29]；另外，Thrβ基因突变可引起全面性甲状腺激素抵抗，从而造成甲状腺肿和循环甲状腺激素(T3-T4)水平升高，并伴有正常或轻微升高的促甲状腺激素。Thrβ还对视觉、听觉等神经发育起着重要的调控作用，是影响脊椎动物神经系统发育的关键介质[30]。目前，关于Thrsp和Thrβ调控跟腱的发育、断裂、疾病以及愈合等研究还鲜有报道。

此次研究首次发现大鼠不同发育阶段跟腱中Thrsp、Thrβ基因的表达存在显著差异，并与力学性能、组织形态存在显著的相关性，结合临床其他研究证据可推断出，甲状腺激素对跟腱的发育具有潜在的调控作用。尽管如此，此次研究仍存在一定的局限，仅对比了青春期大鼠跟腱的发育变化及甲状腺相关基因的表达，没有关注其他发育阶段，其中中老年阶段才是跟腱疾病的高发年龄；另外，仅对雌性大鼠进行了分析，对于雄性大鼠是否具有相同的作用还有待于进一步去探索。总之，伴随着免疫学的发展，越来越多的证据表明自身免疫性甲状腺疾病会伴随结缔组织的病变，因此阐明甲状腺激素在肌腱发育、断裂、疾病以及愈合中的意义十分必要，其中具体的功能变化及分子调控机制仍待后期深入挖掘。
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文题释义：
Thrβ：为甲状腺激素受体β，在细胞核内以原型与染色质结合在一起的蛋白质。与甲状腺激素结合后，其主要功能是转导与发育和能量产生有关的信息。
Thrsp：为甲状腺激素应答蛋白，在研究甲状腺激素在脂肪组织中的反应时被发现。主要在脂肪生成组织如肝脏、脂肪和乳腺组织内表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

早在20世纪六七十年代，就有研究发现甲状腺功能减退症会引起跟腱反射迟钝、跟腱反射松弛期时间延长，之后相关研究一直进展相对缓慢。直到近十年来，越来越多的证据表明甲状腺疾病可能与特发性肌腱疾病有关。尽管如此，甲状腺功能对跟腱的发育与力学性能的影响还鲜有报道。只有充分了解甲状腺功能对跟腱发育的潜在影响，才能针对性地在跟腱损伤修复中提出新的治疗思路。此次研究利用生物信息学分析不同发育阶段大鼠跟腱的基因表达谱，筛选得到甲状腺功能相关的基因—Thrβ和Thrsp；选取不同生长发育阶段大鼠跟腱，拉伸试验测定其力学性能；苏木精-伊红染色法结合形态计量学进行组织学评价；荧光定量PCR方法测定Thrβ和Thrsp基因的表达量；最后相关性分析判断跟腱中Thrβ和Thrsp基因的表达量与跟腱力学性能和组织学形态之间的联系。该研究期望能为人类甲状腺功能与跟腱的力学性能、发育变化建立某种联系，为今后甲状腺功能相关的跟腱疾病治疗提供某种借鉴。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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