靶向调控前列腺素内过氧化物合成酶2基因抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化

doi:10.12307/2022.512

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (12): 1888-1893.doi: 10.12307/2022.512

• 骨科植入物相关基础实验 Basic experiments of orthopedic implant • 上一篇下一篇

靶向调控前列腺素内过氧化物合成酶2基因抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化

罗鸣然1，范文豪1，李鑫1，周鹏1，吴泽睿1，袁峰2

1徐州医科大学第一临床医学院，江苏省徐州市 221006；2徐州医科大学附属医院骨科，江苏省徐州市 221006

收稿日期:2021-07-30 修回日期:2021-08-02 接受日期:2021-08-13 出版日期:2022-04-28 发布日期:2021-12-14
通讯作者: 袁峰，教授，博士，徐州医科大学附属医院骨科，江苏省徐州市 221006
作者简介:罗鸣然，男，1995年生，江苏省宿迁市人，汉族，徐州医科大学在读硕士，医师，主要从事生物信息学及骨科基础与临床研究。
基金资助:
江苏省科技厅社会发展项目(BE2016647)，项目负责人：袁峰；江苏省卫生计生委科研项目(H201630)，项目负责人：袁峰；江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX21_2679)，项目负责人：罗鸣然

Inhibition of the proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by targeting prostaglandin-endoperoxide synthase 2

Luo Mingran1, Fan Wenhao1, Li Xin1, Zhou Peng1, Wu Zerui1, Yuan Feng2

1First Clinical Medical College of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China

Received:2021-07-30 Revised:2021-08-02 Accepted:2021-08-13 Online:2022-04-28 Published:2021-12-14
Contact: Yuan Feng, Professor, MD, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China
About author:Luo Mingran, Master candidate, Physician, First Clinical Medical College of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China
Supported by:
Social Development Project of Science and Technology Department of Jiangsu Province, No. BE2016647 (to YF); Scientific Research Project of Jiangsu Provincial Health and Family Planning Commission, No. H201630 (to YF); Postgraduate Research and Practice Innovation Program of Jiangsu Province, No. KYCX21_2679 (to LMR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
前列腺素内过氧化物合成酶2：前列腺素内过氧化物合成酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，Ptgs)基因编码为环氧合酶(cyclooxygenase，COX)蛋白，COX分为COX1和COX2两型，COX2是催化花生四烯酸合成前列腺素的关键限速酶。
miRNA：miRNA是一种18-25个核苷酸长的非编码RNA，通过识别同源序列来调控转录、翻译和表观遗传过程。
MC3T3-E1细胞：具有自我更新和分化为成骨细胞的能力，并被用作体外研究成骨过程的模型。

背景：骨质疏松症可归因于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的不平衡。成骨细胞是骨形成的基础，对于骨骼的生长和维持必不可少，成骨细胞功能的紊乱会导致骨骼生长发育不良和骨质疏松症。然而目前对于成骨细胞成骨分化过程中的关键基因仍不清楚。
目的：使用生物信息学鉴定MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的关键基因及其上游miRNA，并验证其对MC3T3-E1细胞成骨分化和增殖的影响。
方法：从基因表达综合数据库(GEO)下载基因表达谱GSE46400成骨诱导数据，使用R语言limma包获得差异表达基因。利用DAVID数据库对DEGs进行了基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析。通过STRING网站建立蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络并利用CytoHubba插件筛选网络中的重要模块，以鉴定其中的关键基因。培养MC3T3-E1细胞并分别转染siRNA和miRNA，转染72 h后进行实时荧光定量PCR检测前列腺素内过氧化物合成酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，Ptgs)2和骨化相关水平变化，转染72 h后进行Western Blot检测PTGS2蛋白水平变化；转染14 d后进行碱性磷酸酶定量检测；转染21 d后进行茜素红染色及定量检测。
结果与结论：①筛选出差异表达基因229个，其中114个基因表达上调，115个基因表达下调。富集在骨矿化生物学过程的5个基因：Mmp13，Ibsp，Gpnmb，Ptgs2及Aspn均为显著高表达。进一步使用CytoHubba鉴别高表达差异基因中的核心模块中只有Ptgs2参与骨矿化生物学过程，即定义Ptgs2为成骨分化过程的关键基因。②通过Targetscan对Ptgs2上游miRNA进行预测，发现mmu-miR-107-3p可以靶向调控Ptgs2。③在MC3T3-E1细胞中敲减Ptgs2后可以显著抑制细胞增殖和成骨分化(P < 0.05)；在转染mmu-miR-107-3p后，细胞的增殖和成骨分化同样被抑制。④双荧光素酶报告基因结果显示mmu-miR-107-3p可以直接靶向抑制Ptgs2的转录(P < 0.05)。⑤mmu-miR-107-3p可以通过靶向Ptgs2进而抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化，Ptgs2可能是MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的关键基因。
缩略语：前列腺素内过氧化物合成酶：prostaglandin-endoperoxide synthase，Ptgs

https://orcid.org/0000-0002-5346-3266 (罗鸣然)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 生物信息学, 差异表达基因, MC3T3-E1前成骨细胞, 前列腺素内过氧化物合成酶2, mmu-miR-107-3p, 成骨分化, 增殖

Abstract: BACKGROUND: Osteoporosis can be attributed to an imbalance between osteoblastic bone formation and osteoclastic bone resorption. Osteoblasts are the basis of bone formation and are essential for bone growth and maintenance. Disorders of osteoblast function can lead to dysplasia of bone growth and osteoporosis. However, the key genes involved in osteoblast differentiation are still unknown.
OBJECTIVE: Bioinformatics was used to identify key genes and upstream miRNAs during osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells and verify their effects on osteogenic differentiation and proliferation of MC3T3-E1 cells.
METHODS: The osteogenic induction data of gene expression profile GSE46400 were downloaded from the Gene Expression Omnibus. Differentially expressed genes for osteogenesis differentiation were obtained with limma package. The Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis of differentially expressed genes were analyzed using DAVID database. The STRING website was used to establish a protein-protein interaction network and CytoHubba plug-in was used to screen the key modules in the network to identify the key genes. MC3T3-E1 cells were cultured and transfected with siRNA and miRNA, separately. The change of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (Ptgs2) and ossification-related gene level was detected by real-time quantitative PCR 72 hours after transfection. The change of PTGS2 protein level was detected by western blot assay 72 hours after transfection. Alkaline phosphatase was quantified 14 days after transfection. Alizarin red staining and quantitative detection were performed 21 days after transfection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 229 differentially expressed genes were screened, of which 114 were up-regulated and 115 were down-regulated. Five genes enriched in the biological process of bone mineralization, including Mmp13, Ibsp, Gpnmb, Ptgs2 and Aspn, were highly expressed. Furthermore, CytoHubba was used to identify that only Ptgs2 was involved in the biological process of bone mineralization, and Ptgs2 was defined as a key gene in the process of osteogenic differentiation. (2) The upstream miRNA of Ptgs2 was predicted by Targetscan, and it was found that mmu-miR-107-3p could regulate Ptgs2 in a targeted way. (3) Knockdown Ptgs2 in MC3T3-e1 cells significantly inhibited cell proliferation and osteogenic differentiation (P < 0.05). After transfection of mmu-miR-107-3p, cell proliferation and osteogenic differentiation were also inhibited. (4) Dual luciferase reporter gene results showed that mmu-miR-107-3p could directly inhibit the transcription of Ptgs2 (P < 0.05). (5) mmu-miR-107-3p can inhibit the proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by targeting Ptgs2. Ptgs2 may be a key gene in the osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.

Key words: bioinformatics, differentially expressed genes, MC3T3-E1 preosteoblast, prostaglandin-endoperoxide synthase 2, mmu-miR-107-3p, osteogenic differentiation, proliferation

中图分类号:

罗鸣然, 范文豪, 李鑫, 周鹏, 吴泽睿, 袁峰. 靶向调控前列腺素内过氧化物合成酶2基因抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(12): 1888-1893.

Luo Mingran, Fan Wenhao, Li Xin, Zhou Peng, Wu Zerui, Yuan Feng. Inhibition of the proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by targeting prostaglandin-endoperoxide synthase 2[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(12): 1888-1893.

图/表（结果） 8

2.1 筛选差异表达基因在基因集GSE46400中有3例无成骨诱导MC3T3-E1细胞样本和3例成骨诱导14 d MC3T3-E1细胞样本。在主成分分析中发现两组细胞可以明显区分开来，见图1。

在|logFC|> 2和P < 0.05的条件下，共筛选出229个差异表达基因进行后续分析。在这些差异表达基因中，114个基因表达上调，115个基因表达下调，见图2。

2.2 GO和KEGG富集分析差异表达基因主要富集于有丝分裂核分裂、细胞分裂、姐妹染色单体聚合、有丝分裂胞质分裂、骨矿化等生物学过程和细胞周期等信号通路，见表2。

差异表达基因中5个高表达基因参与了骨矿化的生物过程，包括：基质金属肽酶13(Mmp13)，整合素结合唾液蛋白(Ibsp)，糖蛋白nmb(Gpnmb)，前列腺素内过氧化物合成酶2(Ptgs2)，无孢蛋白(Aspn)，这5个基因在成骨诱导过程中均显著高表达。提示高表达基因可能在成骨分化过程中发挥更大作用。这些生物学过程和信号通路为研究MC3T3-E1细胞成骨分化的分子机制提供了思路。
2.3 构建PPI网络中核心模块为了进一步分析高表达基因在成骨分化中的相互作用，使用STRING构建差异高表达基因的PPI网络，见图3。

运用CytoHubba插件中的Degree方法，筛选PPI网络中的核心模块，模块中包括10个基因：血管紧张素原(Agt)，原癌基因AP-1转录因子亚基(Jun)，早期生长应答因子1(Egr1)，serpin家族E成员1(Serpine1)，前列腺素内过氧化物合成酶2(Ptgs2)，双特异性磷酸酶1(Dusp1)，激活转录因子3(Atf3)，补体C3(C3)，核受体亚家族4组A成员1(Nr4a1)，胰岛素样生长因子结合蛋白5(Igfbp5)，见图4。

2.4 鉴定关键基因及靶miRNA Ptgs2是PPI网络核心模块中唯一参与骨矿化这一生物学过程的基因，即为鉴定得到的关键基因。选择Target Scan数据库预测到的miRNA作为Ptgs2的靶miRNA，包括 mmu-miR-26b-5p，mmu-miR-143-3p mmu-miR-101a-3p，mmu-miR-101b-3p，mmu-miR-107-3p，
mmu-miR-103-3p，mmu-miR-144-3p。其中部分miRNA已有研究报道，选择尚无相关研究的mmu-miR-107-3p进一步验证其功能。
2.5 敲减Ptgs2对MC3T3-E1细胞成骨分化和增殖的影响在MC3T3-E1细胞中转染Ptgs2-siRNA，3 d后提取mRNA，荧光定量PCR检测实验组的Ptgs2及骨化相关表达明显降低(P < 0.05)，3 d后提取蛋白Western Blot结果显示实验组PTGS2蛋白明显降低(P < 0.05)，碱性磷酸酶定量检测和茜素红染色及定量实验组较阴性对照组也明显降低(P < 0.05)。增殖实验中实验组的增殖活性明显降低(P < 0.05)。结果提示敲减Ptgs2基因后可明显抑制细胞的成骨分化和增殖活性，见图5。

2.6 过表达mmu-miR-107-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响在成功验证Ptgs2对成骨分化的影响基础上，进一步探索上游miRNA对Ptgs2和成骨分化的影响。在MC3T3-E1细胞中过表达mmu-miR-107-3p，3 d后提取mRNA，荧光定量PCR检测实验组的Ptgs2和骨化相关基因表达明显降低(P < 0.05)，
3 d后提取蛋白Western Blot结果显示实验组PTGS2蛋白明显降低(P < 0.05)，碱性磷酸酶定量检测和茜素红染色及定量实验组较对照组也明显降低(P < 0.05)。增殖实验中实验组的增殖活性明显降低(P < 0.05)。结果提示过表达mmu-miR-107-3p后可明显抑制细胞的成骨分化和增殖活性，见图6。

2.7 双荧光素酶报告基因结果基于TargetScan分析，确定了一个mmu-miR-107-3p靶向位点位于Ptgs2 3 -UTR，见图7A。为了证实这确实是这个miRNA的结合位点，使用了标准荧光素酶报告基因分析。该实验证实，与未转染mmu-miR-107-3p的细胞相比，表达该序列的WT版本的细胞荧光素酶活性降低了56%(P < 0.05)；相反，在mmu-miR-107-3p转染后，表达该结构突变和阴性对照组的细胞荧光素酶活性没有任何降低，见图7B。

参考文献

[1] KO NY, CHEN LR, CHEN KH. The Role of Micro RNA and Long-Non-Coding RNA in Osteoporosis. Int J Mol Sci. 2020;21(14):4886.
[2] KOMORI T. Runx2, an inducer of osteoblast and chondrocyte differentiation. Histochem Cell Biol. 2018;149(4):313-323.
[3] WANG LJ, CAI HQ. Let-7b downgrades CCND1 to repress osteogenic proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells: An implication in osteoporosis. Kaohsiung J Med Sci. 2020;36(10):775-785.
[4] YANG Y, YUJIAO W, FANG W, et al. The roles of miRNA, lncRNA and circRNA in the development of osteoporosis. Biol Res. 2020;53(1):40.
[5] GARCIA J, DELANY AM. MicroRNAs regulating TGFβ and BMP signaling in the osteoblast lineage. Bone. 2021;143:115791.
[6] ZHAI F, SONG N, MA J, et al. FGF18 inhibits MC3T3‑E1 cell osteogenic differentiation via the ERK signaling pathway. Mol Med Rep. 2017;16(4):4127-4132.
[7] HUANG X, WANG X, ZHANG Y, et al. Absorption and utilisation of epimedin C and icariin from Epimedii herba, and the regulatory mechanism via the BMP2/Runx2 signalling pathway. Biomed Pharmacother. 2019;118:109345.
[8] COSTA-SILVA J, DOMINGUES D, LOPES FM. RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool. PLoS One. 2017;12(12):e0190152.
[9] LI W. Volcano plots in analyzing differential expressions with mRNA microarrays. J Bioinform Comput Biol. 2012;10(6):1231003.
[10] HUANG DA W, SHERMAN BT, LEMPICKI RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 2009;4(1):44-57.
[11] SZKLARCZYK D, MORRIS JH, COOK H, et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D362-D368.
[12] SHANNON P, MARKIEL A, OZIER O, et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003; 13(11):2498-2504.
[13] CHIN CH, CHEN SH, WU HH, et al. cytoHubba: identifying hub objects and sub-networks from complex interactome. BMC Syst Biol. 2014;8 Suppl 4(Suppl 4):S11.
[14] AGARWAL V, BELL GW, NAM JW, et al. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 2015;4:e05005. .
[15] XIONG Y, CHEN L, YAN C, et al. The lncRNA Rhno1/miR-6979-5p/BMP2 Axis Modulates Osteoblast Differentiation. Int J Biol Sci. 2020;16(9):1604-1615.
[16] YANG C, NILSSON L, CHEEMA MU, et al. Chitosan/siRNA nanoparticles targeting cyclooxygenase type 2 attenuate unilateral ureteral obstruction-induced kidney injury in mice. Theranostics. 2015;5(2):110-123.
[17] GREGORY CA, GUNN WG, PEISTER A, et al. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction. Anal Biochem. 2004;329(1):77-84.
[18] PISZCZEK P, RADTKE A, EHLERT M, et al. Comprehensive Evaluation of the Biological Properties of Surface-Modified Titanium Alloy Implants. J Clin Med. 2020;9(2):342.
[19] ROSEN CJ. The Epidemiology and Pathogenesis of Osteoporosis//Endotext (FEINGOLD KR, ANAWALT B, BOYCE A, et al. eds). South Dartmouth (MA): MDText.com, Inc.Copyright © 2000-2021, MDText.com, Inc., 2000.
[20] 白璧辉,谢兴文,李鼎鹏,等.我国近5年来骨质疏松症流行病学研究现状[J].中国骨质疏松杂志,2018,24(2):253-258.
[21] 中华医学会物理医学与康复学分会,中国老年学和老年医学学会骨质疏松康复分会.原发性骨质疏松症康复干预中国专家共识[J].中华物理医学与康复杂志,2019,41(1):1-7.
[22] AN J, YANG H, ZHANG Q, et al. Natural products for treatment of osteoporosis: The effects and mechanisms on promoting osteoblast-mediated bone formation. Life Sci. 2016;147:46-58.
[23] KIM JM, LIN C, STAVRE Z, et al. Osteoblast-Osteoclast Communication and Bone Homeostasis. Cells. 2020;9(9):2073.
[24] 中华医学会放射学分会骨关节学组,中国医师协会放射医师分会肌骨学组,中华医学会骨科学分会骨质疏松学组,等. 骨质疏松的影像学与骨密度诊断专家共识[J].中国骨质疏松杂志,2020,26(9):1249-1256.
[25] ZHU S, ZHU Y, WANG Z, et al. Bioinformatics analysis and identification of circular RNAs promoting the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells on titanium treated by surface mechanical attrition.Peer J. 2020;8:e9292.
[26] MAJIDINIA M, SADEGHPOUR A, YOUSEFI B. The roles of signaling pathways in bone repair and regeneration. J Cell Physiol. 2018;233(4):2937-2948.
[27] EKEGREN CL, EDWARDS ER, DE STEIGER R, et al. Incidence, Costs and Predictors of Non-Union, Delayed Union and Mal-Union Following Long Bone Fracture. Int J Environ Res Public Health. 2018;15(12):2845.
[28] BLACKWELL KA, RAISZ LG, PILBEAM CC. Prostaglandins in bone: bad cop, good cop?. Trends Endocrinol Metab. 2010;21(5):294-301.
[29] WHEATLEY BM, NAPPO KE, CHRISTENSEN DL, et al. Effect of NSAIDs on Bone Healing Rates: A Meta-analysis. J Am Acad Orthop Surg. 2019;27(7):e330-e336.
[30] GEORGE MD, BAKER JF, LEONARD CE, et al. Risk of Nonunion with Nonselective NSAIDs, COX-2 Inhibitors, and Opioids. J Bone Joint Surg Am. 2020;102(14):1230-1238.
[31] LONG J, LEWIS S, KUKLO T, et al. The effect of cyclooxygenase-2 inhibitors on spinal fusion. J Bone Joint Surg Am. 2002;84(10):1763-1768.
[32] GE DW, WANG WW, CHEN HT, et al. Functions of microRNAs in osteoporosis. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(21):4784-4789.

引言

材料方法

1.1 设计生物信息学分析结合细胞实验验证。两组数据之间的比较使用t检验，重复测量数据使用重复测量ANOVA检验。
1.2 时间及地点 2021年1-7月在徐州医科大学第一临床医学院干细胞研究中心完成。
1.3 材料小鼠前成骨细胞MC3T3-E1购自中国科学院上海细胞库；胰蛋白酶、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油钠购自美国Sigma公司；胎牛血清、Trizol、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自北京全式金公司；改良型α-最小必须培养基(α-MEM)购自美国hyclone公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；siRNA购自上海吉玛基因；mmu-miR-107-3p及前列腺素内过氧化物合成酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，Ptgs)2双荧光素酶报告基因质粒及突变质粒购自上海吉凯基因；引物购自苏州金唯智公司；COX2兔单克隆抗体、山羊抗兔二抗购自武汉Proteintech公司。茜素红定量试剂盒购自美国ScienCell公司，碱性磷酸酶定量试剂盒购自上海碧云天公司。
1.4 数据来源基因表达综合数据库(gene expression omnibus，GEO)是一个用于数据存储的公共数据库，包含高通量基因表达数据、芯片和微阵列。2021年1月在数据库中检索“MC3T3-E1”，从Affymetrix GPL6246平台下载基因表达数据集GSE46400 (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE46400)，其中包含3例未进行成骨诱导的正常培养MC3T3-E1细胞和3例进行成骨诱导14 d MC3T3-E1细胞的数据。
1.5 方法
1.5.1 筛选差异表达基因首先使用R语言4.1.0版本ggplot2包进行主成分分析对数据进行质控[6]。使用R语言limma包对成骨诱导和未成骨诱导样本间的差异基因进行筛选[7]，使用ggplot2包绘制火山图[8]。|logFC| > 2和P < 0.05认为有统计学意义。
1.5.2 基因本体论(gene ontology，GO)、京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析 DAVID数据库(http://david.ncifcrf.gov)是一个集生物数据和分析工具于一体的在线生物信息库，提供了一套完整的基因和蛋白质功能注释信息供用户提取生物信息[9]。为分析差异表达基因的功能，将差异表达基因导入DAVID在线数据库进行生物学分析。P < 0.05被认为有统计学意义。
1.5.3 蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建和核心模块筛选利用STRING在线数据库(http://string-db.org)构建差异表达基因的PPI网络[10]，设置最小互作系数为0.7，并隐藏网络中没有相互作用的节点。运用Cytoscape-3.6.1将PPI网络可视化[11]，并使用CytoHubba插件的Degree方法来筛选PPI网络中的核心模块[12]。
1.5.4 miRNA预测筛选出关键基因之后，为了进一步探索关键基因上游的miRNA对其的调控关系，运用Target Scan数据库(http://www.targetscan.org/vert_72/)进行靶miRNA预测[13]，运用Cytoscape-3.7.2构建关键基因的miRNA调控网络。
1.5.5 细胞培养及转染小鼠前成骨细胞MC3T3-E1培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素α-MEM的10 cm培养皿中，置于体积分数5% CO2、37 ℃的培养箱中培养，每3 d进行换液。细胞形态通过倒置相差显微镜观察分析。利用Ptgs2-siRNA(正义链5’-GGA UUU GAC CAG UAU AAG UTT-3’，反义链5’-ACU UAU ACU GGU CAA AUC CTG-3’)来敲低Ptgs2的表达，同时设置阴性对照的siRNA(正义链5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’，反义链5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’)[14]。细胞融合度达到70%-80%时使用脂质体进行转染，6 h后换为成骨诱导培养基(50 μmol/L抗坏血酸、10 μmol/L地塞米松和10 mmol/L β-磷酸甘油钠)继续培养，用于后续检测实验。3 d检测mRNA和蛋白水平，14 d检测碱性磷酸酶(ALP)活性，21 d进行茜素红染色。

1.5.6 实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR) 利用TRIzol法对总RNA进行萃取和提纯。反转录的条件为：42 ℃，15 min，85 ℃，5 s。在扩增过程中应用SYBR试剂盒作为荧光剂，条件为：94 ℃，30 s，1个循环；94 ℃，5 s，58 ℃，15 s，72 ℃，34 s，45个循环。mRNA的相对表达量利用2-ΔΔCt法进行计算[15]。引物序列，见表1。

1.5.7 蛋白质印记法(Western blot)检测使用PBS洗3次，加入添加蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液裂解细胞。采用BCA法测定提取物的蛋白浓度。将等量的提取物装入二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到NC膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h后加入兔抗鼠一抗4 ℃过夜。第2天加入HRP标记的山羊抗兔二抗，化学发光试剂盒显影后使用Image图像分析系统对所得条带进行灰度值分析。一抗和二抗稀释比均为1︰1 000。
1.5.8 茜素红染色及定量检测室温下用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，磷酸缓冲盐溶液清洗后，每孔加入1 mL茜素红染色液室温孵育20 min，去除染料后用蒸馏水冲洗，室温风干，10%醋酸重悬，在405 nm波长下进行分光光度测定进行定量分析[16]。
1.5.9 碱性磷酸酶定量检测室温下用PBS清洗细胞后用缓冲液将细胞重悬并匀浆，离心后收集上清，加入对硝基苯磷酸酯溶液，25 ℃避光孵育60 min后加入终止反应液，在405 nm波长下进行分光光度测定进行定量分析[17]。
1.5.10 CCK8检测细胞增殖收集各组的MC3T3-E1细胞消化后计数，以3×103个/孔细胞密度接种于96孔板，每组设置3个复孔，检测时每孔加入CCK8溶液10 μL，避光37 ℃孵育2 h，分别于0，24，48，72 h置于酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度(A)值，并绘制生长曲线[18]。
1.5.11 双荧光素酶报告基因双荧光素酶报告基因检测系统被用来验证Ptgs2作为mmu-miR-107-3p的靶基因。含有mmu-miR-107-3p结合位点的Ptgs2 3’-utr区域被添加到荧光素酶下游的质粒载体中，构建Ptgs2野生型和突变型载体，使用DNA测序来确定载体构建是否成功。然后将这些质粒转染到293T细胞进行验证。48 h后，根据说明书评估荧光素酶活性，使用萤火虫荧光与海肾荧光相比将结果进行标准化。
1.6 主要观察指标 ①生物信息学分析发现MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的关键基因Ptgs2及其上游mmu-miR-107-3p；②验证Ptgs2对成骨分化的影响；③验证mmu-miR-107-3p对成骨分化的影响；④验证mmu-miR-107-3p和Ptgs2的靶向结合关系。
1.7 统计学分析应用SPSS 22.0统计软件分析，计量资料以x±s表示。两组数据之间的比较使用t检验，重复测量数据使用重复测量ANOVA检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松症是一个重要的全球公共卫生问题，它可以在任何年龄群体中发生，特别是老龄人群[19]，在中国骨质疏松症患病率约为13%[20]。骨质疏松症是一种全身代谢性骨病，其特征是骨量减少，脊柱变形和脆性骨折[21]。骨是通过膜内或软骨内成骨形成的，在膜内成骨中骨直接由成骨细胞形成，在软骨内成骨过程中软骨最初发育并最终被骨所取代[2]。骨质疏松发病机制被认为是破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间不平衡[22-23]。骨折是骨质疏松的严重并发症，严重影响患者的生活质量[24]。虽然骨骼在修复再生、持续重塑方面具有相当大的能力，但在不利的情况下，5%-10%的骨折会发生延迟愈合或不愈合，这些情况可能需要广泛的策略来实现骨折的完全愈合[25]。目前除了手术干预，额外增强骨再生的临床干预是有限的。因此，有必要在细胞和分子水平上更好地理解骨修复，以获得最佳的骨愈合[26]。
前列腺素内过氧化物合成酶2又称环氧合酶2，是催化花生四烯酸合成前列腺素的关键限速酶[27]。COX2在炎症过程中将花生四烯酸转化为前列腺素，如前列腺素E2(PGE2)。非类固醇抗炎药(NSAIDS)通过竞争性结合AA而抑制COX活性，进而发挥抗炎效应[28]，在临床实践中，非类固醇抗炎药是治疗肌肉骨骼疼痛的常用药物。一些临床研究表明非类固醇抗炎药的暴露会增加骨折延迟愈合或不愈合的风险[29]。也有一些研究表明骨折后使用单一非选择性非类固醇抗炎药并不会增加骨不连的风险，而使用COX2抑制剂与更大的不愈合风险相关[30]。但对于COX2抑制剂和其他非类固醇抗炎药在临床实践中的作用仍存在争议。一些脊柱融合术的研究表明，COX2选择性抑制剂治疗对骨折愈合没有区别，但其他原因(如吸烟)损害了愈合[31]。由于这些相互矛盾的结果，需要更好地理解在肌肉骨骼健康中COX2活动的细微差别。
在此次研究中，首次从数据集GSE46400中鉴定Ptgs2可能作为MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的关键基因，为了进一步验证Ptgs2基因在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用，通过RNA干扰技术敲减Ptgs2后进行茜素红和碱性磷酸酶定量检测，发现MC3T3-E1细胞成骨分化被明显抑制，证实Ptgs2对MC3T3-E1细胞成骨分化起重要的调控作用。既往研究结果中显示抑制PTGS2的表达对下游的影响是多样的：可以抑制细胞增殖和迁移；可以通过降低白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的表达来抑制局部炎症；还可以通过降低Bcl-2表达或上调Bax和caspase 3表达促进细胞凋亡[27]。但Ptgs2对MC3T3-E1细胞的成骨分化影响是首次验证。进一步研究过表达mmu-miR-107-3p后，Ptgs2水平明显降低并同样抑制了MC3T3-E1细胞的成骨分化。双荧光素酶报告基因结果提示Ptgs2可能是mmu-miR-107-3p的直接靶点。miRNA在骨重建过程中发挥着重要的调控作用，特别是在调节成骨细胞和破骨细胞的分化和功能，以及骨质疏松等骨病的发生发展方面。未来有望通过在特定组织中过表达或抑制特定miRNAs来延缓骨丢失，促进骨重塑，从而治疗骨质疏松[32]。然而此次研究纳入的生物信息学研究的样本量只有6例，未来可以考虑进行更大样本量的测序分析，而后续实验也仅对生物分析得到的结果进行简单的表型验证，其中更深入的分子机制仍待进一步的研究。
骨骼的形成和代谢是一个复杂的动态过程，鉴定成骨过程中的关键基因Ptgs2将有助于更好地理解骨骼的生长和调控过程，为加速骨折愈合提供新的思路。未来将深入研究骨折愈合过程中Ptgs2的表达变化以及非类固醇抗炎药对其的调控机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

靶向调控前列腺素内过氧化物合成酶2基因抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化

Inhibition of the proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells by targeting prostaglandin-endoperoxide synthase 2

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[2]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[3]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[4]	温小雨, 孙玉浩, 夏猛. 五脏温阳化瘀汤含药血清干预阿尔茨海默症细胞模型磷酸化tau蛋白的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1068-1073.
[5]	张玉杰, 杨建东, 蔡俊, 朱守雷, 田原. 大蒜素抑制大鼠血管内皮细胞增殖并诱导其凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1080-1084.
[6]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[7]	杨斯迪, 王倩, 许诺, 王榕焓, 靳传奇, 陆颖, 董明. 上调骨形态发生蛋白2促进成骨细胞增殖分化的硅酸钙类材料Biodentine[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 516-520.
[8]	沈佳华, 付勇. 基于石墨烯的纳米材料可否在干细胞领域应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 604-609.
[9]	冯冬菲, 何洪旭, 谢琪, 张立立, 周惠, 李威. 牙周重建生物功能与调节通路关键基因的筛选[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 253-259.
[10]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.
[11]	王坤, 何本祥. 川续断皂苷VI修复兔肌腱病[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 211-217.
[12]	唐晔翎, 梁鹏晨, 史俊峰, 孙苗苗, 周紫艳, 朱莉莎, 李田, 梁冬雨, 沙爽, 易清清, 常庆. 骨愈灵胶囊活性成分治疗骨质疏松的生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(12): 1899-1906.
[13]	陈财, 曾平, 刘金富, 钱晓芬, 陆冠宇, 熊波, 陈莉华, 黄悦. 基因芯片筛选骨性关节炎差异表达基因及实时荧光定量PCR验证[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(12): 1907-1914.
[14]	梁学振, 谢国鑫, 李嘉程, 温明韬, 许波, 李刚. 基于miRNA-mRNA调控网络股骨头坏死的关键基因筛选与分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1720-1727.
[15]	李时斌, 夏天, 章晓云, 王伟伟, 周毅, 赖渝. 淫羊藿活性单体成分调控骨质疏松症相关信号通路影响骨吸收与骨形成的稳态[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1772-1779.