聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3177

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (22): 3466-3472.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3177

• 复合支架材料 composite scaffold materials • 上一篇下一篇

聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价

刘鋆1，2，3，杨龙1，王伟宇1，2，3，周玉虎1，2，3，吴颖3，4，卢涛3，舒莉萍2，3，马敏先4，叶川1，2，3

1贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学，2细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室，3组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004；4贵州医科大学附属口腔医院口腔修复科，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2020-04-18 修回日期:2020-04-23 接受日期:2020-06-17 出版日期:2021-08-08 发布日期:2021-01-19
通讯作者: 叶川，主任医师，贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004
作者简介:刘鋆，男，1988年生，贵州省贵阳市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，医师，主要从事组织工程支架、生物材料、干细胞研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(8196046)，项目负责人：叶川；贵州省科技厅资助项目(黔科合平台人才[2020]6013，黔科合支撑[2020]4Y137号)，项目负责人：叶川

Preparation and properties of poly3-hydroxybutyrate 4-hydroxybutyrate/polyethylene glycol/graphene oxide tissue-engineered scaffolds

Liu Jun1, 2, 3, Yang Long1, Wang Weiyu1, 2, 3, Zhou Yuhu1, 2, 3, Wu Ying3, 4, Lu Tao3, Shu Liping2, 3, Ma Minxian4, Ye Chuan1, 2, 3

1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2National-Guizhou Joint Engineering Laboratory of Cell Engineering and Biomedicine Technique, 3Research Center of Tissue Engineering and Stem Cell Technique, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 4Department of Prosthodontics, Affiliated Stomatology Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2020-04-18 Revised:2020-04-23 Accepted:2020-06-17 Online:2021-08-08 Published:2021-01-19
Contact: Ye Chuan, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; National-Guizhou Joint Engineering Laboratory of Cell Engineering and Biomedicine Technique, and Research Center of Tissue Engineering and Stem Cell Technique, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Liu Jun, Master candidate, Physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; National-Guizhou Joint Engineering Laboratory of Cell Engineering and Biomedicine Technique, and Research Center of Tissue Engineering and Stem Cell Technique, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 8196046, (to YC); a grant from Department of Science and Technology of Guizhou Province, No. [2020] 6013, No. [2020]4Y137 (to YC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
氧化石墨烯：含有羟基(-OH)、羧基(-COOH)和羰基(-CO-)，能提供更大的表面积且表面活性更强，并且其特殊的sp2键合和六角形碳结构具有较佳的机械强度，能够有效调控细胞行为，为细胞提供定位点和诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，可作为涂层材料改善钛合金内固定与骨组织之间的相容性。
聚乙二醇：为环氧乙烷水解产物的聚合物，无毒、无刺激性，被广泛应用于各种药物制剂中；聚乙二醇是非离子型的水溶性聚合物，能与许多极性较高的物质配伍。

背景：聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯(poly3-hydroxybutyrate4-hydroxybutyrate，P34HB)支架因亲水性不足而在组织工程领域的应用受限。
目的：探索P34HB、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)共溶剂混合氧化石墨烯(graphene oxide，GO)复合静电纺丝支架的理化性能和生物相容性。
方法：采用静电纺丝技术分别制备P34HB、P34HB/PEG、P34HB/PEG/GO支架材料，利用扫描电镜观察静电纺丝支架的三维结构，光学测量仪测定支架上水滴的静接触角，力学测试仪分析静电纺丝支架的拉伸应力应变情况和拉伸弹性模量。将3种支架分别与大鼠骨髓间充质干细胞共培养，MTT法检测细胞黏附，Alamar blue法检测细胞增殖，Live/Dead 荧光染色观察细胞存活率，扫描电镜观察细胞形态。
结果与结论：①扫描电镜显示3组支架纤维随机分布，P34HB、P34HB/PEG、P34HB/PEG/GO组纤维直径逐渐减少；②P34HB/PEG、P34HB/PEG/GO支架的接触角小于P34HB支架(P < 0.01)；③P34HB/PEG、P34HB/PEG/GO支架的应变率低于P34HB支架(P < 0.05或P < 0.01)，P34HB/PEG/GO支架的弹性模量高于P34HB/PEG支架(P < 0.05)，3组支架抗拉强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④P34HB/PEG/GO组共培养1，3，6 h的细胞黏附数量多于P34HB组、P34HB/PEG组(P < 0.01)，且P34HB/PEG组多于P34HB组(P < 0.01)；⑤P34HB/PEG/GO组共培养4，7 d的细胞增殖快于P34HB组、P34HB/PEG组(P < 0.05或P < 0.01)；⑥共培养7 d后，扫描电镜显示P34HB/PEG/GO支架表面细胞量最大、铺展最好，Live/Dead 荧光染色该组细胞存活率最高；⑦结果表明，P34HB/PEG/GO静电纺丝支架具有一定的力学性能与良好的亲水性，能有效促进细胞增殖、黏附。

https://orcid.org/0000-0002-9773-1365 (刘鋆) ；https://orcid.org/0000-0001-5670-6289 (叶川)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 氧化石墨烯, 聚乙二醇, 组织工程, 支架, 静电纺丝, 生物材料

Abstract: BACKGROUND: The application of poly3-hydroxybutyrate 4-hydroxybutyrate (P34HB) scaffolds in tissue engineering has been limited due to lacking hydrophilicity.
OBJECTIVE: To explore the physicochemical properties and biocompatibility of P34HB as well as polyethylene glycol (PEG) co-solvent mixed graphene oxide (GO) electroplating scaffolds.
METHODS: The scaffolds of P34HB, P34HB/PEG and P34HB/PEG/GO had been prepared by electrospinning technology. The three-dimensional structure of the scaffold had been observed by scanning electron microscopy. The contact angle of water droplets on the scaffold had been measured by optical measuring instrument. The tensile stress, strain and elastic modulus of electrospinning frame were analyzed by mechanical tester. The three kinds of scaffolds had been co-cultured with rat bone marrow mesenchymal stem cells respectively. Cell adhesion had been detected by MTT assay. Cell proliferation was detected by Alamar blue assay. Cell survival rate had been observed by Live/Dead fluorescence staining. Cell morphology had been observed by scanning electron microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy had showed random distribution of scaffold fibers in the three groups, and the fiber diameters of P34HB, P34HB/PEG, and P34HB/PEG/GO groups gradually decreased. (2) The contact angles of P34HB/PEG and P34HB/PEG/GO scaffolds were smaller than that of the P34HB scaffold (P < 0.01). (3) The strain rates of P34HB/PEG and P34HB/PEG/GO scaffolds were lower than that of P34HB scaffold (P < 0.05 or
P < 0.01), and the elastic modulus of P34HB/PEG/GO scaffolds was higher than that of P34HB/PEG scaffold (P < 0.05). There was no significant difference in the tensile strength among the three groups (P > 0.05). (4) At 1, 3, and 6 hours of co-culture, the number of cell adhesion in the P34HB/PEG/GO group was higher than that in the P34HB and P34HB/PEG groups (P < 0.01), and the number of cell adhesion in the P34HB/PEG group was higher than that in the P34HB group
(P < 0.01). (5) At 4 and 7 days of co-culture, the proliferation of cells in the P34HB/PEG/GO group was faster than that in the P34HB group and P34HB/PEG group (P < 0.05 or P < 0.01). (6) After 7 days of co-culture, scanning electron microscopy showed that the surface cell volume of P34HB/PEG/GO scaffold was largest and best spread, and the cell survival rate of Live/Dead fluorescence staining group was highest. (7) The results have showed that P34HB/PEG/GO electrospinning scaffold had certain mechanical properties and good hydrophilicity, and could effectively promote cell proliferation and adhesion.

Key words: bone, material, graphene oxide, polyethylene glycol, tissue-engineered, scaffold, electrospun, biomaterial

中图分类号:

刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.

Liu Jun, Yang Long, Wang Weiyu, Zhou Yuhu, Wu Ying, Lu Tao, Shu Liping, Ma Minxian, Ye Chuan. Preparation and properties of poly3-hydroxybutyrate 4-hydroxybutyrate/polyethylene glycol/graphene oxide tissue-engineered scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(22): 3466-3472.

图/表（结果） 9

2.1 静电纺丝支架的构建 P34HB、P34HB/PEG、P34HB/PEG/GO静电纺丝前驱液的电导率分别为(0.73±0.02)，(5.34±0.08)，(2.50±0.03) μs/cm，3组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见图1。

当黏度仪转子速度为3 r/min时，P34HB组的黏度明显小于P34HB/PEG组、P34HB/PEG/GO组(P < 0.01)；当转子速度为12 r/min时，P34HB/PEG/GO组黏度明显大于P34HB组、P34HB/PEG组(P < 0.01，P < 0.05)；当转子速度为20 r/min时, P34HB组的黏度低于P34HB/PEG/GO组(P < 0.05)，见表1，图1。P34HB组、P34HB/PEG组、P34HB/PEG/GO组喷射流半径夹角分别约为40°，77°，52°，见图1。

2.2 静电纺丝支架形态学表征体式显微镜显示，P34HB、P34HB/PEG支架表面光滑，P34HB/PEG/GO支架表面粗糙，并可见散在均匀分布的黑点，扫描电镜可见各组支架纤维呈随机分布，P34HB、P34HB/PEG、P34HB/PEG/GO支架的平均纤维直径分别为0.95，0.88，0.64 μm，见图2。

2.3 静电纺丝支架的亲水性 P34HB支架的水接触角(107.3± 4.4)°明显高于P34HB/PEG(60.1±6.0)°和P34HB/PEG/GO支架(70.5±3.1)°(P < 0.01)，见图3。

2.4 静电纺丝支架的力学性能结合各组应力-位移曲线，P34HB组的应变程度大于P34HB/PEG组、P34HB/PEG/GO组
(P < 0.05，P < 0.01)，P34HB/PEG组的弹性模量小于P34HB/PEG/GO组(P < 0.05)，3组支架在抗拉强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.5 静电纺丝支架的细胞相容性流式分析显示，所提取的细胞不表达CD34，高表达CD105，见图5，可鉴定为干细胞。
2.5.1 细胞黏附实验结果 MTT法测试显示，P34HB/PEG/GO组培养1，3，6 h的细胞黏附数量多于P34HB组、P34HB/PEG组(P < 0.01)，见图6。

2.5.2 细胞增殖实验结果将静电纺丝支架与骨髓间充质干细胞共培养1，4， 7 d后检测各组荧光强度，直接反映细胞量，可见细胞在3组支架上均有持续增殖，其中P34HB/PEG/GO组第1天的细胞量高于P34HB组(P < 0.05)，第4，7天的细胞量明显高于P34HB组、P34HB/PEG组(P < 0.01，P < 0.05)，未见明显细胞毒性，见图7。

2.5.3 细胞Live/Dead染色结果共培养第7天的扫描电镜显示，P34HB组细胞呈球状分布于纤维丝，未出现明显的细胞铺展及伪足伸出；P34HB/PEG组细胞与纤维丝融合，但数量较少；P34HB/PEG/GO组细胞铺展，细胞与纤维丝融合，伪足伸出，见图8。共培养第7天的Live/Dead染色显示，P34HB组出现大量红色荧光(死亡细胞)，P34HB/PEG及P34HB/PEG/GO组红色荧光明显减少，见图8。经image pro plus 6.0计算，P34HB组、P34HB/PEG组、P34HB/PEG/GO组的细胞存活率分别为(41.14±3.11)%，(81.21±2.50)%，(93.25±5.21)%。

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引言

静电纺丝制备的组织工程支架微观上具备纳微米级别的纤维结构，呈交错的网络形状，具有可控的力学性能和粗糙度，高孔隙率和孔径的纤维排列可模拟细胞外基质结构，进而促进细胞的黏附、生长和分化[1]。聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯(poly3-hydroxybutyrate4-hydroxybutyrate，P34HB)的可纺性良好，具备一定的力学性能，其电纺纤维支架材料应用于骨组织工程可修复SD大鼠颅骨缺损[2]，但亲水性较差限制了其在生物医学方面的应用[3-4]。现阶段对材料的改性分别有物理改性[5-7]、化学改性[8-10]、生物活性物质修饰[11-13]、纳米粒子修饰等方法[14]，但过程较为复杂且不可控因素增加。作者设想，能否将一两种材料通过共同溶剂简单混合后，基于静电纺丝技术制备一种既可以保证良好生物相容性的同时又能够使原材料发挥各自优势特点的支架材料。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是亲水性生物材料，具备良好的生物相容性，在生物制药领域应用广泛，与P34HB的复合支架材料在促进骨再生上取得了有效作用[15]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)含有羟基(-OH)、羧基(-COOH)和羰基(-CO-)，能提供更大的表面积且表面活性更强，同时其边缘的羟基(-OH)、羧基(-COOH)可通过静电力与其他材料相结合，并且其特殊的sp2键合和六角形碳结构具有较佳的机械强度，能够有效调控细胞行为[16-17]，为细胞提供定位点和诱导骨髓间充质干细胞成骨分化[18-19]，可作为涂层材料改善钛合金内固定与骨组织之间的相容性[20]。另外，石墨烯基材料具有良好的抗菌性能[21]，能够保持一定的抗菌作用，避免细胞生长的污染风险，但GO本身不具备可纺性，需要和其他材料复合才能静电纺丝成为纳微米纤维而发挥作用。此外，GO与PEG 4000相结合可降低GO的不良作用[22]。
实验基于静电纺丝技术将P34HB、PEG、GO相互整合，进行体外生物相容性和力学研究，验证此配比方案是否引起物理结构和化学属性改变，是否可保留良好的生物相容性及稳定的力学属性，成为新的支架材料以改善支架功能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计基于高压静电纺织技术的组织工程支架构建实验。
1.2 时间及地点实验于2018年5月至2019年1月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验室完成。
1.3 材料 P34HB(清华大学高分子研究所，中国)；PEG 4000 (北京索莱宝科技有限公司)；GO粉(广州贝奥吉因生物科技有限公司)。
1.3.1 实验动物 4周龄SD大鼠，体质量50-60 g，雌雄不拘，由贵州医科大学动物实验中心提供，许可证号：
SYXK(黔)2012-0001。动物实验获贵州医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号：1800976。
1.3.2 实验主要试剂及仪器无水乙醇(天津永大化学试剂有限公司)；二氯甲烷(天津富宇化学试剂公司)；DMEM培养基(GBICO，Co.)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；激光共聚焦显微镜LSM5 Excitor(Carl Zeiss)；接触角测试仪(DropMaster，DMo-501)；扫描电镜(Hitachi，日本)；多功能酶标仪(SpectraMax M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)；力学测试仪(上海倾计仪器有限公司)；超声分散仪(Scientz-2400F，宁波)；静电纺织机(SS-2534H，Ucalery，中国北京)；MTT(北京索莱宝科技有限公司)；Alamar Blue测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；其他分析级化学试剂和溶剂均来自细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室(贵州医科大学，贵阳，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 静电纺丝前驱液及支架制备
静电纺丝前驱液的制备：GO质量浓度在1.0 g/L时生物相容性较好[19-20]，因此将10 mg GO粉末置于10 mL二氯甲烷中进行避光超声分散3 h。称量0.7 g P34HB、0.5 g PEG 粉末同时混入上述溶液中磁力均匀溶解2 h，最后定容
10 mL(P34HB/PEG/GO组)。取0.7 g P34HB 溶于10 mL二氯甲烷中避光超声分散3 h(P34HB组)。取0.7 g P34HB 及0.5 g PEG 共同溶于10 mL二氯甲烷中避光超声分散3 h(P34HB/PEG组)。
静电纺丝支架的制备：取10 mL注射器6号注射针头，置于电纺机中，使用锡箔纸滚轴为接收器，接收器转速为
20 r/min，设置正电压约10 kV，负电压10 kV，温度37 ℃，相对湿度20%-40%，静电纺丝前驱液推注速度0.3 mm/min，接收距离15-20 cm(从喷头到接收器)，收集取下后放置于真空烘箱中干燥48 h，使残余有机溶剂蒸发，将制备的纤维支架裁剪为实验所需大小后备用，双面分别紫外照射4 h除菌。
1.4.2 支架表面形态学检测利用体视显微镜和扫描电子显微镜(加速电压为20 kV)对支架进行表面形态、纤维取向、纤维直径表征。使用Image-Pro Plus 6.0对每一组样品随机选取100根纤维的平均直径进行评估。
1.4.3 支架亲水性能检测采用光学仪器测定支架表面与水滴之间的静态接触角，每组3个样品。用CCD相机测量每个样品上4个不同的水滴点。
1.4.4 支架力学性能检测将材料裁剪成10 mm×15 mm×
0.14 mm大小、有效拉伸长度10 mm的试件，每组5个样本，经万能力学试验机进行拉伸测试(100 N传感器，拉伸速度
1 mm/min)，得到支架的力-位移关系图、应变率、抗拉强度、杨氏模量。
1.4.5 骨髓间充质干细胞的分离培养脱颈处死SD大鼠，无菌条件下取股骨及胫骨，骨头分离后将一侧骨垢剪断，用
5 mL注射器吸取一定量的无菌PBS，将骨髓冲洗至无菌培养品中，反复吹打形成细胞悬浊液，将细胞悬液以1 500 r/min离心
5 min，去上清，用DMEM完全培养基重悬细胞，获得鼠源性骨髓间充质干细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养扩增至第3代，通过流式细胞学检测其有效性。
1.4.6 支架的细胞相容性实验
细胞黏附实验：将3组支架材料剪成96孔板小孔大小，每组15个复孔，铺于板底，加入100 μL培养基孵育过夜，弃上清。取细胞浓度为1×108 L-1 的第3代骨髓间充质干细胞悬液，以100 μL/孔接种，于1，3，6 h通过MTT法检测细胞黏附情况[23]。
细胞增殖实验：将3组支架材料裁剪为5 cm×5 cm大小，置于6孔板中，每孔接种2×105个骨髓间充质干细胞。复合培养1，4，7 d后，根据Alamar Blue测定试剂盒说明书，将测定溶液与细胞培养基以体积比1∶10混合后加入到每个测试孔中，37 ℃孵育5 h。温育后，取每个样品的测定溶液100 μL放入96孔板中，使用多功能酶标仪在544 nm/590 nm的激发/发射下测量荧光强度。
Live/Dead染色：将3组支架裁剪为5 cm×5 cm大小，置于6孔板中，每孔接种2×105个骨髓间充质干细胞。复合培养7 d后将样本制备为2 cm×2 cm大小，用PBS冲洗2次，每次5 min；加入配置好的Live/Dead 染色试剂室温下作用1 h；PBS冲洗2次，每次5 min；共聚焦显微镜下观察，红色荧光为死细胞，绿色荧光为活细胞，并以Image pro 6.0 (Rockville，MD，USA)计算其存活率。
1.5 主要观察指标 3组支架的亲水性、力学性能、微观结构及生物相容性。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 22.0软件进行处理，结果采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间统计学处理，P < 0.05表示差异有显著性意义，P < 0.01表示差异有非常显著性意义。

讨论

此次实验基于3种材料的各自特点，合理采用共混方法对P34HB材料的亲水性做出明显改善。采用静电纺丝方法所获得的复合静电纺丝支架具备一定的力学强度，结构稳定，具有相对粗糙的表面形貌，可促进细胞的黏附、增殖，有较为理想的细胞存活效率。
对于静电纺丝，3组前驱液在转子不同速度下的表现不同，可证明均为非牛顿流体，可进行静电纺丝。前驱液体分子量过低的聚合物溶液黏度较低，可导致成丝效果差，但黏度过高将引起液体表面张力增加，然而只有静电力大于溶液的表面张力时才能形成喷射细流，对于表面张力大的液体，采用加入表面张力低的溶剂或添加表面活性剂以降低表面张力，保证静电纺丝顺利进行。P34HB/PEG的黏度值升高有利于成丝，但表面张力增大需要更大的电场强度进行电纺，进一步容易造成静电击穿，而GO因氧化而引入的官能团同时具有亲水和亲油特性，可以吸附在液体界面降低表面张力[24-25]，已作为表面活性剂有所应用[26]。并且黏度随着GO加入继续升高，表明GO添加后不仅能够保持前驱液的黏性，也可以降低前驱液表面张力，使前驱液在电场力作用下被拉伸，纺丝成膜。高导电性的液体在电场作用下会变得不稳定，而导电能力太低会导致射流，因而得不到电场力的充分拉伸，难以得到均匀的纤维，P34HB/PEG电导率大，易发生静电击穿，随着GO的加入虽然降低了电导率，但能维持静电纺丝稳定进行。
在静电纺丝非稳定段，纤维丝束可因为同性相斥作用互相远离而分散，同时高黏度与高电导率在静电纺丝过程中相互拮抗，因此P34HB/PEG与P34HB支架的纤维直径无明显差别。GO添加后成为具有高黏度、低张力、较低导电率的前驱液，虽然低张力和低电导率互为拮抗，但高黏度有利于静电纺丝，因此P34HB/PEG/GO支架的纤维直径有效降低，与现有研究结果相同[27]，并可引起单位面积内的支架中纤维数量增加，纤维之间相互固定点增加，导致纤维丝之间相互滑移作用减少，获得更强的稳定性，应变率降低，与力学表征结果一致。并且GO添加后支架表面变得粗糙，相当于增加了更多与细胞接触的面积，这将促进细胞黏附等生物行为[28]，粗糙度已作为医疗材料必须考虑的重要一环[29-30]。
在3种支架材料与骨髓间充质干细胞共培养条件下，MTT检测、Alamar blue及Live/Dead染色结果表明P34HB/PEG材料较P34HB更利于细胞的黏附、增殖，说明PEG对细胞生长、增殖有促进作用[31-32]。对于细胞黏附情况，材料的亲疏水特性具有很重要的作用，尤其此次实验中PEG明确改善了P34HB的亲水性，然而亲水性极强时不利于蛋白质吸附，从而对细胞黏附产生不利情况，而疏水性表面与非黏附蛋白接触将阻碍黏附蛋白的吸附，同时吸附在表面的黏附蛋白由于吸附不可逆，使蛋白质分子链中与细胞膜表面整合素结合位点无法暴露而影响黏附行为。虽然有研究表明PEG有减少细胞黏附的作用，但此次实验中MTT检测共培养的1，3，6 h各时间段，P34HB组弱于P34HB/PEG组与P34HB/PEG/GO组，PEG明显改善了亲水性，GO的添加除了依旧保留亲水特性外还可提供更多的活性基团[33]，增加细胞黏附能力，并且GO加入后有增效作用[34-35]。并且有研究证明，PEG在与其他生物高聚物合用时对干细胞的黏附、增殖均有积极作用[36-38]。关于细胞增殖情况，共培养第1天时P34HB组与P34HB/PEG组无明显差异，P34HB组低于较P34HB/PEG/GO组，说明PEG与P34HB共混后有促进细胞增殖的趋势和潜力，但GO的添加具有明确的促进增殖作用，第4天后P34HB/PEG组明显优于P34HB组，但小于P34HB/PEG/GO组，说明PEG与P34HB共混对细胞增殖的促进作用逐渐明确，在GO添加后更优于P34HB/PEG组，至第7天后P34HB/PEG组相较于P34HB组无明显差别，但P34HB/PEG/GO组仍明显优于其他2组，说明单纯P34HB支架在共混后所具备的增益效果不足以长期维持，而GO的添加可使支架具备持续促进增殖作用。Live/Dead染色中P34HB/PEG/GO支架细胞依旧保持较高的存活率。
综上所述，PEG在电纺过程中可增加支架电导率和黏度，但未出现静电击穿等不良反应，在材料上可以改善支架材料的亲水性，但不至于因过于亲水而引起细胞黏附、增殖受阻，并且在与高聚物P34HB联用时对细胞黏附、增殖均有促进作用。在P34HB/PEG/GO静电纺丝支架中，GO添加后能通过调节表面张力、导电率使静电纺丝顺利进行，与PEG共同作用改变支架材料的微结构，在PEG明显改善支架亲水性的情况下提供多种功能基团，为细胞提供结合位点，是具有良好的力学稳定性、生物相容性的组织工程支架。
此次实验支架性能的检测均为体外条件下进行，下一步拟行分子生物学相关检测及大型动物原位建模植入，进一步增加当前结果的可靠性。然而基于已有数据来看，对比无GO添加组，P34HB/PEG/GO复合静电纺丝支架具有更稳定的力学结构及生物相容性，因此这种限制不影响此次实验的主要结论。实验成功制备了3种不同的支架，结果表明PEG与GO均能显著影响支架的力学性能、生物相容性及内部三维结构，拉伸弹性模量可达到100 MPa，应变率低，在细胞增殖、黏附、存活上均有明显改善，可作为改良后的P34HB静电纺丝骨组织工程支架应用，有望成为骨组织工程新型支架。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价

Preparation and properties of poly3-hydroxybutyrate 4-hydroxybutyrate/polyethylene glycol/graphene oxide tissue-engineered scaffolds

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