脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3173

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (22): 3473-3478.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3173

• 复合支架材料 composite scaffold materials • 上一篇下一篇

脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架

王皓1，2，陈明学2，3，李俊康2，罗旭江1，2，彭礼庆1，2，李获1，2，黄波1，2，田广招2，刘舒云2，眭翔2，黄靖香2，郭全义2，鲁晓波1

1西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省泸州市 646000；2中国人民解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853；3北京积水潭医院矫形骨科，北京市 100035

收稿日期:2020-07-07 修回日期:2020-07-13 接受日期:2020-08-19 出版日期:2021-08-08 发布日期:2021-01-19
通讯作者: 郭全义，教授，主任医师，中国人民解放军总医院骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853 鲁晓波，教授，主任医师，西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省泸州市 646000
作者简介:王皓，男，1991年生，四川省泸州市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事半月板修复方向的研究。
基金资助:
国家重点研发计划(2017YFC1103400)，项目参与者：刘舒云；国家自然科学基金(81972070)，项目负责人：郭全义

Decellularized porcine skin matrix for tissue-engineered meniscus scaffold

Wang Hao1, 2, Chen Mingxue2, 3, Li Junkang2, Luo Xujiang1, 2, Peng Liqing1, 2, Li Huo1, 2, Huang Bo1, 2, Tian Guangzhao2, Liu Shuyun2, Sui Xiang2, Huang Jingxiang2, Guo Quanyi2, Lu Xiaobo1

1Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China; 3Department of Orthopedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China

Received:2020-07-07 Revised:2020-07-13 Accepted:2020-08-19 Online:2021-08-08 Published:2021-01-19
Contact: Guo Quanyi, Professor, Chief physician, Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China Lu Xiaobo, Professor, Chief physician, Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Wang Hao, Master candidate, Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
Supported by:
the National Key R&D Program of China, No. 2017YFC1103400 (to LSY); the National Natural Science Foundation of China, No. 81972070 (to GQY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脱细胞猪皮基质：猪皮基质的主要成分是I型胶原蛋白(80%-85%)，采用胰蛋白酶、Triton X-100、十二烷基磺酸钠组合脱细胞处理制备的脱细胞猪皮基质，可很好地保留胶原蛋白成分，并具有良好的生物力学性能。
组织工程支架：组织工程的关键要素包括种子细胞、支架材料和活性因子，组织工程支架可为种子细胞提供生长微环境，是种子细胞生长代谢及排泄代谢产物的载体。

背景：半月板损伤的再生修复目前仍然是一个科学性难题，构建具有良好生物力学性能与细胞相容性的组织工程支架至关重要。
目的：制备脱细胞猪皮基质支架，评价其生物力学性能和细胞相容性。
方法：采用胰蛋白酶、Triton X-100、十二烷基磺酸钠组合对猪皮进行脱细胞处理，获得脱细胞猪皮基质，采用DAPI染色观察脱细胞效果，扫描电镜观察其微观结构。通过组织学染色、胶原和糖胺多糖定量及生物力学检测对比脱细胞猪皮基质与天然半月板的差异。将第3代骨髓间充质干细胞接种于脱细胞猪皮基质上，培养3 d后分别进行扫描电镜、死/活细胞染色和鬼笔环肽染色观察。
结果与结论：①DAPI染色显示，脱细胞猪皮基质无细胞核结构；扫描电镜显示，脱细胞猪皮基质表面较为粗糙，表面纤维呈拓扑学结构；②组织学染色显示，天然半月板组织含有丰富的细胞外基质，半月板细胞在基质中均匀分布，胶原纤维致密且排列规则，胶原成分主要以Ⅰ型胶原纤维为主，含有糖胺多糖成分；脱细胞猪皮基质无细胞核，呈疏松的纤维条索状，有较多的孔隙结构，胶原成分主要以Ⅰ型胶原纤维为主，含有糖胺多糖成分；③脱细胞猪皮基质的胶原含量、拉伸弹性模量与天然半月板比较差异无显著性意义(P > 0.05)，糖胺多糖含量、压缩弹性模量低于天然半月板(P < 0.05)，并且脱细胞猪皮基质的生物力学性能足够承受膝关节的负荷、保持支架的完整；④扫描电镜显示，骨髓间充质干细胞黏附分布在猪皮基质的孔隙结构中，细胞呈椭圆形，聚集生长；⑤死/活细胞染色显示，脱细胞猪皮基质上的骨髓间充质干细胞具有较高的活性(94.0±3.8)%；⑥鬼笔环肽/DAPI染色显示，骨髓间充质干细胞在脱细胞猪皮基质上呈现出很好的铺展状；⑦结果表明，脱细胞猪皮基质与天然半月板具有类似的胶原成分，呈现出良好的生物力学性能和细胞相容性，有利于细胞的黏附和生长。
https://orcid.org/0000-0002-5351-377X (王皓)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 半月板, 组织工程, 脱细胞支架, 猪皮基质, 胶原, 细胞外基质

Abstract: BACKGROUND: Regeneration and repair of the injured meniscus remain scientific challenges. It is of significance to construct a tissue-engineered scaffold with good biomechanical performance and cytocompatibility.
OBJECTIVE: To prepare decellularized porcine skin matrix scaffold and evaluate its biomechanical properties and cytocompatibility.
METHODS: Porcine skin was decellularized with the combination of trypsin, Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate to obtain decellularized porcine skin matrix. DAPI staining was used to observe whether the cells were well removed and scanning electron microscope to observe its microstructure. The decellularized porcine skin matrix was compared with natural meniscus in term of histological staining, contents of collagen and glycosaminoglycans, and biomechanical properties. The third-generation bone marrow mesenchymal stem cells were seeded on the decellularized porcine skin matrix. After 3 days of culture, the scanning electron microscopy, dead/live cell staining and phalloidin staining were used to observe cytocompatibility of the decellularized porcine skin matrix.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) DAPI staining showed that no cell nucleus was found in the decellularized porcine skin matrix. Scanning electron microscopy showed that the surface of the decellularized porcine skin matrix was rough, and the surface fibers showed a topological structure. (2) Histological staining showed that the natural meniscus tissue was rich in extracellular matrix, and the meniscus cells were evenly distributed in the matrix. The collagen fibers were dense and arranged regularly, and the collagen composition was mainly type I collagen fibers and contained glycosaminoglycan components. The decellularized porcine skin matrix had no cell nucleus and was in the shape of loose fiber strips with more pore structure, and its collagen component was mainly type I collagen fiber and contained glycosaminoglycan components. (3) There was no significant difference in collagen content and tensile modulus between decellularized porcine skin matrix and natural meniscus (P > 0.05), while the glycosaminoglycan content and compression modulus were lower than those of the natural meniscus (P < 0.05). The biomechanical properties of the decellularized porcine skin matrix are sufficient to bear the load of the knee joint and maintain the integrity of the scaffold. (4) Scanning electron microscope showed that bone marrow mesenchymal stem cells adhered to the pore structure of porcine skin matrix, and the cells were elliptical and grew in clusters. (5) Dead/live cell staining showed that the bone marrow mesenchymal stem cells on the decellularized porcine skin matrix had high activity (94.0±3.8)%. (6) Phalloidin/DAPI staining showed that bone marrow mesenchymal stem cells showed good spreading on the decellularized porcine skin matrix. (7) The results showed that decellularized porcine skin matrix has similar collagen components as the natural meniscus, and presents good biomechanical performance and cytocompatibility, and is conducive to cell adhesion and growth.

Key words: meniscus, tissue engineering, decellularized scaffold, porcine skin matrix, collagen, extracellular matrix

中图分类号:

王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.

Wang Hao, Chen Mingxue, Li Junkang, Luo Xujiang, Peng Liqing, Li Huo, Huang Bo, Tian Guangzhao, Liu Shuyun, Sui Xiang, Huang Jingxiang, Guo Quanyi, Lu Xiaobo. Decellularized porcine skin matrix for tissue-engineered meniscus scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(22): 3473-3478.

图/表（结果） 9

2.1 脱细胞猪皮基质大体观察结果图1为兔天然半月板和脱细胞猪皮基质的大体观，实验成功制备了脱细胞猪皮基质，并裁剪成类似于天然半月板的外形结构。

2.2 猪皮基质脱细胞前后的DAPI染色结果如图2所示，猪皮基质脱细胞前可见大量细胞核结构(蓝色荧光)，脱细胞处理后的猪皮基质未见细胞核结构，表明脱细胞理想。

2.3 脱细胞猪皮基质扫描电镜观察结果如图3所示，脱细胞猪皮基质支架表面较为粗糙，并且表面纤维呈拓扑学结构。2.4 脱细胞猪皮基质组织学染色结果

2.4.1 苏木精-伊红染色天然半月板组织含有丰富的细胞外基质，半月板细胞在基质中均匀分布，胶原纤维致密且排列规则，见图4A1；脱细胞猪皮基质未见细胞核，呈疏松的纤维条索状，有较多的孔隙结构，见图4A2。

2.4.2 天狼猩红染色天然半月板组织主要显现出强折光性，呈红色或黄色的Ⅰ型胶原纤维，部分显现出弱折光性，呈绿色较细的Ⅲ型胶原纤维和疏松状的Ⅱ型胶原纤维，见图4B1；脱细胞猪皮基质可见大量很强的双折光性，呈红色或黄色的Ⅰ型胶原纤维，见图4B2，表明天然半月板和脱细胞猪皮基质的胶原成分主要以Ⅰ型胶原纤维为主。
2.4.3 甲苯胺蓝染色脱细胞猪皮基质和天然半月板组织的甲苯胺蓝染色均呈现阳性，着色明显，见图4C1、C2，表明天然半月板和脱细胞猪皮基质两者均含有糖胺多糖成分。
2.5 脱细胞猪皮基质组织成分定量检测

2.5.1 胶原含量测定胶原定量检测结果显示，天然半月板中胶原含量为(42.162±2.472) mg/g，脱细胞猪皮基质中胶原含量为(44.639±1.094) mg/g，两组间比较差异无显著性意义(t=1.833，P=0.116 5)，见图5A，提示脱细胞猪皮基质与天然半月板具有相同含量胶原成分。
2.5.2 糖胺多糖含量测定糖胺多糖定量检测结果显示，天然半月板中糖胺多糖含量为(0.868±0.199) mg/g，脱细胞猪皮基质中糖胺多糖含量为(0.064±0.010) mg/g，两组间比较差异有显著性意义(t=6.982，P=0.002 2)，见图5B，提示脱细胞猪皮基质糖胺多糖含量少于天然半月板。

2.6 脱细胞猪皮基质生物力学检测结果天然半月板与脱细胞猪皮基质的压缩弹性模量分别为(15.65±5.00) MPa和(2.40±1.00) MPa，两组间比较差异有显著性意义(t=4.488，P=0.010 9)，见图6A；天然半月板与脱细胞猪皮基质的拉伸弹性模量分别为(169.90±53.25) MPa和(74.41±30.29) MPa，组间比较差异无显著性意义(t=2.700，P=0.054 1)，见图6B。

2.7 脱细胞猪皮基质细胞相容性检测结果
2.7.1 细胞-支架复合物扫描电镜观察扫描电镜结果可见，大量骨髓间充质干细胞黏附、分布在脱细胞猪皮基质支架的孔隙结构中，细胞呈椭圆形，聚集生长，见图7，表明脱细胞猪皮基质支架有利于细胞黏附和生长。

2.7.2 细胞死/活染色细胞死/活染色可见大量活细胞被染成绿色荧光亮点(图8A)，仅有少量死细胞被染成红色荧光亮点(图8B)，呈现出很高的细胞活性(94.0±3.8)%，表明猪皮基质支架具有很好的细胞相容性，可以保持骨髓间充质干细胞很高的存活率。

2.7.3 鬼笔环肽/DAPI染色鬼笔环肽/DAPI染色结果显示细胞核被染成蓝色荧光亮点(图9A)，细胞骨架被染成红色荧光(图9B)，骨髓间充质干细胞在脱细胞猪皮基质支架上呈现出很好的铺展状，表明脱细胞猪皮基质支架有利于骨髓间充质干细胞黏附生长。

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。
1.2 时间及地点实验于2019年8月至2020年6月在中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 猪皮与半月板猪皮购自北京市屠宰市场。1月龄雄性新西兰大白兔2只，体质量约0.5 kg；半月板为新西兰大白兔内侧半月板，新西兰大白兔来自解放军总医院动物实验中心，许可证号：SYXK(军)2012-0062。实验方案已获得解放军总医院伦理委员会批准。
1.3.2 实验用细胞与试剂骨髓间充质干细胞(解放军总医院骨科研究所)；DMEM 培养基(美国Corning 公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；0.125%，0.25%胰蛋白酶(美国Sigma公司)；青霉素-链霉素双抗(美国Gibco公司)；羟脯氨酸测试盒(南京建成科技有限公司)；糖胺多糖定量试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)；甲苯胺蓝染色试剂盒、苏木精-伊红染色试剂盒、苦味酸-天狼猩红染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛(北京化学试剂有限公司)。
1.3.3 实验用材料与仪器离心管、培养瓶、培养皿、移液管、24与48孔板(美国 Corning 公司)；S-4800型扫描电镜(日本Hitachi公司)；60Co照射(解放军军事医学科学院)；5969力学试验机(美国INSTRON英斯特郎公司)；冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司)；低温高速离心机(德国Thermo公司)；CO2培养箱(德国 Hereus公司)；紫外分光光度计DU640型(美国Beckman公司)；BH-2型倒置显微镜、IX70 型荧光显微镜(日本Olympus公司)；TCS SP8共聚焦显微镜(德国 Leica公司)；自动脱水机(德国Leica公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 脱细胞猪皮基质支架的制备取全层猪皮，去毛去脂后用蒸馏水漂洗3遍，然后用体积分数3%过氧化氢溶液清洗3次，每次10 min，之后反复用蒸馏水、PBS漂洗干净。将处理后的猪皮剪成约5 cm×2 cm大小的组织片， -20 ℃冷冻4 h后置于室温下融解，反复冻融10个循环；0.125%胰蛋白酶洗涤4 h、2%SDS洗涤36 h和0.5%TritonX-100洗涤12 h，交替进行脱细胞处理；冰冻切片不同层面DAPI染色未见细胞核后，用PBS反复清洗去除残留的SDS与TritonX-100；最后脱细胞猪皮基质支架冷冻干燥，修剪成半月板形状后60Co消毒密封保存备用。
1.4.2 猪皮基质脱细胞前后比较猪皮基质脱细胞前后经OCT包埋后行冰冻切片(厚度约5 µm)，丙酮固定30 min，PBS清洗1次后行DAPI染色，PBS清洗2次，置于荧光显微镜下观察细胞核残留情况。
1.4.3 扫描电镜观察将制备好的猪皮基质冷冻干燥、喷金，置于扫描电镜下观察。
1.4.4 组织学染色比较将脱细胞猪皮基质与兔天然半月板组织分别用40 g/L多聚甲醛固定48 h、Bouin氏液浸泡软化24 h，自动脱水机脱水后石蜡包埋，而后行石蜡切片(厚度约7 µm)，脱蜡后分别行苏木精-伊红染色、天狼猩红染色和甲苯胺蓝染色，常规脱水封固后置于倒置显微镜下观察。
1.4.5 组织学成分比较
胶原含量测定：羟脯氨酸约占胶原蛋白13.4%，极少量存在于弹性蛋白中，其他蛋白均不含有，因此测定羟脯氨酸含量就可以计算出样品的胶原含量。准备规格一致的脱细胞猪皮基质与兔天然半月板样品(每组3个样品)，采用羟脯氨酸试剂盒检测样品的胶原含量，具体实验步骤按照羟脯氨酸测试盒说明书进行。
糖胺多糖含量测定：准备规格一致的脱细胞猪皮基质与兔天然半月板样品(每组3个样品)，然后应用二甲基亚甲基蓝比色法检测样品的糖胺多糖含量，具体实验步骤按照糖胺多糖定量试剂盒说明书进行。
1.4.6 生物力学性能比较制备规格一致的生物样品，检测前置于PBS中保持湿润。
压缩性能检测：将样品放置在粘贴有砂纸的压盘上，压缩前预加载0.5 N，然后以3 mm/min速率压缩直至样品达12%应变，利用Origin 9.0软件根据所得数据绘制应力-应变曲线，计算弹性变形区曲线的斜率，求得每个样品压缩弹性模量。
拉伸性能检测：利用拉伸夹具将样品固定，预加载0.5 N，以5 mm/min的速率进行拉伸直至样品断裂，利用Origin 9.0软件根据所得数据绘制应力-应变曲线，计算弹性变形区曲线的斜率，求得每个样品拉伸弹性模量。
1.4.7 兔骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增无菌条件下抽取2只新西兰大白兔髂骨骨髓，注入含有淋巴细胞分离液的离心管内，2 000 r/min离心30 min，小心吸取第二层的淋巴细胞，注入含PBS的离心管内，反复吹打均匀后1 700 r/min再次离心10 min，弃掉上清，用含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养基重悬，转入培养瓶内，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养，72 h后换液。待细胞融合至90%时，0.25%胰酶消化传代培养至P3代备用。
1.4.8 细胞-支架复合物扫描电镜将P3代的骨髓间充质干细胞接种于脱细胞猪皮基质支架上，每个样品大约接种2×105个细胞，培养3 d，2.5%戊二醛固定细胞-支架复合物，经梯度乙醇脱水，临界点干燥、喷金后，扫描电镜下观察细胞生长情况。
1.4.9 细胞死/活染色将P3代骨髓间充质干细胞接种于脱细胞猪皮基质支架上，每个样品大约接种2×105个细胞，置于体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中孵育3 d，无菌PBS清洗2次，避光条件下加入细胞死/活荧光染液(含2 μmol/L calcein AM 和4 μmol/L EthD-1)避光孵育20 min，PBS再次清洗2次，激光共聚焦显微镜下观察细胞活性。随机选取5个感兴趣区域，计算细胞平均存活率，细胞存活率=活细胞/(死细胞+活细胞)×100%。
1.4.10 鬼笔环肽/DAPI染色将P3代骨髓间充质干细胞接种于脱细胞猪皮基质支架上，每个样品大约接种2×105个细胞，置于体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中孵育3 d，无菌PBS清洗3遍，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3遍，加入体积分数0.3%TritonX-100溶液孵育5 min以增加细胞通透性，去除TritonX-100溶液，避光条件下加入鬼笔环肽染液染色30 min，PBS清洗3遍，加入DAPI染色30 min，PBS清洗3遍，激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架情况。
1.5 主要观察指标脱细胞猪皮基质细胞核残留情况；脱细胞猪皮基质和兔天然半月板的大体观、微观结构、组织学染色、组织学成分定量、生物力学性能，以及脱细胞猪皮基质支架的细胞相容性。
1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析，定量数据用x±s表示，应用独立样本t检验两组数据是否存在统计学差异，当P < 0.05 时表示组间差异有显著性意义。

讨论

半月板损伤的再生修复目前仍是困扰科学家们的一大难题[11-12]。近年来组织工程技术的快速发展为半月板的再生修复提供新的可能[13]，支架材料在组织再生修复过程中发挥重要作用[14-15]。理想的组织工程半月板支架应具备以下特点[16]：①良好的生物相容性；②生物可降解性；③合适的机械强度；④易于成型加工制备。细胞外基质作为天然的生物可降解材料，可为细胞提供良好的微环境和为组织的再生提供结构支持，无疑是构建组织工程支架的理想材料之一[17]。在既往研究中猪皮基质已被应用于临床[18-19]，并且猪皮脱细胞真皮基质敷料已获得国家Ⅲ类医疗器械注册证[20]。脱细胞猪皮基质不仅力学性能好、可缝合性好，易于加工成型(可任意裁剪成特定匹配的形状，如半月板形状)，而且和半月板的主要成分均为Ⅰ型胶原，因此有望成为理想的组织工程半月板支架。
实验联合胰蛋白酶、SDS和TritonX-100作为洗涤剂进行脱细胞制备出脱细胞猪皮基质支架，DAPI染色证实猪皮基质脱细胞效果理想，未见细胞核结构。扫描电镜结果显示脱细胞猪皮基质支架表面粗糙，表面胶原纤维呈现出拓扑学结构，支架材料表面的拓扑学结构利于细胞的黏附、生长和增殖[21-22]。
胶原和糖胺多糖是半月板的主要成分[23]。实验分别对脱细胞猪皮基质和天然半月板组织进行组织学染色和定量分析，组织学染色显示两者甲苯胺蓝和天狼猩红染色均为阳性，表明脱细胞猪皮基质和天然半月板组织均含有胶原和糖胺多糖成分；进一步组织成分定量结果表明胶原含量两者无统计学差异，而脱细胞猪皮基质糖胺多糖含量明显少于天然半月板组织，主要的原因是糖胺多糖与水具有很好的结合性能，在脱细胞洗涤过程中容易被洗脱导致糖胺多糖的流失[24]。
支架的力学性能与其组织成分和结构是密不可分的。既往研究表明，半月板组织的胶原纤维主要负责承受拉伸负荷，而糖胺多糖主要负责支撑压缩负荷[25-26]。实验力学测试结果显示，脱细胞猪皮基质拉伸弹性模量接近于半月板，而压缩弹性模量明显低于半月板，力学测试结果和上述胶原、糖胺多糖定量结果相一致。由于胶原在脱细胞过程中未受明显影响，因此猪皮基质可以保留较高的拉伸性能，而压缩弹性模量明显低于半月板，与脱细胞过程中糖胺多糖的流失存在直接关系。
细胞死/活染色显示大量细胞存活(绿色荧光)，表明脱细胞猪皮基质支架具有很好的细胞相容性，可以维持很高的细胞活性，有利于细胞的生长。扫描电镜和鬼笔环肽/DAPI染色结果可见骨髓间充质干细胞呈现铺展形态，分布在支架的孔隙间，表明脱细胞猪皮基质有利于细胞黏附生长。
由于半月板处于复杂的膝关节力学环境中，因此组织工程半月板支架必须具备足够的力学性能才能在复杂的力学环境中保持支架的完整性，这是为细胞提供良好的生长环境和组织再生的前提[7，27]。由于实验采用的是猪皮组织整体脱细胞的方法，因此可以最大程度地保留组织原本的力学性能，尽管制备的脱细胞猪皮基质支架生物力学性能仍未达到半月板水平，但该支架的力学性能足够承受膝关节的负荷、保持支架的完整。相对于既往的组织工程半月板支架，此次实验制备的脱细胞猪皮基质支架在力学性能上有明显优势。ZHANG等[28]以聚己内酯为原料，采用熔融沉积方法构建组织工程半月板支架，支架的拉伸弹性模量和压缩弹性模量分别为32.49 MPa和20.42 MPa。YUAN等[29]以脱钙松质骨和半月板细胞外基质为原料，采用冷冻干燥的方法构建组织工程半月板支架，支架的拉伸弹性模量和压缩弹性模量分别为(19.09±2.38) kPa和(86.34±8.65)kPa。GAO等[30]以聚己内酯和半月板细胞外基质为原料，采用经典纺丝的方法构建组织工程半月板支架，支架的拉伸弹性模量和压缩弹性模量分别为(8.5±1.9)MPa和(0.21±0.03)MPa。
良好的细胞相容性是组织工程支架发挥功能的基本前提[31]。实验制备的脱细胞猪皮基质支架呈现出较好的细胞相容性，主要原因为：①猪皮基质为天然生物材料，和半月板的组织成分基本一致，有效成分为胶原和糖胺多糖，可有利于细胞的黏附、生长和增殖；②脱细胞过程中充分地洗涤可有效去除SDS等洗涤剂的残留，保证支架材料的无细胞毒性；③猪皮基质脱细胞处理后组织变得相对疏松，表面呈现的拓扑学结构有利于细胞的黏附。
与既往的组织工程半月板支架相比，脱细胞猪皮基质支架具有以下的优势：①来源丰富、价格低廉；②具有良好的生物力学性能和细胞相容性；③制备过程简单，无需特殊的设备仪器；④支架可修剪，体内植入时可根据实际情况进行修剪使用。
实验存在以下不足：①脱细胞过程中导致大量的糖胺多糖成分流失，进而导致压缩模量下降，未来需要进一步优化脱细胞流程；②半月板处在一个复杂的应力环境下，除了受到拉伸、压缩应力外，还会受到摩擦力、扭转力和剪切力的作用，由于实验条件受限，在生物力学测定时没有进行上述3种力学的测试；③猪皮基质为异体组织，没有进行免疫源性相关检测评估；④为体外实验，需要体内实验进一步验证其安全性和有效性。
脱细胞猪皮基质与天然半月板具有类似的胶原成分，呈现出良好的生物力学性能和细胞相容性，有利于细胞的黏附和生长，可用于未来组织工程半月板支架的构建。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架

Decellularized porcine skin matrix for tissue-engineered meniscus scaffold

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