2.2.1  旷场实验结果  图1显示，慢性脑低灌注组大鼠   5 min内移动距离较假手术组降低(P < 0.05)，说明慢性脑低灌注状态下大鼠自主探索行为明显受损；辛伐他汀组较溶剂组移动距离增加(P < 0.05)，说明辛伐他汀可改善慢性脑低灌注大鼠的自主探索行为。从4组大鼠移动路径图亦可看出，慢性脑低灌注组和溶剂组移动情况不如假手术组和辛伐他汀组频繁(图2)。

2.2.1  旷场实验结果  图1显示，慢性脑低灌注组大鼠   5 min内移动距离较假手术组降低(P < 0.05)，说明慢性脑低灌注状态下大鼠自主探索行为明显受损；辛伐他汀组较溶剂组移动距离增加(P < 0.05)，说明辛伐他汀可改善慢性脑低灌注大鼠的自主探索行为。从4组大鼠移动路径图亦可看出，慢性脑低灌注组和溶剂组移动情况不如假手术组和辛伐他汀组频繁(图2)。

2.2.2  定位航行实验结果  图3显示：慢性脑低灌注组大鼠较假手术组逃避潜伏期时间明显延长(P < 0.05，P < 0.01)，同时辛伐他汀组较溶剂组逃避潜伏期降低(P < 0.05，P < 0.01)。可见，慢性脑低灌注3个月后大鼠参考记忆明显受损，给予辛伐他汀干预后可有效改善慢性脑低灌注大鼠的参考记忆受损情况。

2.2.3  空间探索实验结果  获得性训练结束后，空间探索实验提示：慢性脑低灌注组、溶剂组较假手术组、辛伐他汀组大鼠穿越平台次数及目标象限时间均减少(图4)，说明慢性脑低灌注大鼠空间探索能力明显受损，而辛伐他汀可有效改善慢性脑低灌注大鼠的空间探索能力。

2.3  Western Blot检测结果  3个月时取材，测定各组大鼠海马区CA1区突触素、PSD95蛋白含量。图5 A是突触素的蛋白电泳图及Western Blot的统计分析图，GAPDH为内参，从图中可以看出慢性脑低灌注组较假手术组、溶剂组较辛伐他汀组突触素表达量下降。图5B是PSD95的蛋白电泳图及Western Blot的统计分析图，GAPDH为内参，从图中可以看出慢性脑低灌注组较假手术组、溶剂组较辛伐他汀组PSD95表达量下降。因此，慢性脑低灌注3个月后大鼠存在突触丢失及突触可塑性受损的现象，而辛伐他汀可恢复慢性脑低灌注大鼠突触素、PSD95的表达使其改善。

1990至2017年中国居民全因死亡调查发现，脑卒中已成为中国居民近30年来的首位死因^[1]。脑卒中不仅具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点，卒中后认知功能障碍还严重影响患者生存质量，并带来了巨大的医疗负担。卒中后认知障碍的发病机制复杂，其中慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)被认为是血管性认知障碍和阿尔茨海默病所致认知受损共同的病因之一^[2-3]，且缺乏有效的干预手段。

血管性认知障碍和痴呆是由于脑血管因素如脑血管纤维化、内皮细胞功能紊乱、小血管病等导致的进行性认知功能下降^[4]，这些损伤会逐渐造成脑低灌注状态，由此引发脑缺血缺氧及营养供应不足。高胆固醇血症是血管性认知障碍和痴呆发生的重要危险因素之一^[5]，胆固醇升高会诱发脑微血管发生氧化应激和炎症反应，其中炎症反应是脑白质损伤和神经元丢失的重要病理环节^[6]。另外，脂肪氧化可改变神经元细胞膜的通透性，影响细胞功能、破坏膜受体和酶的作用，从而造成认知功能受损。

      辛伐他汀(Simvastain，SV)是羟甲基戊二酰辅酶A (HMG-COA)还原酶抑制剂，可抑制内源性胆固醇的合成，广泛用于高脂血症的治疗和心脑血管疾病二级预防。与阿托伐他汀不同，辛伐他汀具有高度亲脂性，更易穿越血脑屏障，发挥抗炎、抗血栓形成、改善血管的内皮功能、减少细胞凋亡的作用^[7]。另外，辛伐他汀通常表现出更高的耐受性，临床上更加安全^[8]。辛伐他汀既可以降低总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，同时也可以升高高密度脂蛋白胆固醇，因此低密度脂蛋白/高密度脂蛋白和总胆固醇/高密度脂蛋白的比例也随之降低。每降低1 mmol/L低密度脂蛋白胆固醇可降低21.1%的卒中发生风险比^[9]。辛伐他汀除通过减少卒中来降低卒中认知障碍和痴呆的发生率外，是否具有直接改善卒中后认知功能障碍和痴呆的作用目前研究甚少，他汀类对认知功能的作用亦无定论^[10]，缺乏评估认知、痴呆相关的他汀类药物试验和治疗血管性痴呆的多中心随机对照试验。因此，该文拟从辛伐他汀对慢性脑低灌注模型大鼠的认知功能的影响，探讨其对血管性认知障碍和痴呆的临床价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2 时间及地点  2018年10月至2019年7月于西部战区总医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1  主要试剂及抗体  戊巴比妥钠(中国上海信裕生物科技有限公司)；通用型组织固定液(Servicebio)，货号：G1101；全蛋白提取试剂盒(KeyGEN Bio TECH)，货号：KGP250/KGP2100；BCA蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝)，货号：PC0020；辛伐他汀(大连美仑生物技术有限公司)，货号：MB1222；羧甲基纤维素钠(索莱宝)，货号：C8621；兔抗突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)抗体(Abcam)，货号：ab18258；鼠抗Synaptophysin抗体(Sigma)，货号：S5768；GADPH抗体(Proteintech)，货号：60004-1-Ig；山羊抗兔二抗(Proteintech)，货号：SA00001-2；山羊抗鼠二抗(Proteintech)，货号：SA00001-1。

1.3.2  实验动物  SPF级SD雄性大鼠48只，体质量(250±20) g，7周龄，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK(川)2015-030。实验遵守实验动物管理及保护的有关规定，并且获得西部战区总医院动物实验伦理委员会批准。

1.4  实验方法

1.4.1  实验分组  将48只SD雄性大鼠按随机数字表法分为慢性脑低灌注组(n=12)、假手术组(n=12)、溶剂组(n=12)、辛伐他汀组(n=12)，其中，假手术组为慢性脑低灌注组的对照组，观察慢性脑低灌注对大鼠认知水平的影响；溶剂组为辛伐他汀组的对照组，排除溶剂0.5%羧甲基纤维素钠对实验的干扰。

1.4.2  建立动物模型  大鼠于通风良好、12 h/12 h明暗交替的环境中适应性饲养1周，后参考相关文献及前期研究建立慢性脑低灌注模型和对照模型^[11-12]。手术前禁食12 h，禁饮4 h。称质量后按40 mg/kg的剂量注射1.5%戊巴比妥钠，将大鼠头部居中、四肢外展固定于手术台，颈部正中备皮、消毒、铺巾。用组织剪沿颈前正中线开口，暴露左侧胸锁乳突肌，分离并结扎左侧颈总动脉。术后注射适量青霉素预防感染。1周后，同法结扎右侧颈总动脉。假手术组除不结扎颈总动脉外，其余步骤与手术组相同。

1.4.3  给药方式及剂量  用纯水配制0.5%羧甲基纤维素钠，再将辛伐他汀按10 mg/1 mL 羧甲基纤维素钠配制混悬液，以利吸收，用超声搅拌混匀，现配现用。造模完成后首日夜间，辛伐他汀组每天按大鼠每100 g体质量给予辛伐他汀混悬液0.2 mL(含辛伐他汀2 mg)，溶剂组每天按大鼠每100 g体质量给予0.5%羧甲基纤维素钠0.2 mL开始灌胃，慢性脑低灌注组和假手术组不作处理。

1.4.4  取材方式  造模后12周进行取材，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠深度麻醉大鼠(80 mg/kg)，常规消毒，打开胸腔，充分暴露心脏。于右心室灌注预冷生理盐水250 mL，待肝肾变白后，迅速分离海马置于液氮，后转入-80 ℃冰箱保存，用于免疫蛋白印迹检测。

1.5  主要观察指标  造模后12周进行行为学实验(旷场实验及Morris水迷宫)检测各组大鼠学习记忆情况；之后取材行Western Blot检测突触前膜及后膜关键蛋白突触素(synaptophysin，SYN)、PSD95的蛋白表达。

1.5.1  旷场实验  安静条件下，将大鼠放入实验箱相同角落，同时启动摄像机，观察5 min后停止录像。取出大鼠后，用体积分数75%乙醇清洗实验箱底部和侧壁，更换大鼠，继续观察。记录各组大鼠的移动总路程，并分析其自主探索行为差异。

1.5.2  Morris水迷宫  水迷宫水池高1 m，直径1.2 m，黑色逃生平台(直径10 cm)位于水下2 cm。摄像机位于水池正上方2 m，水池等分为西南(SW)、东南(SE)、西北(NW)、东北(NE)4个象限，水池侧壁有颜色、形状各异的图案作为标识。

定位航行实验：平台位于西南方向，每只大鼠每天训练4次，每次间隔15 min，随机选择入水方向，连续5 d。记录大鼠找到平台的时间，若超过60 s，则引导大鼠至平台并停留10 s。

空间探索实验：撤除逃生平台，沿东北方向放入大鼠，记录大鼠穿越平台次数、目标象限所处时间。

1.5.3  Western Blot检测  将各组大鼠海马组织从-80 ℃冰箱中取出，按凯基全蛋白提取试剂盒说明书提取全蛋白，后采用二喹啉甲酸(BCA，索莱宝)试剂盒检测蛋白浓度。添加5×上样缓冲液后煮沸变性。各孔添加蛋白样品15 μg，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，先恒压80 V，40 min，再恒压120 V，60 min，当目标蛋白GADPH、PSD95和Synaptophysin位于玻片板中央时停止电泳。PVDF膜转膜GADPH(300 mA，35 min)、PSD95(300 mA，2 h)、Synaptophysin(300 mA，40 min)。5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，添加GADPH一抗(1∶5 000)、PSD95一抗      (1∶1 000)、Synaptophysin一抗(1∶1 000)。在室温条件下，水平摇床孵育1 h，后转入4 ℃冰箱过夜。次日，将孵育好的一抗置于水平摇床复温1 h。将PVDF膜用加Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBST)漂洗20 min×3次后，GADPH PVDF膜、Synaptophysin PVDF膜均添加山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)、PSD95 PVDF膜添加山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。用TBST漂洗20 min×3次，滴加显影液，UVP凝胶成像系统显影并采集图像数据。

1.6  统计学分析  采用SPSS 21.0统计软件进行分析，实验数据以x(_)±s表示。根据正态性检验结果选择合适的统计方法。除Morris水迷宫定位航行实验和工作记忆测试采用重复测量的单因素方差分析外，其余计量资料两组间比较采用独立样本t 检验，检验水准为α=0.05。

      慢性脑低灌注可导致神经元变性和认知受损^[13-14]。高胆固醇血症、高血压、糖尿病、慢性炎症、胃肠道感染等是血管性认知障碍和痴呆发生的重要危险因素。血管性认知障碍和痴呆发病机制复杂，其中内皮细胞功能紊乱可影响血管收缩和脑血流动力学，神经血管偶联被破坏，导致暂时或长期的脑低灌注状态。脑低灌注与痴呆密切相关^[15]，合并脑低灌注状态的轻度认知功能障碍患者进展为痴呆的概率将显著增加。

前期研究发现，慢性脑低灌注导致认知受损与α-突触核蛋白增加^[16]、线粒体老化^[12]、沉默突触增加等有关^[17]。突触素是位于突触前膜囊泡内的钙结合膜蛋白，与神经修复、突触形成、突触可塑性密切相关^[18]；PSD95是突触后膜的标志性蛋白，作为一种神经细胞骨架蛋白在突触功能活性和突触信息传导中起着重要作用^[19]；二者是与学习记忆、认知功能相关的经典蛋白。此次研究发现，慢性脑低灌注持续3个月大鼠学习记忆明显受损，空间探索能力下降。同时，大鼠海马CA1区突触素、PSD95蛋白水平下降，表明慢性脑低灌注持续3个月存在显著突触丢失。

慢性脑低灌注可引起多种神经病理学改变^[20]，如神经元丢失、胶质细胞激活、脑白质损伤、血脑屏障破坏等。虽然有关改善慢性脑低灌注预后的研究有很多，但有实际应用价值的却很少。此次研究中辛伐他汀组大鼠行为学检测较溶剂组结果改善，表明辛伐他汀连续应用3个月可对抗慢性脑低灌注所致认知受损，但其具体作用机制尚不清除。

      目前，辛伐他汀对于认知功能的作用尚存在争议^[10，21]。一方面，他汀类可能因过度抑制胆固醇合成^[22]，从而破坏了神经元细胞膜的完整性，导致患者记忆功能发生损害；另一方面，血清高胆固醇可增加痴呆发生的风险，他汀降低血清胆固醇水平，因而可能具有预防痴呆发生的功效^[23]。另外，他汀类可降低类异戊二烯发挥抗炎作用，该物质是炎症信号通路的关键调节分子，肿瘤坏死因子α和白细胞介素6等促炎因子的水平也因此降低^[24]。辛伐他汀可以改善脑血管的反应性，包括内皮细胞TRPV4、平滑肌KATP通道的开放、恢复NO生物利用度、改善血管炎症反应所引起的内皮细胞功能紊乱^[25]。一项RCT研究已经证实他汀类药物对于罹患血管性疾病的终末期患者并不具有防止认知功能下降和痴呆发生的作用^[26]，但其在血管性疾病早期干预的效果还不得而知。另一项研究发现，对于没有认知功能障碍病史的患者，他汀类短期应用与安慰剂对照无明显差别，但长期应用可降低29%的痴呆发生风险^[27]。这与此次研究连续应用辛伐他汀3个月的效果类似，说明辛伐他汀长期应用具有预防痴呆、改善认知的作用。

慢性脑低灌注可诱发脑白质损伤，炎症因子基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)水平升高^[28]。抑制基质金属蛋白酶可保护脑低灌注所致脑白质损伤、减少胶质细胞的广泛激活。不过，基质金属蛋白酶不仅可导致脑损伤，又可参与其修复，因此基质金属蛋白酶抑制剂的应用存在争议，选择合适的基质金属蛋白酶抑制剂成为了改善慢性脑低灌注预后的重要突破口之一。辛伐他汀可直接抑制基质金属蛋白酶9表达，上调内皮细胞一氧化氮合酶表达^[29]，从而抑制微血管炎症。另外，辛伐他汀还可改善内皮细胞介导的血管舒张功能，在脑白质发挥选择性抗炎效应^[6]，促进认知恢复。除上述作用外，此次实验发现辛伐他汀组较溶剂组突触素及PSD95蛋白表达水平明显上升，表明辛伐他汀可通过降低慢性脑低灌注所致突触丢失改善大鼠学习记忆能力。突触丢失是认知功能下降的重要病理环节^[30]，且发生于认知功能受损早期，因而辛伐他汀早期使用或可降低血管性认知障碍和痴呆的发生率。辛伐他汀由于其独立于降脂的多效性，可减少痴呆发生风险^[31]，但辛伐他汀对突触的影响还不清楚，相关机制尚待完善。辛伐他汀在血管性认知障碍和痴呆患者中的适用标准和剂量亦需相关临床试验进一步补充说明。

此次实验揭示了辛伐他汀对慢性脑低灌注大鼠的神经保护功能，但缺乏特异性作用靶点和突触变化的直观对比。慢性脑低灌注是慢性持续过程，实验缺乏纵向时间轴评价，以动态观察辛伐他汀对认知的作用。慢性脑低灌注大鼠未能完全模拟血管性认知障碍和痴呆患者的发病机制，辛伐他汀在真实世界中的应用价值需进一步验证。

      综上所述，慢性脑低灌注状态是痴呆进展的重要阶段及预警指标，慢性脑低灌注3个月后大鼠存在明显的学习记忆受损，而持续口服辛伐他汀可降低突触丢失发生率，改善大鼠的认知功能。该结果提示，传统降脂药辛伐他汀在临床上的长期应用或许可使慢性脑低灌注所致认知障碍患者获益。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

辛伐他汀：是临床常用的降脂药，可以穿过血脑屏障，起到改善脑缺血所致氧化应激和炎症反应的作用。基质金属蛋白酶9是认知功能受损的关键蛋白，辛伐他汀可增加海马区基质金属蛋白酶9的表达，从而改善血管性认知障碍和痴呆患者的学习记忆功能。

慢性脑低灌注：血管危险因素与神经退行性病变和痴呆的发生密切相关，慢性脑低灌注是痴呆的早期阶段特点，同时也是认知功能下降的预警指标。慢性脑低灌注的发生导致多种神经病理学改变，如神经炎性反应、少突胶质细胞丢失、脑白质损伤等。改善慢性脑低灌注阶段的缺血缺氧性损伤对学习记忆功能的维持和痴呆预防的意义重大。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

突触素(synaptophysin，SYN)是位于突触前膜囊泡内的钙结合膜蛋白，与神经修复、突触形成、突触可塑性密切相关。突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)是突触后膜的标志性蛋白，作为一种神经细胞骨架蛋白在突触功能活性和突触信息传导中起着重要作用。二者是与学习记忆、认知功能相关的经典蛋白。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#