移植不同剂量脐带间充质干细胞提高老年痴呆大鼠学习记忆能力的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
海马体：又名海马回、海马区、大脑海马，海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中，如果一个记忆片段，比如一个电话号码或者一个人在短时间内被重复提及的话海马体就会将其转存入大脑皮质，成为永久记忆。
老年性痴呆模型建立方法：①与中枢胆碱能神经系统有关的痴呆动物模型：兴奋性毒素损伤Meynert基底核(NBM)所致的痴呆动物模型、选择性损伤基底前脑胆碱能神经元的痴呆动物模型、电解损伤基底核的痴呆动物模型；②与β-淀粉样蛋白有关的痴呆动物模型：β-淀粉样蛋白灌注模型、β-淀粉样蛋白的神经毒性作用、转基因动物模型；③铝过量造成的阿尔茨海默病动物模型；④自然衰老的动物模型；⑤实验性自动免疫痴呆模型。

摘要
背景：移植有活力、分化能力强的干细胞修复神经组织来延缓老年痴呆症的发病进程是研究人员的重要目标。
目的：探讨不同剂量脐带间充质干细胞移植对老年痴呆大鼠学习记忆能力的影响。
方法：选取50只7月龄SD大鼠随机分为正常组、模型组以及高、中、低剂量脐带间充质干细胞移植组，每组10只。模型组和移植组腹腔注射D-半乳糖150 mg/kg建立老年痴呆模型，正常组腹腔注射生理盐水，连续90 d。收集第3代脐带间充质干细胞，以低、中、高3个剂量( 1×10⁵/0.2 mL/20 g、5×10⁵/ 0.2 mL/20 g、1×10⁶/0.2 mL/20 g)通过尾静脉进行移植，移植45 d后，Morris水迷宫实验检测其学习记忆能力，苏木精-伊红染色观察大鼠脑海马CA1区的病理变化。
结果与结论：①与正常组比较，模型组大鼠学习记忆能力明显降低；与模型组比较，细胞移植中剂量组水迷宫逃避潜伏期显著缩短(P < 0.05)，穿越平台次数显著增加(P < 0.05)；②模型组脑海马CA1区细胞排列紊乱，核仁不清，部分细胞浓缩深染；移植中剂量组细胞排列整齐，核仁明显，染色质分布均匀，个别细胞深染；③结果表明，中剂量的脐带间充质干细胞移植能增强老年痴呆大鼠的学习记忆能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6036-5149(周德生)

关键词: 干细胞, 移植, 脐带间充质干细胞, 老年痴呆, 学习记忆能力

Abstract:

BACKGROUND: To delay the onset of Alzheimer’s disease, transplantation of viable and well-differentiated stem cells is expected to repair neural tissue, which has been an issue of concern.
OBJECTIVE: To explore the effects of different doses of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs) on learning and memory ability of Alzheimer’s disease rats.
METHODS: Fifty Sprague-Dawley rats, 7 months of age, were randomized into normal, model, high-, middle- and low-dose hUCMSCs groups (n=10 per group). Rats in model and UCMSCs groups were used to make Alzheimer’s disease animals through intraperitoneal injection of 150 mg/kg D-galactose for 90 days, and rats in the normal group were given intraperitoneal injection of normal saline for 90 days. In the three hUCMSCs group, passage 3 hUCMSCs at doses of 1×10⁵/0.2 mL/20 g, 5×10⁵/0.2 mL/20 g, and 1×10⁶/0.2 mL/20 g were injected via the tail vein, respectively. Forty-five days after cell transplantation, Morris water maze test was used to detect rat’s learning and memory abilities, and hematoxylin-eosin staining was used to observe pathological changes of the rat hippocampal CA1 region.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, the rats in the model group showed significant reduction in the ability of learning and memory. Compared with the model group, the escape latency was significantly shortened in the middle-dose hUCMSCs group (P < 0.05), while the number of passing times through the platform was increased significantly (P < 0.05). In the model group, the cells in the hippocampal CA1 region were arranged irregularly with unclear nucleoli and a part of cells were concentrated and deeply stained. In the middle-dose hUCMSCs group, the cells in the hippocampal CA1 region were arranged regularly with clear nucleoli, and only individual cells were stained deeply. These findings indicate that middle-dose hUCMSCs transplantation can improve the learning and memory abilities of Alzheimer’s rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Alzheimer Disease, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

周俊，周德生. 移植不同剂量脐带间充质干细胞提高老年痴呆大鼠学习记忆能力的比较[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(50): 7524-7529.

Zhou Jun, Zhou De-sheng . Different doses of human umbilical cord mesenchymal stem cells improve learning and memory ability of dementia rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(50): 7524-7529.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2015年3至12月在湖南中医药大学第一附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康老年SD大鼠50只，7月龄，SPF级，体质量250-550 g，购于中国医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK(京)2012-0005，饲养于湖南省实验动物中心，温度为(25±2) ℃，湿度为(50±5)%，昼夜比例为1∶1。实验过程中对动物处置符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.3.2 脐带来源 脐带标本取自健康足月剖宫产的新生儿，由湖南中医药大学第一附属医院产科协助完成，均已征得产妇及家属授权同意和医院伦理委员会批准。

1.3.3 主要试剂 胎牛血清、Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶、青霉素、链霉素、谷氨酰胺(美国GIBCO公司)；DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；二甲基亚砜(Sigma公司)；小鼠单克隆抗大鼠CD29、小鼠单克隆抗大鼠CD44(美国Abcam公司)。

1.3.4 主要仪器 MCV-16BSU超净工作台(德国Sanyo公司)；CytoFLEX流式细胞仪(BD公司)；Milli-Q labconco纯水机(美国Millipore公司)；倒置显微镜(Leica公司)；CO₂恒温培养箱(Forma 3110，Thermo)；培养板(美国 Corning公司)；低温高速离心机(美国Sigma公司)；电热恒温水浴槽(森信DK-8D，中国)；MORRIS水迷宫(DMS-2型，动物研究所)；YLS-3TB跳台记录仪(济南益延科技发展有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离培养 将脐带剪成均匀小段，每段2 cm，用生理盐水多次冲洗洗去残留的血块，用Hank’s缓冲液洗3次，眼科剪剪碎，加入2倍体积的0.15% Ⅰ型胶原酶，37 ℃、振荡消化40 min；待充分消化后，加入等体积的体积分数为15%血清的 DMEM培养基，1 000 r/min离心6 min，倒去上清液，再用含体积分数为15%血清的DMEM培养基重悬细胞，200目钢筛过滤，以合适密度接种于25 cm²培养瓶中，放入37℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，当细胞生长达80%-90%融合时进行传代培养。

1.4.2 人脐带间充质干细胞的免疫表型检测 取第3代对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后，1 000 r/min离心6 min，弃上清，用PBS重悬，按照每管2×10⁶个细胞吸至离心管，再次1 000 r/min离心6 min，弃上清，加入300 μL PBS重悬，分别加入APC标记的小鼠单克隆抗大鼠一抗CD44，PE标记的小鼠单克隆抗大鼠一抗CD29，混匀，室温下避光孵育20 min，加入缓冲液，1 000 r/min离心6 min，弃上清后再次加入PBS重悬，离心，弃上清，上流式细胞仪检测。

1.4.3 腹腔注射D-半乳糖建立老年痴呆动物模型 选取50只SD雌性大鼠随机分为正常组、模型组以及低、中、高剂量人脐带间充质干细胞移植组，每组10只。模型组、人脐带间充质干细胞移植组腹腔注射D-半乳糖150 mg/kg，1次/d，连续90 d，制备老年痴呆动物模型。正常组注射等量生理盐水。

1.4.4 人脐带间充质干细胞移植 老年痴呆动物模型建立后，将第3代人脐带间充质干细胞接种于75 cm²培养瓶，待细胞长至70%融合，胰蛋白酶-EDTA消化，调整细胞所需浓度，以高、中、低(1×10⁶/0.2 mL/20 g、5×10⁵/0.2 mL/20 g、1× 10⁵/0.2 mL/20 g)3个剂量通过尾静脉进行移植^[11]。

1.4.5 Morris 水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力 细胞移植45 d后进行水迷宫实验。①适应训练：首先练习站台，放于平台上2 min，然后开始入水训练，每只大鼠训练2次，从不同象限入水，每次2 min，如果找不到站台，应引导至站台，停留2 min；②定位航行实验：时间共历时4 d，将平台置于第4象限中心，于每天上午固定时间段进行3次测试，每次测试时间1 min，象限池壁的中点作为入水点，但放置平台的第4象限不作为入水点，3次测试的入水顺序相同，但每个入水点不重复。如果大鼠在90 s内未找到平台，则由实验者将其引至平台，让其在平台上停留90 s，再放回笼内。以大鼠入水后到找到平台的游泳时间(即逃避潜伏期)做为观测指标，90 s内未找到平台的记为90 s；③空间探索实验：于定位航行实验结束后第2天上午撤除平台，然后将大鼠从相同的象限轻轻放入水中，记录大鼠在90 s内的平均游泳速度、在第4象限停留的时间和路程、穿越平台位置次数。

1.4.6 苏木精-伊红染色观察海马组织CA1区细胞形态 水迷宫实验结束后，每组随机选取6只大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉，断头处死，取海马组织CA1区，用体积分数10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚5 μm，行苏木精-伊红染色。具体步骤如下：①二甲苯脱蜡10 min；②无水乙醇洗去二甲苯5 min；③体积分数95%，80%，70%乙醇各2 min，自来水洗2 min；④苏木精染色2 min，自来水洗2 min；⑤体积分数为1%盐酸乙醇分化1 min，自来水洗2 min；⑥氨水(1%)返蓝45 s，自来水或蒸馏水洗2 min；⑦伊红染色3 min，自来水洗1 min；⑧体积分数为70%乙醇脱水1 min，体积分数为80%乙醇1 min；⑨体积分数为95%乙醇1 min；⑩无水乙醇1 min；?二甲苯2 min；?中性树胶封固；?光学显微镜下拍照，每只大鼠随机拍海马区3个视野，进行形态学观察。

1.5 主要观察指标 ①Morris水迷宫实验检测各组大鼠在90 s内的平均游泳速度、在第4象限停留的时间和路程、穿越平台位置次数；②苏木精-伊红染色观察各组大鼠海马组织CA1区细胞形态。

1.6 统计学分析 所有数据用SPSS 18.0软件进行分析，采用单因素方差分析One-Way ANOVA或t 检验，各组数据用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

老年痴呆症已经成为威胁人类健康的重大问题，随着人口的老龄化，老年痴呆症已经成为重要的公共卫生问题^[14-17]。至2004年，中国老年痴呆症患者有506万，预计到2020年中国老年痴呆症的人数将是所有发达国家的总数^[18-20]。老年痴呆症已经严重降低了生活质量，给政府、社会和患者带来巨大的经济负担。

历代医家对痴呆病因病机的认识研究较多，杨柏灿等^[21]认为痴呆的发病主要是与脏腑功能失调和气血阴精不足有着密切的关系，其中心肾不足、气虚血亏、阴损精衰是发病的核心，与肝脾两脏也有一定的关系，而痰瘀火邪的作用则是痴呆发病的重要因素。马宜明等^[22]则指出老年性痴呆症的本虚主要在于以肾精不足为主的五脏虚衰，肾虚是痴呆的主要病机和关键。杨文明等^[23]认为脾肾亏虚是痴呆的发病基础，其发病的关键病机是痰癖交结阻滞脑络，痰癖既是病理产物，又是致病因素。陆明霞等^[24]认为痴呆虽是神经衰弱基础上的心神困扰之病，与痰癖阻窍有关，但更强调它是涉及五脏的全身性疾病。

建立在行为与组织病理学方面较近似的痴呆动物模型是痴呆研究的热点之一^[25-28]。有文献研究发现通过大鼠皮下或者腹腔注射D-半乳糖可造成亚急性衰老，注射亚硝酸则可造成全身多脏器的缺血缺氧，并导致学习记忆能力下降^[29-30]。

脐带间充质干细胞移植分化成神经干细胞，继续分化成为神经元，补充了老年痴呆大鼠基底前脑中神经元的损失，阻碍了老年痴呆症的病程发展。李莹等^[31]研究发现采用 BrdU标记的人脐血干细胞定向移植入血管性痴呆大鼠模型，大鼠脑内生长相关蛋白阳性细胞显著增加，证实人脐血干细胞可以在大鼠脑内生长、发育和再生，并有可能刺激移植周围区域内源性神经干细胞分化或突触再生。Liao 等^[32]研究发现脐带间充质干细胞移植到大鼠脑梗死模型中可能通过血管新生来促进大鼠神经功能的恢复。脐带间充质干细胞能表达神经营养因子、血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子等，可促进受损神经再生，而血管内皮生长因子和神经营养因子等可直接对神经元发挥神经营养或神经保护作用^[33]。研究发现脐带间充质干细胞移植入脑出血大鼠模型脑组织内可抑制炎症反应、促进血管再生、促进神经功能恢复^[34]。

实验通过尾静脉向7月龄老年痴呆大鼠移植高、中、低3个剂量组的脐带间充质干细胞，利用Morris水迷宫实验来检测其学习记忆能力，结果发现，与模型组相比较，尾静脉细胞移植中剂量组差异有显著性意义，所以认为中剂量的脐带间充质干细胞移植对老年痴呆大鼠的学习记忆能力有改善作用。细胞移植高剂量组大鼠的逃避潜伏期、不同象限的停留时间等指标都不如移植中剂量效果好，推测可能是由于细胞浓度过高，且通过尾静脉注射直接移植到动物体内，可能造成部分脉管栓塞，导致大鼠状态不佳，其具体原因仍需要后续实验继续探究其原因。