辛伐他汀缓释微球影响骨组织工程成骨性能的体外实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1511

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (2): 239-244.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1511

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辛伐他汀缓释微球影响骨组织工程成骨性能的体外实验

青薇¹，代彦君²，黄丽娟¹，任静¹，郑佳俊¹，庹嫱²，任小华²，牟雁东^1，2

¹西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000； ²电子科技大学医学院，四川省成都市 610000

收稿日期:2018-10-15 出版日期:2019-01-18 发布日期:2019-01-18
通讯作者: 牟雁东，博士，主任医师，西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；电子科技大学医学院，四川省成都市 610000
作者简介:青薇，女，1993年生，四川省成都市人，汉族，西南医科大学在读硕士，医师，主要从事口腔种植修复研究。
基金资助:
四川省科技厅项目(2016TD0008，项目负责人：牟雁东)

Simvastatin sustained-release microspheres promote osteogenesis of bone tissue engineering in vitro

Qing Wei¹, Dai Yanjun², Huang Lijuan¹, Ren Jing¹, Zheng Jiajun¹, Tuo Qiang², Ren Xiaohua², Mu Yandong^{1, 2}

¹School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²School of Medicine, University of Electronic Science and Technology, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Received:2018-10-15 Online:2019-01-18 Published:2019-01-18
Contact: Mu Yandong, MD, Chief physician, School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; School of Medicine, University of Electronic Science and Technology, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
About author:Qing Wei, Master candidate, Physician, School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Project of Sichuan Science and Technology Department, No. 2016TD0008 (to MYD)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

羟基磷灰石：是目前最为理想的生物活性材料，为一类无机合成材料，具有生物相容性、骨传导性和骨诱导性，植入人体后对组织无刺激和排斥作用，能与骨形成很强的化学结合，用作骨缺损的充填材料，能为新骨的形成提供支架，发挥骨传导作用，是理想的硬组织替代材料。

转录组：是细胞或组织内全部的RNA转录本，可以从整体水平上反映细胞中所有基因的表达情况及其调控规律，通过高通量测序对其进行分析，并与基因组进行比对发现差异表达的基因。

辛伐他汀：呈白色粉末，几乎不溶于水，属脂溶性药物，易溶于丙酮、乙腈和乙醇等，作为3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶 A还原酶抑制剂他汀类家族的成员，已被证明可增加生长因子的表达，尤其是血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2，它们是体外和体内水平的主要血管生成和成骨调节因子。

背景：近年来国内外研究将辛伐他汀缓释微球组装在支架材料上，发现其可完成骨缺损的修复，取得不错的效果。

目的：探讨辛伐他汀缓释微球对组织工程成骨性能的影响。

方法：采用薄膜分散法制作纳米脂质体辛伐他汀缓释微球，检测其粒径和多分散系数及包封率。采用透析装置检测游离辛伐他汀溶液与辛伐他汀缓释微球溶液的缓释性能。将第3代人胎盘间充质干细胞接种于多孔羟基磷灰石陶瓷支架上，待细胞贴壁生长后分2组培养，实验组加入辛伐他汀缓释微球溶液，空白组加入普通培养基，7，14，21 d后进行转录组测序，实时荧光定量 PCR验证成骨基因表达水平。

结果与结论：①辛伐他汀缓释微球平均粒径为(77.27±6.4) nm，多分散系数为0.131±0.040，包封率为85.6%；②游离辛伐他汀溶液在前3 d迅速释放超过了总药量的80%，辛伐他汀缓释微球溶液在前3 d的药物释放量仅约40%，此后也一直较缓慢持续释放至14 d，14 d累计释放量接近80%；③转录组测序显示，实验组骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4和血管内皮生长因子等成骨相关基因富集表达；④实时荧光定量PCR检测显示，实验组7，14，21 d的骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4、血管内皮生长因子基因表达均高于空白组(P < 0.05)；⑤结果表明，辛伐他汀缓释微球可促进组织工程成骨性能表达。

ORCID: 0000-0002-1627-5442(青薇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 羟基磷灰石, 辛伐他汀, 缓释微球, 脂质体, 间充质干细胞, 骨组织工程, 转录组测序, 成骨效能, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, domestic and foreign studies have assembled simvastatin sustained-release microspheres onto scaffold materials. It has been found that simvastatin can be used to repair bone defects and good results have been obtained.

OBJECTIVE: To investigate the effect of simvastatin sustained-release microspheres on tissue engineering osteogenesis.

METHODS: Nanoliposome simvastatin sustained-release microspheres were prepared by thin-film dispersion method. The particle size, polydispersity coefficient and encapsulation efficiency were measured. The sustained release properties of free simvastatin solution and simvastatin sustained-release microsphere solution were measured by dialysis device. The third generation of human placental mesenchymal stem cells was inoculated on porous hydroxyapatite ceramic scaffolds. The cells were cultured in two groups after adherent growth. The experimental group was treated with simvastatin sustained-release microspheres, and the normal medium was added to the blank group. Transcriptome sequencing was carried out after 7, 14, 21 days. The expression levels of osteogenic genes were verified by real-time fluorescence quantitative PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The average particle size of simvastatin sustained-release microspheres was (77.27±6.4) nm, the polydispersity coefficient was 0.131±0.040, and the encapsulation efficiency was 85.6%. (2) The rapid release of free simvastatin solution exceeded 80% total dose in the first 3 days. While the simvastatin sustained-release microsphere solution released only about 40% of the drug in the first 3 days, and had been slowly released until the 14^th day, and the cumulative release at the 14^th day was close to 80%. (3) Transcriptome sequencing showed that the osteogenesis-related genes such as bone morphogenetic protein 2, bone morphogenetic protein 4 and vascular endothelial growth factor were enriched and expressed in the experimental group. (4) Real-time quantitative PCR showed that the mRNA levels of bone morphogenetic protein 2, bone morphogenetic protein 4 and vascular endothelial growth factor were significantly higher in the experimental group than the blank group at 7, 14 and 21 days (P < 0.05). These results indicate that simvastatin sustained-release microspheres can promote osteogenic performance for tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Hydroxyapatites, Liposomes, Tissue Engineering

中图分类号:

R459.9

R318

青薇，代彦君，黄丽娟，任静，郑佳俊，庹嫱，任小华，牟雁东. 辛伐他汀缓释微球影响骨组织工程成骨性能的体外实验[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(2): 239-244.

Qing Wei, Dai Yanjun, Huang Lijuan, Ren Jing, Zheng Jiajun, Tuo Qiang, Ren Xiaohua, Mu Yandong. Simvastatin sustained-release microspheres promote osteogenesis of bone tissue engineering in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(2): 239-244.

图/表（结果） 7

2.1 多孔羟基磷灰石支架的表面形貌见图1。

2.2 辛伐他汀缓释微球的粒径与包封率辛伐他汀缓释微球的平均粒径为(77.27±6.4) nm，多分散系数PDI值为0.131±0.040，见图2；辛伐他汀缓释微球的包封率为85.6%。

2.3 辛伐他汀药物溶液的标准曲线见图3。

方程为y=4.640 7x+0.022 2，R²=0.996 8，二者相关性高，可用作后续测量计算。

2.4 辛伐他汀缓释微球溶液的释放曲线游离辛伐他汀溶液在前3 d的释放中迅速释放超过了总药量的80%，而辛伐他汀缓释微球在前3 d的药物释放量仅约40%，此后也一直较缓慢持续释放至14 d，14 d累计释放量接近80%，见图4。

2.5 辛伐他汀缓释微球影响骨组织工程成骨分化的转录组测序 P1代人胎盘间充质干细胞贴壁后生长，见图5A；二三天常规换液，待其达到培养皿底部面积80%，见图5B；传代培养，P3代细胞培养至21 d时位于对数生长期，细胞集簇状生长，螺旋状、漩涡状排列，呈典型的长梭形，类似成纤维细胞样形态，见图5C；细胞与支架共培养24 h拍摄扫描电镜图，可见有部分细胞伸出伪足黏附于支架表面，见图5D；7，14 d于光镜下观察可见细胞已从支架上爬行贴壁生长于培养皿上，见图5E，F。转录组测序热图，见图6，其中蓝色表示基因下调，红色表示基因上调。

通过实验组与空白组颜色对比差异显著的组别，确定富集量改变较大的基因，查阅相关文献确定其中骨形态发生蛋白4、骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子报道与成骨通道相关，其中骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白2在实验组第7天出现了较高的富集，而血管内皮生长因子在第21天出现了富集，为确定转录组结果的可重复性，故再次通过RT-qPCR进行实验验证。

2.6 RT-qPCR验证差异基因表达量实验组7，14，21 d的骨形态发生蛋白4、骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子基因表达均高于空白组(P < 0.05)，其中骨形态发生蛋白4及骨形态发生蛋白2在成骨早期高表达，血管内皮生长因子从14 d开始才出现高表达，见图7。

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引言

辛伐他汀作为3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶抑制剂他汀类家族的成员^[1-2]，Mundy等^[3]首次发现2.5 µmol/L辛伐他汀可通过合成代谢和抗分解代谢在体外实验中增强成骨作用。然而，有研究报道指出他汀类药物直接服用在体内对骨骼有负面影响，如横纹肌溶解^[4-5]，且水溶性差，故研究可局部释放辛伐他汀又能保持其生物学性能的缓释制剂将具有重要的理论意义和应用前景^[6]。粒径基本保持在10-1 000 nm的载药缓释微球，具有延长作用时间、减轻毒副作用等优点^[7-9]，在各种类型的纳米粒子中脂质体具有显著的优势。

骨替代材料为一类无机合成材料，具有生物相容性、骨传导性和骨诱导性^[10]，被广泛用于牙位点保存术、牙槽骨增量术和上颌窦底提升术等骨增量手术中。其中应用较广泛的是羟基磷灰石、磷酸钙和生物活性玻璃等单一成分的骨替代材料，羟基磷灰石因具有优良的骨诱导性，在骨科领域已备受关注。除此之外，羟基磷灰石还可吸附多种化学药物在其表面。新型多孔羟基磷灰石陶瓷支架在前期研究中已展示出优良的骨诱导性和载药性能^[11-13]。关于羟基磷灰石的表面处理，通过增加活性因子以提高成骨性能的研究在国内外均广泛地进行开展，故对原有材料改性迫在眉睫。

干细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化的特征^[14-15]。近年来研究发现，人胎盘中含有大量的间充质干细胞^[16]，其表面抗原和分化潜能与骨髓间充质干细胞相似^[17-18]。前期研究基于对此种细胞的分离纯化，探讨了胎盘间充质干细胞与羟基磷灰石陶瓷支架的体外生物相容性，证实其能在羟基磷灰石表面很好地黏附增殖，并且促进成骨基因的转录^[19]。此次研究拟将羟基磷灰石支架在体外与胎盘间充质干细胞共培养，探究辛伐他汀脂质体微球对骨组织工程成骨性能的影响，探索辛伐他汀在调控成骨中的信号分子，以期为后续支架材料表面改性提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2017年6月至2018年6月在四川大学生物治疗国家重点实验室完成。

1.3 材料辛伐他汀(美国默克公司)；人胎盘间充质干细胞(四川大学生物治疗国家重点实验室)；胎牛血清、DMEM培养基、0.25%胰酶(Gibco)；细胞培养瓶、细胞培养板(BD Falcon)；吐温80、大豆卵磷脂、胆固醇、氯仿(北京化工厂)；倒置相差显微镜(OLYMPUS)；光学显微镜、JSM-7500F扫描电镜(日本日立公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 生物陶瓷支架的制备由西南交通大学材料科学与工程学院采用具有自主知识产权的甲壳素高分子溶胶-凝胶体系及W/O乳化法制备出三维多孔羟基磷灰石陶瓷支架^[20]。支架材料规格：直径6 mm，高3 mm；孔隙率80%，孔径750-900 μm。

1.4.2 薄膜分散法制备载辛伐他汀缓释微球辛伐他汀缓释微球按如下步骤制备：①取大豆卵磷脂和胆固醇，按质量比3∶1共同溶解于1 mL氯仿中，形成均匀的分散液；②称取与大豆卵磷脂和胆固醇质量总和相等的辛伐他汀，放入另一离心管中，加入1 mL氯仿；③将①溶液和②溶液相互混合，旋转蒸发仪上转动1 h，转速500 r/min，条件为真空，温度为37 ℃；④与空气接通后，再加入Milli Q水，转速和水温保持不变，旋转1 h；⑤液体转移置BD管中，放于盛冰块的塑料容器中，使用超声细胞粉碎仪，条件为超声3 s、停顿5 s，超声3 min；⑥使用Malvern粒径仪测粒径和分散系数。

1.4.3 辛伐他汀缓释微球和游离辛伐他汀溶液释放的差异性评价配置标准浓度梯度的辛伐他汀溶液，绘制辛伐他汀溶液标准曲线方程式；分别制备2.5 µmol/L的游离辛伐他汀溶液和辛伐他汀缓释微球溶液各3 mL，用1 L含0.5%吐温80的PBS(pH=7.4)作为溶剂；选择规格为3 000相对分子质量的透析袋，加入1 mL辛伐他汀缓释微球或 1 mL纯辛伐他汀溶液，制作6个透析模型，设定取样为1- 14 d，每天测量，重复3次；用分光光度仪测得数据，计算对应浓度，并绘制释放曲线。

1.4.4 辛伐他汀缓释微球包封率的计算量取辛伐他汀缓释微球溶液0.25 mL上柱，用生理盐水洗脱；20 mL量瓶收集有乳光的部分，脂质体消解液加至刻度，直至澄清。吸1 mL置离心管中，3 000 r/min离心5 min，吸上清液 20 μL，注入液相色谱仪测定，计算包封率(包封率=脂质体包封药量/实际投药量)。

1.4.5 辛伐他汀缓释微球对骨组织工程成骨性能的影响

多孔羟基磷灰石陶瓷支架与人胎盘间充质干细胞共培养：培养原代人胎盘间充质干细胞，传代至P3代后，将P3代人胎盘间充质干细胞悬液(细胞浓度为2×10⁸ L^-1)接种至多孔羟基磷灰石支架表面，接种完毕之后向每个培养皿中加入15 mL的含体积分数10%胎牛血清的 DMEM培养基。于37 ℃恒温箱中培养，待干细胞于羟基磷灰石支架上贴壁生长(12 h以内)之后，向培养皿中添加浓度为2.5 µmol/L的辛伐他汀缓释微球，此时记为0 d，设为实验组，空白组加等体积普通培养基。每天在倒置相差显微镜下观察支架周围细胞的生长情况，每3 d换1次培养液。

成骨调控下转录组测序分析：共培养7，14，21 d后，用Trizol法提取细胞总RNA，将片段化的mRNA反转录合成双链cDNA，PCR扩增以富集所得到的cDNA文库，构建好的测序文库进行双末端(PE)测序。以人类基因组作为参考进一步通过DAVID软件中的GO和KEGG数据库对差异基因进行功能富集分析。

RT-qPCR验证差异基因表达量的反应体系与程序：SYBR Premix ExTaq 10 μL，正向引物0.8 μL，反向引物0.8 μL，cDNA 2.0 μL，双蒸水6.4 μL，总体积20 μL，反应程序：95 ℃ 3 min，1个循环；95 ℃ 10 s，58 ℃(退火温度)30 s，40个循环；65-95 ℃熔解曲线。引物设计与合成：在NCBI基因库中查找人GAPDH(内参基因)、骨形态发生蛋白4、骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子的基因序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，由Invitrogen公司合成。合成目的基因的PCR引物序列，见表1。

1.5 主要观察指标 ①多孔羟基磷灰石支架的表面结构图像；②辛伐他汀缓释微球粒径、多分散系数、包封率及释放曲线；③人胎盘间充质干细胞在多孔羟基磷灰石支架表面的黏附情况；④多孔羟基磷灰石支架表面人胎盘间充质干细胞骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4、血管内皮生长因子mRNA的表达。

1.6 统计学分析目标基因使用??Ct法分析，每个样本设 3组生物学重复，使用SPSS 24.0统计软件进行独立样本t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨组织工程的应用为口腔种植骨量不足带来了新的思路和方法，支架材料作为其中的核心部分，一直为国内外改性研究的热点。辛伐他汀因其显著的成骨效能吸引了大量学者的深入研究^[21-22]，发现不同干预方式得出的成骨效果差异显著。近年来国内外报道将辛伐他汀制成缓释微球，再组装在支架材料上，完成骨缺损的修复，皆取得了不错的效果^[23-24]。脂质体是由类脂形成的双分子层的闭合囊泡，具有亲水性和亲脂性，可包裹水溶性和脂溶性药物。包裹药物形成的可生物降解纳米颗粒，常可改善这些化合物的生物利用度、溶解度及治疗效果。纳米颗粒可通过胞吞作用进入细胞，在体外增强骨髓间充质干细胞的成骨分化。当纳米颗粒粒径小于100 nm甚至更小的时候，容易被细胞摄取。在此次实验中，通过薄膜分散法包裹辛伐他汀的纳米脂质体粒径大小符合均值小于100 nm的优质纳米缓释微球粒径标准，多分散系数 PDI值也说明微球直径十分均匀，且其药物包封率达到85.6%。

2.5 µmol/L辛伐他汀被证明是一个对成骨分化具有重要参考标准的浓度。Liu等^[25]实验发现，当加药浓度为0.025-2.5 µmol/L时，辛伐他汀的促成骨作用较明显。此次实验亦选择在此浓度下进行组装，形成的纳米缓释微球加载于支架后，在1-14 d每日连续测量其释放曲线，结果表明辛伐他汀缓释微球在前3 d的药物释放量仅约40%，后缓慢持续释放至14 d，累计释放量达80%。辛伐他汀脂质体纳米微球可在生理条件下提高药物在水解方面的稳定性，故而可在支架植入体内早期促进前成骨细胞聚集，进而加速成骨分化。

转录组是细胞或组织内全部的RNA转录本，可从整体水平上反映细胞中所有基因的表达情况及其调控规律，通过高通量测序对其进行分析，并与基因组进行比对发现差异表达的基因^[26]。此次测序结果显示，成骨基因如骨形态发生蛋白4、骨形态发生蛋白6、骨形态发生蛋白2、RUNX2及血管内皮生长因子确实在实验组富集，血管内皮生长因子在21 d的表达出现了明显上调，而骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白4在成骨早期出现高表达，表明辛伐他汀在早期通过促进骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白4上调，加速人胎盘间充质干细胞向成骨分化。这在后续PCR的验证中进一步得到了证实。Ferreira等^[27]将骨形态发生蛋白4脂质体填入大鼠拔牙窝内，其通过促进纤连蛋白和Ⅲ型胶原的表达加速骨早期修复。另外骨形态发生蛋白2作为骨形成调控的关键因子，在骨组织工程中是研究的热门，前期研究和大量的文献报道均证实了这点，它可协同或调控Runx2、Osterix、Dlx及Ocn等多种成骨相关基因，诱导骨细胞的分化、成熟，进而形成骨组织。Pullisaar等^[28]研究发现，涂有含辛伐他汀藻酸盐水凝胶的TiO₂支架可通过上调骨钙素、血管内皮生长因子和骨桥蛋白，在体外促进人脂肪间充质干细胞成骨分化。血管内皮生长因子是一种高度特异性细胞因子，能直接作用于血管内皮细胞，促进细胞的增殖、分裂，促进局部血管的早期生成。此次实验中，人胎盘间充质干细胞与多孔羟基磷灰石支架构成的组织工程，在辛伐他汀脂质体纳米微球的作用下，使骨形态发生蛋白4及骨形态发生蛋白2早期高表达，而血管内皮生长因子则后期高表达，这表明骨形态发生蛋白家族在成骨早期起作用，促进相关成骨生长因子的表达。

多孔羟基磷灰石支架为很好的药物载体，为其在骨组织工程中的应用奠定了实验基础；辛伐他汀缓释微球纳米粒径小，且随时间缓慢释放，能维持较长时间的药物浓度，且易被细胞内吞而发挥作用，促进成骨相关基因高表达，但此次实验仅从单一层面证明了辛伐他汀缓释微球对多孔羟基磷灰石构建骨组织工程的影响，深入改性支架材料表面，将二者进行结合，以进一步提高羟基磷灰石的骨诱导性是接下来要继续完成的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

辛伐他汀缓释微球影响骨组织工程成骨性能的体外实验

Simvastatin sustained-release microspheres promote osteogenesis of bone tissue engineering in vitro

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