脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞移植改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0474

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1419-1424.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0474

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脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞移植改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力

高明龙¹，史少霞¹，张坤¹，张英东¹，李娜¹，余明¹，王永良^1，2

¹河北医科大学第一医院精神科，河北省石家庄市 050031；²河北省精神卫生研究所/河北省脑老化与认知精神科学重点实验室，河北省石家庄市 050031

修回日期:2018-01-19 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 王永良，硕士，主治医师，河北医科大学第一医院精神科河北省石家庄市 050031；河北省精神卫生研究所/河北省脑老化与认知精神科学重点实验室，河北省石家庄市 050031
作者简介:高明龙，男，1978年生，山东省茌平县人，主治医师，2003年齐齐哈尔医学院毕业，硕士，主要从事老年疾病研究。
基金资助:
河北省卫生厅科学研究项目(ZL20140099)；河北省卫生厅项目(20130578)

Effects of brain-derived neurotrophic factor-modified human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell transplantation on learning and memory abilities of Alzheimer's disease rats

Gao Ming-long¹, Shi Shao-xia¹, Zhang Kun¹, Zhang Ying-dong¹, Li Na¹, Yu Ming¹, Wang Yong-liang^{1, 2}

¹Department of Psychiatry, First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China; ²Hebei Provincial Institute of Mental Health/ Hebei Provincial Key Laboratory of Aging and Cognitive Psychology, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China

Revised:2018-01-19 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Wang Yong-liang, Master, Attending physician, Department of Psychiatry, First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China; Hebei Provincial Institute of Mental Health/Hebei Provincial Key Laboratory of Aging and Cognitive Psychology, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
About author:Gao Ming-long, Master, Attending physician, Department of Psychiatry, First Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Hebei Provincial Health Department, No. ZL20140099; the project funded by the Hebei Provincial Health Department, No. 20130578

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脑源性神经营养因子：是1982年Barde等首先在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质。脑源性神经营养因子及其受体在神经系统广泛表达。脑源性神经营养因子分布在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织等广泛区域内，但主要是在中枢神经系统内表达，其中海马和皮质的含量最高。
NGF受体：根据其糖蛋白与凝集素结合能力不同分为两型。Ⅰ型为高亲和力受体(TrkA)，是由原癌基因Trk编码的酪氨酸激酶受体，主要分布在神经元细胞膜上，少量在胞浆内。Ⅱ型为低亲和力受体(p75)，它与所有的神经营养因子以相似的亲和力结合，在成年大鼠和正常人脑中p75及其mRNA主要在基底前脑和海马表达。p75能够增强TrkA对NGF结合的亲和力和特异性，协助NGF/TrkA的逆行运输，同时也参与神经元凋亡的调控。

摘要
背景：研究发现多种干细胞治疗老年痴呆大鼠效果显著，但关于脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)修饰人羊膜间充质干细胞移植治疗老年痴呆的研究报道较少。
目的：探讨BDNF修饰人羊膜间充质干细胞移植对老年痴呆大鼠学习记忆能力的影响。
方法：将48只SD大鼠根据随机数字法分为对照组、模型组、干细胞移植组和BDNF修饰干细胞移植组，每组12只。后3组建立老年痴呆大鼠模型，干细胞移植组和BDNF修饰干细胞移植组大鼠基底前脑注射人羊膜间充质干细胞和BDNF修饰人羊膜间充质干细胞。移植后2周，大鼠在三等份辐射式迷宫箱中检测学习记忆能力，免疫组化染色结合图像分析测定p75 NGFR阳性神经元数目。
结果与结论：①模型组、干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数均低于对照组(P < 0.05)，干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数均高于模型组(P < 0.05)，BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数高于干细胞移植组(P < 0.05)；②模型组、干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力均低于对照组(P < 0.05)，干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力均高于模型组(P < 0.05)，BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力高于干细胞移植组(P < 0.05)；③BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习次数与p75 NGFR阳性神经元数呈负相关(P < 0.05)，记忆能力与p75 NGFR阳性神经元数呈正相关(P < 0.05)；④结果表明，人羊膜间充质干细胞移植可提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力，BDNF修饰人羊膜间充质干细胞可进一步提高人羊膜间充质干细胞的治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0545-594X(高明龙)

关键词: 脑源性神经营养因子, 羊膜间充质干细胞, 细胞移植, 老年痴呆, 学习, 记忆, p75 NGFR, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: A variety of stem cells have been found to be effective in the treatment of Alzheimer's disease in rats. However, few reports have been reported on the treatment of Alzheimer's disease rats with brain-derived neurotrophic factor (BDNF)-modified human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the effects of BDNF-modified human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell transplantation on the learning and memory abilities of Alzheimer's disease rats.
METHODS: Forty-eight Sprague-Dawley rats were divided into control group (no treatment), model group (Alzheimer's disease model), stem cell transplantation group (human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell transplantation+Alzheimer's disease model) and BDNF-modified stem cell transplantation group (BDNF-modified human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell transplantation+Alzheimer's disease model), 12 rats in each group. Learning and memory of model rats were determined in a trisection radiation maze and immunohistochemical staining was used to determine the number of p75 positive neurons at 2 weeks after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: The number of p75 positive neurons in the bevel zone and medial septal nucleus was ranked as follows: the model group < the stem cell transplantation group < the BDNF-modified stem cell transplantation group < the control group, and there were significant differences among groups (P < 0.05). The learning and memory abilities of the rats were ranked as follows: the model group < the stem cell transplantation group < the BDNF-modified stem cell transplantation group < the control group, and there were significant differences among groups (P < 0.05). In the BDNF-modified stem cell transplantation group, the number of learnings was negatively correlated with the number of p75 NGFR-positive neurons (P < 0.05), while the memory capacity was positively correlated with the number of p75 NGFR-positive neurons (P < 0.05). These findings reveal that human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell transplantation can improve learning and memory abilities of Alzheimer's disease rats, and BDNF-modified human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells can further improve this therapeutic effect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Amnion, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Brain-Derived Neurotrophic Factor, Alzheimer Disease, Learning, Memory, Receptor, Nerve Growth Factor, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

高明龙，史少霞，张坤，张英东，李娜，余明，王永良. 脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞移植改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1419-1424.

Gao Ming-long, Shi Shao-xia, Zhang Kun, Zhang Ying-dong, Li Na, Yu Ming, Wang Yong-liang. Effects of brain-derived neurotrophic factor-modified human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell transplantation on learning and memory abilities of Alzheimer's disease rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1419-1424.

图/表（结果） 2

2.1 人羊膜间充质干细胞的形态 培养12 h开始少量贴壁生长；培养24 h贴壁生长细胞增多(图1A)；培养72 h时贴壁细胞明显增多，细胞呈三角形、放射状或短梭状生长(图1B)；培养7 d细胞呈纺锤形或梭形成纤维细胞样生长，形成细胞克隆集落(图1C)。原代培养12 d贴壁细胞长满瓶底，呈长梭形、形态均一，漩涡状排列，达85%融合，经消化后进行传代。传代培养24 h细胞呈长梭形、完全贴壁生长；传代培养72 h细胞呈漩涡样排列，融合达80%以上；传代培养7 d细胞完全融合(图1D)，继续再次传代培养。

2.2 流式细胞仪检测人羊膜间充质干细胞表面标记 第3代人羊膜间充质干细胞表面高表达CD44、CD29、CD105、CD90分子，阴性表达CD34、CD31和CD45分子。

2.3 各组大鼠p75 NGFR阳性神经元数目比较 各组大鼠斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数比较差异有显著性意义(P < 0.05)，其中模型组、干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数均低于对照组(P < 0.05)，干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数均高于模型组(P < 0.05)，BDNF修饰干细胞移植组斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数高于干细胞移植组 (P < 0.05)。见表1，图2，3。

2.4 各组大鼠学习记忆能力比较 各组大鼠的学习记忆能力比较差异有显著性意义(P < 0.05)，其中模型组、干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力均低于对照组(P < 0.05)，干细胞移植组、BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力均高于模型组(P < 0.05)，BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力高于干细胞移植组(P < 0.05)。见表2。

2.5 BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习记忆能力与p75 NGFR阳性神经元数的相关性分析 BDNF修饰干细胞移植组大鼠的学习次数与p75 NGFR阳性神经元数呈负相关(P < 0.05)，记忆能力与p75 NGFR阳性神经元数呈正相关(P < 0.05)。见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机分组对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6至10月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 羊膜组织 羊膜来自足月顺产产妇胎盘，产妇均签署知情同意书。

1.3.2 实验动物 健康雄性SD大鼠48只，清洁级，体质量110-160 g，购自北京隆安实验动物养殖中心，动物许可证号：SYXK(京)2014-0040。

1.3.3 实验试剂 胎牛血清、LG-DMEM培养基、胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶、锥虫蓝染液(美国Sigma公司)；抗p75 NGFR单克隆抗体、CD44鼠抗人多克隆抗体、CD29鼠抗人多克隆抗体、CD105鼠抗人多克隆抗体、CD90鼠抗人多克隆抗体、CD34鼠抗人多克隆抗体、CD31鼠抗人多克隆抗体和CD45鼠抗人多克隆抗体(美国BD公司)；慢病毒载体、脂质体(美国Invitrogen公司)等。

1.4 实验方法

1.4.1 人羊膜间充质干细胞分离和培养 将胎盘放入玻璃器皿中，分离羊膜组织，用剪刀将羊膜剪碎，放入胰蛋白酶消化液中消化30 min，加入胎牛血清终止消化，加入胶原酶Ⅳ消化60 min，用不锈钢网过滤消化液制成单细胞悬液，置于离心管中离心(1 000 r/min)5 min，弃去上清液，用PBS悬浮细胞，再次离心，共3次；加入LG-DMEM培养基悬浮细胞，将细胞以5×10⁹ L^-1细胞浓度悬浮于培养基中培养，72 h首次换液，去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，待细胞达80%以上融合时进行传代培养。传代培养过程中每3 d换液1次，细胞达80%以上融合时再次混合消化液消化。

1.4.2 流式细胞学鉴定 收集第3代细胞，1 000 r/min离心10 min，锥虫蓝染色计数活细胞，分装到流式管中，分别加入CD44、CD29、CD105、CD90、CD34、CD31和CD45鼠抗人多克隆抗体，另取2管不加抗体作为间标和直标阴性对照，进行流式细胞仪检测。

1.4.3 BDNF修饰人羊膜间充质干细胞 采用反转录-聚合酶链反应技术获得大鼠BDNF基因编码区片段，限制性内切酶和基因重组构建BDNF慢病毒载体，在脂质体介导下与质粒共转染293T细胞生成慢病毒。将得到的BDNF慢病毒感染第3代人羊膜间充质干细胞。

1.4.4 大鼠分组和老年痴呆模型建立 将48只SD大鼠根据随机数字法分为对照组(未处理组)、模型组(老年痴呆模型组)、干细胞移植组(羊膜间充质干细胞移植+老年痴呆模型组)和BDNF修饰干细胞移植组(BDNF修饰羊膜间充质干细胞移植+老年痴呆模型组)，每组12只。模型组、干细胞移植组和BDNF修饰干细胞移植组大鼠均建立老年痴呆模型，大鼠麻醉成功后，参照大鼠脑立体定位图谱，用微型钻在大鼠颅骨上打孔，在大鼠双侧海马区内注射10 μL β-淀粉样蛋白，对照组注射等量的生理盐水。于造模2周后，采用Morris水迷宫方法检测各组SD大鼠的学习记忆能力下降，并且大脑前端皮质和海马内胆碱乙酰转移酶活性明显降低，说明造模成功。

1.4.5 干细胞移植 取第3代羊膜间充质干细胞和BDNF修饰羊膜间充质干细胞，调整细胞浓度为3×10¹⁰ L^-1进行同侧干细胞移植。选取坐标为前囟前0.6 mm、外侧0.6 mm，进针5.5 mm，注射细胞悬液5 μL。

1.4.6 大鼠学习记忆能力测定 移植后2周，大鼠在三等份辐射式迷宫箱中进行学习记忆能力检测，迷宫箱的每支臂顶端安装信号灯，信号灯亮区为安全区。在大鼠条件回避反应建立后开始测试，每天上午和下午各测试10次，共训练6 d，待大鼠跑到安全区的正确率达90%以上为学会标准，记录每只大鼠达到学会标准时所需的训练次数。

1.4.7 免疫组化染色 移植2周后，将大鼠麻醉成功后灌注固定，取脑组织在蔗糖溶液中过夜，然后取前脑组织进行切片，片厚40 μm，抗p75 NGFR单克隆抗体浓度调整为1∶1 000，根据ABC法进行免疫组化染色，染色后脱水、透明、封固。用图像分析仪测定各组p75 NGFR阳性神经元数目。

1.5 主要观察指标 ①人羊膜间充质干细胞的形态和表面标记表达；②各组大鼠p75 NGFR阳性神经元数目；③各组大鼠学习记忆能力。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行分析，多组之间均数比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD检验，相关性采用线性相关分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

随着老年痴呆发生率的升高，老年痴呆对人类健康的影响受到广泛关注，目前尚没有治疗老年痴呆的有效方法^[12]。近年来随着对干细胞研究的不断深入，干细胞在神经系统变性疾病治疗中的作用越来越引起大家重视，干细胞有可能成为治疗老年痴呆的新方法，外源性干细胞移植可自动迁移到损伤区域分化为胶质细胞和神经元细胞，从而改善认知功能^[13-14]。干细胞移植在帕金森病和老年痴呆等各种神经系统退行性病变实验研究中被广泛应用，特别在老年痴呆中的应用越来越受到关注，大量研究发现体外培养的骨髓间充质干细胞移植治疗老年痴呆大鼠可显著提高学习和记忆能力^[15-17]。

间充质干细胞为多能干细胞，在细胞移植和组织工程方面得到广泛应用，可作为种子细胞促进组织再生和修复，目前常用的干细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐血间充质干细胞等，在老年痴呆等多种疾病治疗的实验研究中取得良好效果^[18]。骨髓间充质干细胞来源于骨髓，在多种动物实验研究中被广泛应用，但骨髓的取材过程复杂，取材量少，在取材过程中给患者带来痛苦^[19-20]。脐血取材来源不受限制，但脐血取材量少^[21-24]。人羊膜间充质干细胞是新发现的一种干细胞，与脐血间充质干细胞表型相似，人羊膜间充质干细胞来源于羊膜，来源不受限制，取材量较多，对创面具有抗炎和抗瘢痕作用^[25-28]，人羊膜组织具有丰富的间充质干细胞，可被诱导分化为神经元样细胞^[29-33]。人羊膜间充质干细胞移植在多种动物实验中取得良好效果^[32-33]。

BDNF可促进神经干细胞向神经元分化，还可以诱导皮质神经干细胞定向转化为胆碱能神经元^[34-38]，BDNF修饰干细胞移植治疗神经损伤性疾病可提高干细胞的治疗效果^[39-41]。体外培养研究表明，BDNF能保护胆碱能神经元的存活^[42]。Morse等^[43]把BDNF注入海马离断后的侧脑室和内侧隔核内，发现其能保护胆碱能神经元，Alderson等^[44]用BDNF处理低密度胆碱能神经元，发现AChE阳性神经元和ChAT酶活力水平均明显增加。

实验结果发现：羊膜间充质干细胞移植可提高老年痴呆大鼠的斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数，提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力；BDNF修饰羊膜间充质干细胞进一步提高老年痴呆大鼠的斜角带和内侧隔核p75 NGFR阳性神经元数，提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力。表明羊膜间充质干细胞和BDNF在改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力上具有一定的协同作用，羊膜间充质干细胞在脑内可以分化为神经元，并分泌细胞因子对损伤神经发挥营养作用，BDNF可促进羊膜间充质间干细胞分化，通过和p75 NGFR结合对退变神经元发挥保护作用，减少神经元的丢失，从而提高老年痴呆大鼠的学习记忆能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脑源性神经营养因子修饰人羊膜间充质干细胞移植改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力

Effects of brain-derived neurotrophic factor-modified human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell transplantation on learning and memory abilities of Alzheimer's disease rats

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