有氧运动改善血管性痴呆大鼠认知功能的皮质机制研究：
随机对照实验方案

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
认知行为的神经电生理研究：将神经元电活动和行为反应结合起来进行的研究历经了一个“麻醉状态-清醒状态-自由活动状态”技术革新的探索过程。最初是动物在麻醉状态下进行神经电生理学测试，因为麻醉剂可以抑制或改变神经元的电活动模式，因而这一传统方法的有效性受到了质疑；之后又发展了动物清醒状态下的神经电生理学测试，其优势是可以发现许多麻醉动物脑内观察不到的脑机制，但这种方法动物必须固定在实验台上被动地感受刺激，不能根据接受到的信息做出主动的行为反应；最近开发了动物自由活动状态下的神经电生理学测试，动物可在自由活动状态下进行行为学训练与测试，更接近自然状态，动物更愿意配合建立认知条件反射。
感觉与前额叶皮质与认知的关系：感觉皮质能够感知并对外界信息进行编码、分析，在认知行为过程中起着重要的信息感知和初步加工的作用；前额叶皮质与行为认知决策、工作记忆等密切相关。前额叶皮质与杏仁核、纹状体、顶叶、颞叶等脑区有着丰富的交互纤维联系，该皮质分为腹外侧、腹内侧、背内侧、背外侧、眶区5个部分，其中背侧前额叶是参与工作记忆和认知活动的关键脑区。

摘要
背景：迄今，有关有氧运动促进血管痴呆性大鼠认知康复机制的研究，国内外绝大多数实验集中在行为学实验观察和体外海马组织的指标检测，而从(在体)感觉与前额叶皮质的角度探索这一康复机制的研究较少。
方法/设计：随机对照动物实验。基于课题组自主开发的动物在认知行为过程中同步神经电生理记录技术，设计以下实验：首先训练大鼠使之能够对两种明显不同的声音做出不同的行为反应，建立血管性痴呆大鼠模型，以正常大鼠、痴呆大鼠模型，短、中、长期有氧运动(跑台/跑轮)干预的痴呆模型为研究对象；然后在听觉及前额叶皮质埋植可植入性微细电极，进行声音摄水的认知行为训练，观察大鼠的认知行为学特点、同步记录听觉与前额叶皮质神经元电活动、并进行皮质的分子水平实验和超微结构观察。
结果与结论：实验利用行为学、电生理学、分子生物学与组织学技术，观察有氧运动促进痴呆大鼠认知功能改善的皮质机制，旨在为认知损害相关疾病、感觉和运动性失语症等精神与神经系统疾病的诊断和治疗提供科学依据。
伦理批准：实验方案经沈阳体育学院动物实验伦理委员会批准。大鼠的实验操作和取材遵循《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，并与美国国立卫生研究院的指南一致。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7854-4134(张新安)

关键词: 组织构建, 组织工程, 有氧运动, 认知障碍/损害, 血管性痴呆, 神经电生理, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Research on the mechanism underlying aerobic exercise improving cognitive function of rats with vascular dementia mainly focuses on behavioral observation and indicator detection in the hippocampus in vitro; however, there is a lack of in vivo experiments in view of the sensory and prefrontal cortex.
METHODS/DESIGN: A randomized controlled animal experiment has been designed. Based on the synchronous nerve electrophysiology recording developed by our research group, the experiment is designed as follows: rats are trained firstly to make different reactions to different sounds, and are then modeled into vascular dementia. There are normal, vascular dementia, and vascular dementia undergoing short-, median-, and long-term aerobic exercise (treadmill/wheel) rats. Afterwards, the implantable microelectrodes are implanted into the auditory and prefrontal cortex, followed by the cognitive behavior training. The characters of rat cognitive behavior are observed, the electrical activity of sensory and prefrontal cortical neurons are recorded synchronously, the cortical experiment at molecular level is performed and the ultrastructure of brain tissue is observed.
RESULTS AND CONCLUSION: This study investigates the cortical mechanism by which aerobic exercise improves the cognitive function of vascular dementia rats utilizing etiology, electrophysiology, molecular biology and histological technologies, aiming at providing feasible ideas for the diagnosis and treatment of relative mental and nervous system diseases.
ETHICAL APPROVAL: This study was approved by the Ethics Committee of Shenyang Sport University. The disposal of rats was in line with the Guideline for the Care and Use of Laboratory Animals and the Guideline of USA National Institutes of Health.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Dementia, Vascular, Cognition Disorders, Exercise Therapy, Electrophysiology, Models, Animal

中图分类号:

R318

张新安. 有氧运动改善血管性痴呆大鼠认知功能的皮质机制研究：
随机对照实验方案[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(46): 6943-6949.

Zhang Xin-an. Cortical mechanism underlying aerobic exercise promoting cognitive function of vascular dementia rats: study protocol for a randomized controlled trial[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(46): 6943-6949.

图/表（结果） 1

2.8 行政部分

2.8.1 实验条件及设备支持 ①已成功自主开发了一套电生理记录与行为实验同步进行的操作系统，利用它可以把32导联美国进口电极植入动物大脑皮质的指定部位。该系统通过牙科水泥固定在颅骨表面，可以随动物一起运动。电极输出的电信号通过无线发射装置到达记录系统。②实验室已经成功复制了日本山梨大学生理学研究室的所有实验设施，搭建了成熟的神经电生理、认知科学实验研究平台。③组织学实验由中国医科大学电镜室完成。

2.8.2 动物的饲养中国医科大学动物中心提供质量合格的实验动物，专人饲养，标准饮食，分笼喂养，自由饮水，实行12 h/12 h间断照明，饲养环境温度控制在(24±2) ℃。

2.8.3 数据质量保证 ①结果数据表格由研究者制作，研究者认真填写数据记录表，记录过程不遗漏项目，经常核对；②监察员应定期确认所有的数据记录正确完整，与原始记录一致；③由2个数据录入员负责抄录实验结果，分别将抄录后的文档标注日期上传至指定的电脑备份。

2.9 总条款和协议

2.9.1 科研审查委员会由国家自然科学基金委员会批复，同意开展“有氧运动促进血管性痴呆大鼠认知功能康复的皮层机制研究”相关研究。

2.9.2 伦理指导由内蒙古医科大学动物实验伦理委员会进行审核。

2.9.3 伦理批准实验方案经沈阳体育学院动物实验伦理委员会批准。大鼠的实验操作和取材遵循《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，并与美国国立卫生与健康研究院的指南一致。

2.9.4 研究数据的保密实验数据包括书面数据和电子版数据两种形式，电子版数据由研究者核对并对数据库进行锁定，锁定后的数据文件不允许再作变动并将数据库保存备查，任何非授权内研究者外的人员均不得接触。书面数据存放于固定地点并加锁，钥匙由资料管理员和研究室负责人保管。

2.9.5 资料存档所有原始资料由文档管理员专人完整保存，同时复制一份电子版资料，以方便使用。

2.9.6 文章发表实验完成后总结实验数据，进行实验数据的统计学分析，撰写研究报告，总结报告，作结题的准备。由主要研究者撰写科研论文。

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引言

1 前言 Introduction

1.1 学术背景及理论基础随着人口老龄化问题的加剧，脑血管疾患不断增多，由此带来的血管性痴呆发病率呈上升趋势^[1-2]。研究发现，痴呆患者存在不同程度的认知损害，主要表现为近事记忆力下降、注意力障碍、反应迟钝等神经退行性改变，并伴有社会功能障碍^[3-4]，因此探索该类疾病的认知损害康复方案及其机制迫在眉睫。

多年来由于技术瓶颈，国内外学者在细胞和分子水平的神经科学研究大多集中在信息的感知、神经元传递过程及其可塑性变化等方面，仅有少数实验室对认知行为的脑机制开展了深入探索。美国神经与认知科学领域的权威科学家 Cohen 等指出，直接研究神经元电活动和动物行为反应的相关性是行为认知领域未来发展的重要方向^[5]。回顾研究历史，将神经元电活动和行为反应结合起来进行的研究历经了一个“麻醉状态-清醒状态-自由活动状态”技术革新的探索过程^[6-14]。

Romo等^[15]证实：感觉皮质能够感知并对外界信息进行编码、分析，在认知行为过程中起着重要的信息感知和初步加工的作用；前额叶皮质与行为认知决策、工作记忆等密切相关。有研究发现，声音刺激信息能够增强幼龄大鼠大脑听觉皮质的突触可塑性，提高信息的传递、加工效能^[16]。有研究认为大鼠经反复声音刺激，突触素在其听觉皮质的表达显著增加。而成年大鼠突触可塑性变化除了感觉信息的刺激，还需要行为学训练才会有明显改变^[17-18]。那么在信息刺激和行为学训练基础上，适当的有氧运动干预，是否能够增强大脑感觉皮质的突触可塑性，有待进一步探索。

研究表明，参与前额叶皮质突触传递过程主要的离子通道型N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-asParta，NMDA)受体NR2B亚基在神经系统的发育以及成年后的突触可塑性中发挥重要的作用^[18]。有研究者用药理学方法观察到，NR2B亚基在成年大鼠前额叶皮质有丰富的表达，阻断前额叶皮质NR2B亚基后，大鼠的工作记忆受到损害。另外，神经细胞黏附分子(neural cell adhesionmolecule，NCAM)在海马、额叶等脑区参与轴突生长、信号传导、神经细胞迁移和分化、神经元的损伤修复和突触可塑性等神经活动，并且NCAM合成调控依赖于NMDA受体-NO途径^[19]。

1.2 前期实验介绍课题组已开发出动物在清醒状态下自由活动时，同步记录神经元电活动的实验技术平台，并且系统研究了大鼠在多种形式刺激下认知行为的神经机制，证实了自行设计的行为测试与电生理记录系统稳定，技术手段与方法成熟、可靠。

前期研究发现：血管痴呆性大鼠存在着认知障碍，4 周跑台运动能够改善其认知能力，并在大鼠认知行为过程中，记录神经元放电活动，发现听觉与前额叶皮质分别对刺激信息和行为活动进行编码，能够很好地解释大鼠的行为学表现。

1.3 研究的理论依据近年来，大量实验证明有氧运动能促进学习记忆等脑的高级功能发展。从运动干预方式上看，Salim和Brown^[20-21]认为，跑台为被动干预，跑轮运动则是自主性活动，两者均能够促进动物的学习记忆能力，并将2周的跑台或跑轮运动确定为短期有氧运动，4 周、8 周分别为中、长期运动干预。迄今，有关有氧运动促进血管痴呆性大鼠认知康复机制的研究，国内外绝大多数实验集中在行为学实验观察和体外海马组织的指标检测，而从(在体)感觉与前额叶皮质的角度探索这一康复机制的研究较少。

基于课题组自主开发的动物在认知行为过程中同步神经电生理记录技术，结合离体的分子生物学、组织学检测实验，探索有氧运动促进痴呆大鼠认知功能改善的皮质机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

2 实验设计与方法 Experimental protocol and methods

2.1 实验设计类型及描述随机分组对照，动物体内实验。

2.2 实验完成地点中国，沈阳，沈阳体育学院国家体育总局重点实验室多导电生理实验平台和分子生物学实验室及中国医科大学电镜室。

2.3 研究目的

2.3.1 主要目的 ①明确正常大鼠、痴呆大鼠和不同时期有氧运动干预大鼠的行为学特征，阐明不同时期运动干预对痴呆大鼠认知功能的康复促进效果；②明确听觉和前额叶皮质参与大鼠行为认知过程中的神经元电活动规律、分子机制特征，结合分子生物学与组织学指标，揭示有氧运动促进痴呆大鼠认知功能康复中两个皮质的作用机制。

2.3.2 次要目的比较主、被动运动干预方式可能的作用机制，从而揭示不同方式有氧运动促进认知损害模型康复的皮质机制。

2.4 实验方法

2.4.1 动物选择及分组选择健康成年SPF级雄性Wistar大鼠，体质量300-320 g，鼠龄10周，由中国医科大学动物中心提供。所有Wistar大鼠体型正常，健康状况良好，排除健康状况不良，不活泼，有发烧、腹泻等症状者。

540只雄性Wistar大鼠按照数字随机表法分为15组，具体分组及命名情况见表1。为防止埋置的微细电极对皮质形成轻微感染影响分子生物学实验，各组20只大鼠用于埋置电极、电生理记录，其余20只大鼠只进行运动干预和行为学测试，不埋置电极，以更好的进行分子生物学实验。

表1 实验分组及命名表

Table 1 Experimental allocation and naming

因素		组名	n
对照组		正常对照组	20
		痴呆模型对照组	20
		假手术对照组	20
短期(2周)运动干预
跑台	痴呆	短期跑台干预痴呆模型组	40
跑台	假手术	短期跑台干预假手术组	40
跑轮	痴呆	短期跑轮干预痴呆模型组	40
跑轮	假手术	短期跑轮干预假手术组	40
中期(4周)运动干预
跑台	痴呆	中期跑台干预痴呆模型组	40
跑台	假手术	中期跑台干预假手术组	40
跑轮	痴呆	中期跑轮干预痴呆模型组	40
跑轮	假手术	中期跑轮干预假手术组	40
长期(8周)运动干预
跑台	痴呆	长期跑台干预痴呆模型组	40
跑台	假手术	长期跑台干预假手术组	40
跑轮	痴呆	长期跑轮干预痴呆模型组	40
跑轮	假手术	长期跑轮干预假手术组	40

2.4.2 干预方法介绍

血管性痴呆模型制作：应用经典双侧颈总动脉结扎(2-VO)方法制作痴呆大鼠模型，术前8-12 h禁食不禁水，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉。仰卧固定，腹侧颈正中行切口，钝性分离双侧颈总动脉，用4号缝线双重结扎双侧颈总动脉，伤口用庆大霉素处理防止感染，缝合皮肤。术中注意防止过分牵拉刺激或损伤迷走神经。

行为训练方法：采用的训练方法为Go/No-Go 的行为反应模式。大鼠禁水不禁食一两天，当目标刺激声响起时来添给水管(Go反应)，就会从中得到水；但当非目标刺激声音发出时，管中不但没有水，还会带电，此时要求不来舔管(No-Go反应)。

声音刺激条件及认知训练过程：认知行为训练为“声音摄水反射”。大鼠禁水不禁食24-48 h，首先通过训练听到声音后反射性的舔金属给水管，感应器感应到大鼠前来摄水后发出给水指令，给水泵随即推出一点水。经过一两天训练，大鼠能够形成较为稳定的条件反射(正确率≥ 75%)。然后进行声音识别认知训练，声音频率为4 kHz、强度50 dB，声音刺激开始/结束时的上升/下降时间均为5 ms，每个声音刺激由3部分组成，前一部分总是持续160 ms，中间为80 ms的时间间隔，最后为持续160 ms的相同刺激为靶刺激，最后为80 ms为非靶刺激。受试大鼠要求在听到靶刺激时舔给水管，在非靶刺激时不舔给水管。每100次刺激组成一个刺激组，一般情况下，大鼠每天可以完成四五个刺激组的训练。

电极埋置：术前一两天不禁水、禁食，全麻后将大鼠固定于手术台上，除去头部的毛发等，剪开头皮，剥离肌肉、去除帽状腱膜等软组织，暴露头骨，用立体定位仪定位大鼠的听觉质和前额叶皮质，植入32导联电极，在大鼠枕骨上方用牙科水泥封固一个带有螺丝的不锈钢金属块来固定大鼠。

跑台训练：每天跑台训练60 min，20 m/min，早晚各1次。每次从10 m/min开始，经过5 min达到20 m/min，30 min/次。

跑轮训练：采用自制自主跑轮，使大鼠进行自主跑轮运动。跑轮上装有电子计数器，记录转轮圈数。大鼠生活在装有自主跑轮的笼子里，自主运动，每天下午5：00-6：00记录大鼠所跑圈数，作为当日的运动量。

2.4.3 有氧运动改善痴呆大鼠认知行为学特点

正常大鼠认知声音的行为学表现：正常对照组大鼠进行Go/No-Go 的行为训练。从10周龄始，将大鼠放在行为学训练笼，开始“声音摄水反射”的认知行为训练，大鼠经过不足1周的训练能够得到较为稳定的行为学表现。选取行为学实验后约11周龄大鼠埋置电极，经术后恢复和适应性训练，约12周龄大鼠进行认知行为学测试。

痴呆模型组和假手术组大鼠的声音认知行为学特点：痴呆模型对照组大鼠结扎双侧颈总动脉方法制作血管性痴呆模型，假手术对照组只分离双侧颈总动脉并不结扎。两组大鼠同样埋置电极后进行认知行为学测试。

运动干预痴呆大鼠的认知行为学特点：3个跑台/跑轮干预痴呆模型组同前制备血管性痴呆大鼠模型，3个跑台/跑轮干预假手术组同样不结扎双侧颈总动脉。造模后(约11周龄)开始进行跑台/跑轮训练，短期运动干预组坚持运动2周，中期运动干预坚持运动4周，长期运动干预组坚持运动8周。完成运动干预后同样埋置电极，进行认知行为学测试。

2.4.4 听觉皮质和前额叶皮质在认知损害模型康复促进中的细胞机制各组大鼠在电极埋置后的行为学测试中，同步记录听觉与前额叶皮质单个神经元的电活动。分析声音认知过程中，听觉初级皮质及各次级皮质、前额叶皮质各脑区的编码作用特点。

2.4.5 有氧运动促进痴呆大鼠认知功能康复的分子机制各组大鼠最后一次行为学测试与电生理记录完成24 h后，断头取脑，将听觉与前额叶皮质不同脑区分别剥离出来，取出少量皮质组织，放入2.5%戊二醛中固定，以备电镜制样。其余组织的1/2 投入到液氮罐中速冻，另1/2组织加入trizol，冰箱保存以备检测。用Western blotting及Real time-PCR检测大脑听觉与前额叶皮质突触素、前额叶皮质NCAM及NMDA受体NR2B亚基的蛋白及mRNA表达情况。

2.4.6 听觉和前额叶皮质在认知损害模型康复促进中的超微结构观察各组大鼠脑组织取材后，从戊二醛溶液中取出海马组织，常规包埋、制片，用Tecnai12型透射电镜观察海马组织的超微结构，包括突触数量、前膜后膜，突触间隙，突触小泡等形态学特点，摄片并存档。

2.5 研究设计

2.5.1 研究设计概要用行为学、电生理学、分子生物学、组织学等4种技术方法探索有氧运动促进认知损害模型康复的皮质机制。

2.5.2 实验计划实验计划解决4个问题：①有氧运动改善痴呆大鼠认知行为学特点研究；②听觉和前额叶皮质在认知损害模型康复促进中的细胞机制；③有氧运动促进痴呆大鼠认知功能康复的分子机制研究；④听觉和前额叶皮质在认知损害模型康复促进中的超微结构观察。

2.5.3 实验步骤

(1)在不同长短声音刺激下，训练大鼠建立摄食认知条件反射。

(2)在大鼠听觉与前额叶皮质埋植长期可植入性电极。

(3)进行正常对照组的行为学、电生理、分子生物学与组织学实验。

(4)痴呆模型造模，并在适应性训练后进行造模后大鼠的行为学、电生理和分子生物学与组织学实验。

(5)进行短期运动干预大鼠的行为学、电生理和分子生物学与组织学实验。

(6)进行中、长期运动干预实验大鼠的行为学、电生理和分子生物学与组织学实验。

(7)综合分析大鼠建立行为学、电生理学、分子生物学与组织学实验结果，探索大脑听觉及前额叶皮质在有氧运动促进痴呆大鼠模型认知功能康复中的作用机制。

2.5.4 实验动物脱落情况在实验过程中有大鼠死亡脱落者，记录并分析原因，并且补足动物数量。

2.5.5 技术路线图见图1。

2.6 指标与观察

2.6.1 主要观察指标 ①认知行为学测试结果；②听觉和前额叶皮质神经元电活动；③听觉与前额叶皮质突触素、前额叶皮质NCAM及NMDA受体NR2B亚基的蛋白及mRNA表达。

2.6.2 次要观察指标听觉和前额叶皮质组织的超微结构，包括突触数量、前膜后膜，突触间隙，突触小泡等形态学特点。

2.6.3 实验观察指标一览表见表2。

2.7 统计方法

2.7.1 研究假设所有假设检验均为双侧检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

2.7.2 样本量根据预实验结果，15组中3个对照组各20只，其他12组各40只大鼠(其中20只大鼠用于埋置电极进行电生理记录，其余20只不埋置电极，进行分子生物学实验)。

2.7.3 实验分析利用 Matlab(Mathworks)进行实验数据统计处理。分析痴呆大鼠、进行短、中、长期有氧运动干预的痴呆大鼠，跑台、跑轮两种运动干预方式下，大鼠的认知行为学特点、两个皮质不同区域神经元的编码特点、两皮质的不同脑区分子生物学指标的特征、超微结构情况。

2.7.4 统计分析由不参与实验的专业统计人员完成统计工作。在所有数据录入、审核完毕后，统计人员应及时完成统计分析工作，交付实验的主要研究者，写出研究报告。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程