1.1 设计 同源重组法构建大鼠DGKγ慢病毒过表达载体。
1.2 时间及地点 实验于2019-05-01在山西医科大学完成。
1.3 材料 实验中所用质粒和293T细胞均由作者所在实验室保存；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、DNA Marker和限制性内切酶购买自Takara公司；PCR试剂盒、无内毒素质粒中提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购买自康为世纪生物公司；RNA提取试剂、Lipofectamine 2000转染试剂盒购买自Invitrogen公司；一步定向克隆试剂盒购买自近岸蛋白科技公司。ploybrene和嘌呤霉素购买自索莱宝科技公司；人β-actin内参引物(NO. B661102)购自上海生工生物工程有限公司。羊抗DGKγ购买自Santa Cruz公司；兔抗 β-actin多克隆抗体购买自博士德生物工程有限公司。
正常成年健康SD大鼠3只，雄性，体质量300-350 g，由山西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SXYK2009-0001。
1.4 方法
1.4.1 引物设计 在NCBI上检索到大鼠DGKγ基因转录产物序列NM_013126.1，其编码序列(coding sequence，CDS)全长2 367 bp。利用BioXM软件，遵循引物设计基本原则，设计两对上下游引物分别扩增CDS区5’端1 029 bp的碱基(片段一，F1)和3’端1 362 bp的碱基(片段二，F2)，其中片段一的3’端和片段二的5’端之间拥有24 bp重叠。在片段一上游引物的5’端和片段二下游引物的5’端分别加入15-20 bp的载体同源序列，保证片段插入载体的方向。PCR反应用到的引物序列如下：F1 for：5'-CCT CCA TAG AAG
ATT CTA GAG CCA CCA TGA GTG ACG GGC AAT GGG TCT GTC TCT CAT CAG AAG AAT-3'和F1 reverse 5'-GAC GGA GGA GTT CCC TTC CAC-3'；F2 for：5'-TGG GTG GAA GGG
AAC TCC TCC GTC-3'和F2 reverse：5'-GCA GAT CCT TCG
CGG CCG CTT AGT CCT TTG AAC GGC TTT TCC TCC TCA GAG AAA AGA AGC-3'。扩增CDS区的上下游引物分别为F1 for和F2 reverse。
1.4.2 目的片段扩增 用TRIzol法提取成年SD大鼠脑组织中总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增片段一和片段二，反应条件如下：预变性94 ℃，2 min；变性94 ℃、30 s，退火60 ℃、35 s，延伸72 ℃、2 min，35个循环；终延伸72 ℃，5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带并测序，测浓度后用于穿梭质粒的构建。
1.4.3 穿梭质粒构建 在50 μL酶切反应体系中，加入5 μL 10xQuickcut
green buffer，38 μL无菌水，5 μL质粒载体(< 1 μg)，1 μL EcoR I酶和1 μL BamH I酶，充分混匀，37 ℃反应1 h，回收纯化酶切产物并用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，测浓度后用于质粒构建。在20 μL同源重组反应体系中，加入线性化载体、片段一和片段二胶回收产物，线性化载体总量为150
ng，两个片段与载体的摩尔质量比为2︰2︰1，50 ℃反应25 min。取重组产物转化DH5α感受态细胞，涂板，37 ℃恒温培养箱过夜，氨苄青霉素筛选后，挑10个单克隆培养菌液。随机选取两管菌液用质粒中提试剂盒提取质粒作为模板进行PCR反应，扩增CDS区、片段一和片段二，1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带并测序，将测序成功的质粒命名为CMV-rat
DGKγ-GFP。CMV-rat
DGKγ-GFP质粒上含有目的基因rat DGKγ的CMV启动子和CDS区序列，以及标记基因GFP的EF1α启动子和CDS区序列。
1.4.4 293T细胞培养与慢病毒包装 将293T细胞株接种于3.5 cm培养皿中，培养基为含体积分数10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的高糖DMEM完全培养基，37
℃体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。待细胞密度达80%-90%，细胞状态良好时进行慢病毒包装。用无血清的DMEM培养基制备CMV-rat DGKγ-GFP质粒和2个包装质粒三者混合的稀释液300 μL，质粒的质量比为5︰2︰3，总量为4.0
μg，室温孵育5 min；取7.5 μL Lipofectamine 2000，加到300 μL无血清的DMEM培养基中混匀；将上述2种稀释液混匀，室温孵育20 min，形成DNA-lipid复合物。用1.2
mL含血清DMEM培养基替换旧培养基，将600 μL DNA-lipid复合物逐滴加入培养基中，轻轻晃动培养皿温和混匀。转染6 h后，荧光倒置相差显微镜下观察到绿色荧光，将上清液更换为完全培养基；转染48 h后，可见绿色荧光增强，GFP阳性细胞数增多；转染72 h后，收集培养皿中含病毒颗粒的上清液，用0.45
μm针头式滤器过滤掉细胞碎片后备用。
1.4.5 CMV-rat
DGKγ-GFP慢病毒感染293T细胞 将293T细胞株接种于含完全培养基的3.5 cm培养皿中，细胞密度达到60%左右，细胞状态良好时，将CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒毒液1 mL与等量的培养基混匀后置换旧培养基，并加感染促进剂ploybrene即用型溶液，按1︰1 000稀释。感染24 h后，荧光倒置相差显微镜下观察到部分细胞呈GFP阳性表达；感染48 h后，可见GFP阳性细胞数增多；感染72 h后，用浓度为10 mg/L的嘌呤霉素筛选GFP阳性细胞，收集细胞进行荧光定量PCR检测和Western blotting检测。以CMV-GFP空载体作为对照。
1.4.6 荧光定量PCR检测DGKγmRNA的表达 用TRIzol法提取各组细胞的总RNA，反转录合成cDNA，用RT-qPCR检测各组样本中DGKγ的表达量，重复3次，采用2-∆∆Ct法计算DGKγ相对于内参基因β-actin的表达量。大鼠DGKγ基因荧光定量PCR的上下游引物为：F 5'-GTG GGA TCC CAC
AGA GCT CAG-3'和R 5'-GAC
GGA GGA GTT CCC TTC CAC-3'；PCR扩增条件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s →60 ℃，30 s →72 ℃，20 s共40个循环；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95℃，15 s。
1.4.7 Western
blotting检测DGKγ蛋白的表达 用RIPA裂解法提取各组细胞的蛋白质，100 ℃煮沸10 min使蛋白变性，经12% SDS-PAGE电泳，转膜后用5%蛋白干粉(TBST配制)封闭1.5 h，分别加入一抗羊抗 DGKγ(1︰100)、兔抗β-actin多克隆抗体(1︰1 000)，4 ℃孵育过夜。分别加入HRP标记的兔抗羊IgG (1︰5 000)、羊抗兔IgG(1︰5 000)，室温孵育1 h，膜上滴加低背景化学发光剂，于全自动凝胶成像系统曝光并拍照，实验重复3次。用 Image J软件对显影条带进行测量，目的蛋白与内参条带的灰度比值为目的蛋白的相对表达水平。
1.5 主要观察指标 CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒载体PCR产物测序鉴定结果，293T细胞被慢病毒感染后DGKγ mRNA和蛋白的表达。
1.6 统计学分析 用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示，两组间的比较用t 检验分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
