构建线粒体钙离子摄入蛋白1慢病毒表达载体及在H9C2细胞中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
线粒体功能紊乱：主要以线粒体钙稳态失衡为角度阐述线粒体功能紊乱在细胞生物学功能中所发挥的作用。细胞线粒体钙主要与细胞胞浆钙稳态、线粒体三羧酸循环关键酶、细胞自噬、生存、死亡以及线粒体的空间位置等关系密切。
线粒体钙离子单向转运复合体：目前研究发现，该复合体主要以构成线粒体内膜孔道的线粒体钙离子单向转运蛋白，以及调剂其活性的MICU1，MICU2，MCUR1及EMRE组成，共同完成细胞线粒体钙摄取的精密调节。

摘要
背景：线粒体钙离子摄入蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1, MICU1)是维持细胞线粒体钙稳态的重要分子，MICU1对线粒体钙稳态的调节可能在糖尿病心肌病的发生及发展中起着重要作用，但目前机制尚不明确。
目的：构建MICU1基因的慢病毒表达载体，产毒感染H9C2细胞，评价MICU1基因在H9C2细胞中的表达效果，为后续在细胞水平研究糖尿病心肌病的发生及发展建立平台。
方法：PCR提取H9C2细胞MICU1基因，SpeⅠ、EcoRⅠ双酶切后，将MICU1基因片段插入慢病毒载体pRRLsin.CMV.eGFP中，构建慢病毒表达质粒pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP。使用pCMVDR8.91、pCMV-VSVG共转染于293T细胞中包装产毒，用于感染H9C2细胞。通过RT-PCR及Western blot检测感染后H9C2细胞中MICU1 mRNA及蛋白的表达。共聚焦显微镜检测Rhod-2染色H9C2细胞后线粒体钙水平。
结果与结论：①MICU1基因成功插入pRRLsin.CMV.eGFP慢病毒表达质粒；②转染pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP慢病毒表达质粒后，可见293T细胞表达绿色荧光蛋白，并且MICU1的蛋白表达明显升高；③病毒液感染H9C2细胞后，MICU1的蛋白及mRNA水平较未感染组及空质粒包装组明显升高；④Rhod-2染色后观察发现，MICU1能够明显增强线粒体钙水平；⑤结果表明，pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP慢病毒能够高效感染H9C2细胞，为构建永生化细胞系奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-6829-4901(荆哲)

关键词: 组织构建, 组织工程, H9C2细胞, 线粒体钙离子摄入蛋白1(MICU1), 慢病毒载体, 病毒包装, 钙

Abstract:

BACKGROUND: Mitochondrial calcium uptake 1 (MICU1) is one of the important molecules to maintain the mitochondrial calcium homeostasis. The regulation of MICU1 to mitochondrial calcium homeostasis may play an important role in diabetic cardiomyopathy, but the underlying mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To construct a lentiviral vector carrying MICU1 gene to transfect H9C2 cells, and then to assess MICU1 level in H9C2 cells thereby establishing a platform for researching the occurrence and development of diabetic cardiomyopathy at a cellular level.
METHODS: DNA fragments of MICU1 were amplified by PCR, cleaved with Spe I, EcoR I and cloned into the lentiviral vector pRRLsin.CMV.eGFP to construct pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP vector. 293T cells were co-transfected with recombined pCMVDR8.91 and pCMV-VSVG to produce pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP lentiviral viruses, and then used to infect H9C2 cells. mRNA and protein expressions of MICU1 in the transfected H9C2 cells were evaluated by real-time PCR and western blot assay. Mitochondrial calcium level in Rhod-2-stained H9C2 cells was tested under confocal microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: The recombinant inducible lentiviral vector containing MICU1 gene was successfully constructed. 293T could express green fluorescent protein with increased MICU1 level after pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP transfection. The mRNA and protein expressions of MICU1 in the infected H9C2 group were obviously up-regulated compared with the other groups. MICU1 could remarkably improve the mitochondrial calcium level under Rhod-2 staining. These results show that pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP lentiviral viruses are efficient to transfect H9C2 cells, which will be powered to lay a foundation for the immortalized cell line establishment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Lentivirus Infections, Mitochondrial Proteins, Myocytes, Cardiac

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 成功构建大鼠MICU1基因组慢病毒表达载体pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP 将构建的pRRLsin.CMV. MICU1-eGFP进行测序，测序结果与GenBank的大鼠MICU1基因(NM_199412.1)编码区序列(CDS)比对，相似性达100%。pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP质粒经SpeⅠ及EcoRⅠ双酶切，酶切产物发现pRRLsin. CMV.eGFP(11 kb)片段和MICU1目的基因片段(1.8 kb) (图4)，表明该目的片段已正确插入pRRLsin.CMV.eGFP表达载体，pRRLsin.CMV.MICU1- eGFP表达质粒构建成功。

2.2 转染pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP质粒后293T细胞GFP的表达将pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP质粒和包装质粒共转染293 T细胞8 h，可以看到绿色荧光蛋白的表达呈阳性，随着培养时间增加，荧光表达增强，在48 h时达到最强，通过观察表达绿色荧光蛋白细胞比例，判断转染效率达80%以上(图5)。

2.3 重组慢病毒滴度的测定及MICU1基因的表达 pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP质粒和包装质粒共转染293T细胞后，成功包装表达具有MICU1基因和GFP基因的慢病毒。病毒基因组PCR证实重组慢病毒含有MICU1基因片段(图6)。Western blot证实转染pRRLsin. CMV.MICU1-eGFP质粒的293T细胞MICU1蛋白表达明显增加(图7)。收集、浓缩重组慢病毒后按逐孔稀释滴度测定法测定其滴度为6×10⁸ TU/L。

2.4 MICU1基因重组慢病毒感染H9C2细胞后MICU1的表达将MICU1基因重组慢病毒感染H9C2细胞后，可以看到绿色荧光蛋白的表达呈阳性，随着培养时间增加，荧光表达增强，在72 h时达到最强，通过观察表达绿色荧光蛋白的H9C2心肌细胞比例，判断感染效率为60%以上(图8)。qPCR检测感染后H9C2细胞MICU1 mRNA表达水平及Western blot检测MICU1蛋白表达水平。结果表明，MICU1重组慢病毒组MICU1 mRNA表达水平与蛋白表达水平明显强于空质粒慢病毒组和未感染组(图9，10)。

2.5 MICU1基因重组慢病毒感染H9C2细胞线粒体内钙水平采用Rhod-2染料染色后检测3组H9C2细胞的线粒体内钙水平的改变，结果发现，MICU1重组慢病毒组的Rhod-2荧光强度明显强于空质粒慢病毒组和未感染组(图11)，提示MICU1能够促进线粒体内钙水平的增高，这一结果与Madesh等^[21]发表在《Cell》杂志上关于MICU1能够促进线粒体钙摄取的结果相一致。

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引言

材料方法

1.1 设计实验方法相关基础医学实验。

1.2 时间及地点于2014年3至12月在解放军第四军医大学基础医学教学实验中心完成。

1.3 材料 SD大鼠购自解放军第四军医大学动物中心。慢病毒表达载体pRRLsin.CMV.eGFP及其包装质粒pCMVDR8.91、pCMV-VSVG由解放军第四军医大学生化教研室提供；大肠埃希菌感受态细胞DH5a购自天根生化科技有限公司；人胚肾上皮细胞系293T、H9C2心肌细胞系购自中科院上海细胞库；限制性内切酶、T₄ DNA连接酶、Trizol、反转录试剂盒购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒、无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；lipofectamine2000、线粒体钙染料Rhod-2购自Invitrogen公司；MICU1抗体购自NOVUS公司；荧光二抗购自武汉三鹰公司；PCR引物及测序由上海生工完成。

1.4 实验方法

1.4.1 构建慢病毒表达载体pRRLsin.CMV.MICU1- eGFP 质粒图谱见图1-3。提取大鼠心肌组织总RNA，并检测总RNA纯度及完整性，反转录制备cDNA作为后续PCR目的分子MICU1的模板使用。根据GenBank的大鼠MICU1基因(NM_199412.1)编码区序列(CDS)设计引物调取目的基因序列。按照设计在上下游引物中分别增加SpeⅠ、EcoRⅠ酶切位点序列用于将目的基因插入载体质粒。上游：5’-GAT ACT AGT TCC GAG TTG CTG CTA AAG CTG GA-3'；下游：5’- CCG GAA TTC GGA GGT GGG GTA CTA TTT GGG TA-3’。使用PCR试剂盒以上述cDNA为模板扩增MICU1基因。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用凝胶回收试剂盒回收目的片段，再使用SpeⅠ、EcoRⅠ内切酶进行双酶切并纯化。慢病毒表达载体pRRLsin.CMV.eGFP经SpeⅠ、EcoRⅠ双酶切后回收线性质粒。使用T4 DNA连接酶连接MICU1基因片段和慢病毒表达载体，构建pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP，连接产物转化DH5a感受态细胞，平板抗性培养，随机挑选若干单克隆菌落，提取质粒进行测序分析及SpeⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定。

1.4.2 MICU1基因重组慢病毒的包装与浓缩将293T细胞接种于10 cm培养皿中，用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下培养至细胞80%-90%汇合时转染。转染前2 h，将培养基更换为无血清培养基。按照Lipofectamine 2000试剂Reverse Transfection转染方法，将质粒pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP、pCMVDR8.91、pCMV-VSVG按3︰3︰1共33 μg转染至293T细胞中，对照组加入与实验组等量的Lipofectamine 2000，pRRLsin.CMV.eGFP、pCMVDR8.91、pCMV-VSVG。观察70%以上细胞有绿色荧光蛋白表达(GFP)后，更换培养基，培养至48-72 h收集病毒上清，3 500 r/min离心15 min去除细胞碎片，经0.45 μm滤器过滤，再30 000 r/min，4 ℃离心2 h，浓缩病毒上清，然后以100 μL PBS重悬病毒，分装冻存于-80 ℃备用。

1.4.3 PCR及Western blot检测重组慢病毒MICU1基因及蛋白的表达取2 μL冻存病毒上清煮沸15 min，冰浴15 min，用PCR方法检测重组慢病毒MICU1基因的表达。MICU1上游引物：5’-CGG ACG GGA TGT TTC GTC TTA AC-3’；下游引物：5’-AGA AGC ATC AGC

AGC ATG AAG GC-3’，扩增片段为1 841 bp。PIPA提取转染重组慢病毒后293T细胞蛋白，取50 μg样品，加上样缓冲液，煮沸10 min，12%SDS-PAGE后，半干转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，加入兔抗鼠抗体MICU1(1︰500)，4 ℃过夜，充分洗涤后，加入抗兔荧光二抗(1︰10 000)，室温孵育2 h，TBST充分洗涤后，发光仪发光，以β-actin为内参照。

1.4.4 MICU1基因重组慢病毒的滴度测定第1天，将293T细胞按2×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于24孔板，37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下培养过夜。第2天，将保存于-80 ℃的病毒液37℃水浴融解，用含体积分数为5%胎牛血清的DMEM培养基进行10倍梯度稀释，6孔为1组，从10^-1稀释到10^-6。取细胞已长至60%-70%汇合的孔板进行感染，去掉孔板中的培养基，轻轻颠倒混匀每管慢病毒稀释液，各取500 μL加入每孔细胞中，加入聚酰胺(Polybrene)至终质量浓度8 mg/L，轻摇混匀，37 ℃过夜培养；第3天，去除含慢病毒的培养基，加入1 mL完全培养基；第4，5天时，在荧光显微镜下观察各孔中有绿色荧光蛋白表达细胞，计算病毒滴度^[16-18]。

1.4.5 重组慢病毒感染H9C2心肌细胞用浓缩的重组慢病毒按文献[19-20]方法感染H9C2心肌细胞系和293T细胞，观察有GFP表达的细胞比例。

1.4.6 RT-PCR及Western blot检测感染前后H9C2细胞中MICU1基因及蛋白的表达实验分为3组：MICU1重组慢病毒组、空质粒慢病毒组和未感染组。用Trizol试剂提取3组细胞感染后3 d的总RNA，各取2 μg RNA反转录为cDNA。用RT-PCR方法检测MICU1基因表达，以GAPDH为内参照，确定感染前后H9C2细胞MICU1基因的表达。RIPA提取感染后3 d H9C2细胞蛋白后，Western blot检测3组细胞中MICU1蛋白表达，方法同前。

1.4.7 线粒体内钙水平的检测使用Rhod-2染料按Invitrogen公司的说明染色H9C2细胞后，共聚焦显微镜下观察染色后细胞荧光强度，并使用ImageJ软件进行荧光强度的分析。

1.5 主要观察指标 ①pRRLsin.CMV.MICU1-eGFP慢病毒表达质粒转染293T细胞表达效率；②病毒液感染H9C2细胞后感染效果；③Rhod-2染色后MICU1对线粒体钙摄取的影响。

1.6 统计学分析检测结果数据用GraphPad Prism5进行处理并以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

MICU1又名CBARA1，最早人们在对Ⅰ型变态反应的研究中发现了它的身影^[22]。目前，关于MICU1的研究主要以其结构及生理性功能为主，对其可能介导的线粒体钙摄取调控细胞存活相关研究甚少，仍处于初级阶段。Csordas等^[9]研究发现MICU1促进激动剂刺激的线粒体钙摄取。在上述研究基础上，de la Fuente等^[23]发现在MICU1被敲除的HeLa细胞中，低钙时(Ca²⁺浓度< 2 μmol/L)线粒体的钙摄取能力显著增加，但在高钙时(Ca²⁺浓度> 4 μmol/L)线粒体的钙摄取显著减少，提示在低钙时，MICU1作为门控分子抑制线粒体钙摄取，在激动剂刺激引起的高钙时，MICU1则促进钙摄取。Csordas等研究发现MICU1定位在线粒体内膜的外部，配合孔道MCU行使对钙离子的调控，MICU1在胞浆钙低浓度时可抑制MCU与钙离子的亲和力，但同时也发现MICU1敲除可以抑制激动剂刺激的线粒体钙摄取，并认为细胞缺失MICU1，会使线粒体易损性增强，导致细胞功能的损伤，这些损伤包括压力应激所导致的活性氧生成增多。Hoffman等^[24]研究发现在心血管疾病患者的内皮细胞中MICU1表达降低，而在小鼠体内抑制MICU1可加重血管功能紊乱，提示MICU1可能参与心血管疾病的病理进程。近期有研究发现，MICU1通过调控线粒体钙稳态参与黑色素瘤细胞的生长与凋亡^[25]。Antony等^[26]研究发现，MICU1通过影响线粒体的钙摄取决定组织的生存与再生。最近研究发现，MICU1通过对线粒体钙信号调控参与线粒体内源性凋亡途径进而影响头部鳞状细胞癌的生长与凋亡^[27]。但是，MICU1是否参与了糖尿病心肌线粒体钙稳态调控及其对糖尿病心肌病的发生及机制方面的研究，仍然处在空白阶段。

目前实验中将目的基因导入靶细胞的主要方法包括病毒载体介导感染和真核质粒转染。真核表达质粒的转染存在有效表达时间短，转染效率不稳定，对部分特殊细胞转染效率差等问题。病毒载体介导感染靶细胞的方法具有更好的适应性及稳定性^[28-30]。考虑到第2代三质粒病毒包装系统具有更高的生物安全性这一优点^[31]，实验采用第2代三质粒病毒包装系统进行MICU1重组慢病毒的包装，并拟通过流式细胞术筛选表达绿色荧光蛋白H9C2心肌细胞的方法来提高感染效率。

实验室前期的研究中发现，在H9C2心肌细胞中MICU1的表达降低，因此包装MICU1重组慢病毒上调H9C2心肌细胞中MICU1的表达对后期实验至关重要。在实验中，通过使用第2代病毒包装系统成功包装出MICU1重组慢病毒，并通过荧光显微镜观察，实时定量PCR及Western blot实验对包装的病毒效果进行了验证。MICU1是调节线粒体钙摄取的关键分子，实验通过感染H9C2上调MICU1表达后，采用Rhod-2染色方法观察H9C2心肌细胞线粒体钙水平，提示上调MICU1能明显提高H9C2心肌细胞线粒体钙水平，这一结果与Kevin Foskett等^[21]的结果相一致。MICU1重组慢病毒的成功包装，为进一步构建永生化H9C2心肌细胞系及MICU1对糖尿病心肌病的发生及发展的相关研究提供实验基础。

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