南蛇藤素可抑制肿瘤坏死因子α诱导RAW264.7细胞的炎症及增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.37.012

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
南蛇藤素：南蛇藤是中国民间常用的一种植物药，有驱风除湿，活血解毒消肿功效，主治筋骨疼痛，四肢麻木，风湿性关节炎，腰腿痛，闭经，小儿惊风，痧症，痢疾，肿毒，跌打损伤。南蛇藤素天然存在于卫矛科植物南蛇藤的根，雷公藤的根等植物中，是具有多种生物活性的中药单体成分。
肿瘤坏死因子α：主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应。炎症是多种疾病的一个标志性特征，临床上许多疾病的转归都与肿瘤坏死因子α介导的炎症反应有着密切关系。

摘要
背景：中药南蛇藤具有祛风活血、消肿止痛作用，而其有效单体成分南蛇藤素可能是其主要作用成分之一。
目的：进一步验证南蛇藤素对肿瘤坏死因子α诱导RAW264.7细胞炎症和增殖的作用。
方法：用0，1，10和100 μg/L肿瘤坏死因子α刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型，用0.1，0.5，1.0，2.0 μmol/L的南蛇藤素作用于该模型，ELISA法检测RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2分泌能力，CCK-8比色法检测RAW264.7细胞存活率，硝酸还原酶法检测炎性递质一氧化氮生成，Real-time PCR检测诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1基因mRNA表达水平。
结果与结论：①以0.1、10和100 μg/L肿瘤坏死因子α孵育RAW264.7细胞后，与对照组(0 μg/L)比较，能不同程度促进RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2的分泌，增强一氧化氮的释放，促进细胞增殖并增加诱导型一氧化氮合酶，细胞周期蛋白 D1和细胞周期蛋白E1 的mRNA表达水平(P < 0.05)，其中10 μg/L肿瘤坏死因子α对细胞的作用最强；②0.4 μmol/L南蛇藤素能明显抑制肿瘤坏死因子α诱导的RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2的分泌，降低一氧化氮的释放，抑制细胞增殖并下调诱导型一氧化氮合酶，细胞周期蛋白 D1和细胞周期蛋白E1的mRNA表达水平(P < 0.05)；③结果提示，南蛇藤素能够抑制肿瘤坏死因子α诱导的RAW264. 7细胞的炎症反应和增殖能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2560-8122(陈光福)

关键词: 组织构建, 组织工程, 南蛇藤素, RAW264.7细胞, 肿瘤坏死因子α, 炎症, 炎症因子;增殖, 细胞周期蛋白D1, 细胞周期蛋白E1

Abstract:

BACKGROUND: Celastrol is one of the active components extracted from the traditional Chinese medicine Celastrus orbiculatus characterized by expelling the wind and promoting blood circulation and relieving swelling and pain.
OBJECTIVE: To investigate the effects of celastrol on tumor necrosis factor-α (TNF-α) induced proliferation and inflammatory responses in RAW264.7 cells.
METHODS: In vitro inflammatory cell models induced by TNF-α (0, 1, 10, 100 μg/L) were treated with celastrol (0.1, 0.5, 1.0, 2.0 μmol/L). Interleukin-1β, -6, -8 and prostaglandin E2 in the models were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Cell survival was determined by cell counting kit-8. The inflammatory mediator nitric oxide secretion was detected by nitrate reductase assay. mRNA expressions of inducible nitric oxide synthase, cyclin D1 and cyclin E1 were detected by real-time polymerase chain reaction technique.
RESULTS AND CONCLUSION: Significantly increased secretion of interleukin-1β, -6, -8, prostaglandin E2 and nitric oxide, cell proliferation, and mRNA expressions of inducible nitric oxide synthase, cyclin D1 and cyclin E1 were observed after the induction of TNF-α (0.1, 10, 100 μg/L) compared with the control group (without the induction of TNF-α) (P < 0.05); especially, 10 μg/L of TNF-α exhibited the strongest effects. 0.4 μmol/L celastrol significantly suppressed TNF-α-induced release of interleukin-1β, -6, -8, prostaglandin E2 and nitric oxide, cell proliferation, and mRNA expressions of inducible nitric oxide synthase, cyclin D1 and cyclin E1 in RAW264.7 cells (P < 0. 05). Our results demonstrate that celastrol can inhibit TNF-α-induced inflammatory response and proliferation in RAW264.7 cells.

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Key words: Celastrus, Tumor Necrosis Factor-alpha, Inflammation, Cyclins

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

2.1 南蛇藤素对RAW264.7细胞生长增殖的影响 CCK8法结果表明，当浓度为0.1，0.5 μmol/L时，南蛇藤素对RAW 264.7细胞增殖无明显抑制作用；当南蛇藤素浓度为1.0，2.0 μmol/L时，南蛇藤素对RAW 264.7细胞表现出明显的抑制作用。因此，为避免炎症因子水平的降低是由于南蛇藤素直接的细胞毒作用引起的，实验选取0.5 μmol/L作为实验浓度(图1)。

2.2 南蛇藤素降低肿瘤坏死因子α诱导RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2分泌为了观察RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8分泌，用ELISA检测RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2分泌。用0，1，10和100 μg/L肿瘤坏死因子α作用RAW264.7细胞24 h后，与对照组比较，能不同程度促进RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2分泌，10 μg/L组细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2分泌能力最强，结果均有显著性意义(P < 0.05；图2A)。用0，10 μg/L肿瘤坏死因子α和10 μg/L 肿瘤坏死因子α+南蛇藤素孵育RAW264.7细胞24 h后，与10 μg/L肿瘤坏死因子α组相比，能明显抑制RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2的分泌，差异有显著性意义(P < 0.05；图2B)。

2.3 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子α诱导RAW264.7细胞增殖为了观察细胞增殖的变化，用CCK8检测RAW264.7细胞增殖情况。用肿瘤坏死因子α孵育RAW264.7细胞36 h，0，1，10和100 μg/L肿瘤坏死因子α作用RAW264.7细胞36 h，与对照组比较，能不同程度促进RAW264.7细胞的生长，10 μg/L组细胞增殖能力增强，差异有显著性意义(P < 0.05；图3A)。

用0，10 μg/L 肿瘤坏死因子α和10 μg/L 肿瘤坏死因子α+南蛇藤素孵育RAW264.7细胞36 h，与10 μg/L 肿瘤坏死因子α组相比，能明显抑制RAW264.7细胞的增殖(图3B)。

2.4 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子α诱导的小鼠RAW264.7细胞释放一氧化氮硝酸还原酶法检测炎性递质一氧化氮生成结果显示，用0，1，10和100 μg/L 肿瘤坏死因子α作用RAW264.7细胞24 h后，与对照组比较，能不同程度促进RAW264.7细胞释放一氧化氮， 10 μg/L组细胞释放一氧化氮能力最强，差异有显著性意义(P < 0.05；图4A)。

用0，10 μg/L肿瘤坏死因子α和10 μg/L肿瘤坏死因子α+0.4 μmol/L南蛇藤素孵育RAW264.7细胞24 h后，与10 μg/L肿瘤坏死因子α组相比，能明显抑制RAW 264.7细胞释放一氧化氮，差异有显著性意义(P < 0.05；图4B)。

2.5 南蛇藤素抑制肿瘤坏死因子α诱导RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达为了观察细胞增殖相关基因表达，用Real time PCR检测RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达。用0，1，10和100 μg/L 肿瘤坏死因子α作用RAW264.7细胞24 h后，与对照组比较，能不同程度促进RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达，10 μg/L组细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达最高，差异有显著性意义(P < 0.05；图5A)。

用0，10 μg/L肿瘤坏死因子α和10 μg/L肿瘤坏死因子α+0.4 μmol/L南蛇藤素孵育RAW264.7细胞24 h后，与10 μg/L肿瘤坏死因子α组相比，能明显抑制RAW264.7细胞诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1的mRNA表达，差异有显著性意义(P < 0.05；图5B)。

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引言

炎症是多种疾病的一个标志性特征，与炎症发生发展密切相关的炎症递质主要有白细胞介素1β，6，8和肿瘤坏死因子α等；当免疫系统受到刺激时，巨噬细胞释放各种炎症因子和趋化因子，如白细胞介素1，6，8，前列腺素E2等^[1]，在炎症过程中起着重要的作用。众多的研究表明临床上许多疾病的转归都与肿瘤坏死因子α介导的炎症反应有着密切关系^[2-4]。肿瘤坏死因子α是一种具有多种生物学功能的强效细胞因子，主要由单核细胞、T细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞产生。肿瘤坏死因子α在免疫和炎症反应中是重要的递质，可以调节血管内皮功能，诱生其他细胞因子，诱导细胞的抗病毒活性，刺激骨吸收、血管形成以及成纤维细胞有丝分裂发生等在正常情况下，它具有抗肿瘤、感染和促进组织修复等重要作用，对机体有利^[5]；一旦持续释放，则会扩大炎症级联反应，造成机体发热、休克、恶病质和组织损伤^[6]。因此，抑制肿瘤坏死因子α介导的炎症反应，是许多疾病治疗的一个重要环节。正常水平的肿瘤坏死因子α可以调节免疫应答、抗感染等，但大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤^[7]。一氧化氮既是炎症反应与免疫调节的效应因子，也是关键的调节因子，在炎症级联反应中起着关键的调节作用^[8]。南蛇藤素是从中药南蛇藤中提取的有效单体成，目前研究显示南蛇藤素不仅能够直接杀伤肿瘤细胞^[9]，还具有抗血管生成和氧化抑制的生物活性^[10-12]。 RAW264.7细胞是小鼠巨噬细胞系，一般被应用于炎症反应的研究^[13-14]。目前关于南蛇藤素对炎症因子的调控作用及其机制的研究较少。实验拟探讨肿瘤坏死因子α对RAW264.7细胞炎症反应与增殖的影响，在此基础上，观察南蛇藤素是否可以抑制肿瘤坏死因子α诱导的小鼠RAW264.7细胞的炎症反应和增殖。

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材料方法

1.1 设计南蛇藤素抗炎作用机制研究。

1.2 时间及地点实验于2014年5月至2015年5月在中山大学附属第一医院外科实验室完成。

1.3 材料

细胞：RAW264.7细胞购自武汉大学细胞保藏中心。

南蛇藤素抑制炎症实验用主要试剂：
试剂	来源
cck-8	同仁公司
胎牛血清	Gibco公司
DMEM培养液、TRIzol Reagent RNA提取试剂	美国Invitrogen公司
DNA Marker、反转录试剂盒	日本TaKaRa公司
PCR 试剂盒	加拿大Fermentas公司
ELISA 试剂盒	美国R＆D 公司

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 RAW264.7细胞用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养传代，于37 ℃、体积分数5%CO₂条件培养，取对数生长期细胞进行实验。拟用0.1，0.5，1.0，2.0 μmol/L南蛇藤素作用RAW264.7细胞，筛选出对细胞活性无明显影响的理想作用浓度后，用0，1，10和100 μg/L肿瘤坏死因子α和或理想浓度的南蛇藤素作用于RAW264.7细胞，并进行下一步检测。

1.4.2 ELISA检测RAW264.7细胞上清液白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2分泌方法参照文献报道^[15]，用含有用0，1，10和100 μg/L肿瘤坏死因子α和或 0.4 μmol/L南蛇藤素作用RAW264.7细胞12 h后，胰酶消化细胞，以1×10⁴/孔接种于96孔板，体积分数1%血清的DMEM培养液培养48 h后，收集上清液，4 ℃离心，ELISA检测RAW264.7细胞上清液白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2分泌情况。

1.4.3 细胞存活率的检测方法参照文献报道^[16]，取对数生长期细胞，以5 000个/孔接种于96孔板，37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养过夜待细胞贴壁，用含有不同处理因素的培养基培养细胞12 h，胰酶消化细胞，以1×10⁴/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，36 h后检测细胞存活率。处理结束后加入CCK-8(每孔100 µL加 10 µL CCK-8)，轻摇，37 ℃孵育4 h，然后用酶联免疫检测仪测定每孔在450 nm波长处的吸光度。取5孔吸光度值的平均值，按公式计算各组细胞存活率，实验重复3次。以0 μg/L肿瘤坏死因子α组为对照组，存活率为100%。

存活率(%)=(实验组吸光度-空白对照组吸光度)/ (正常对照组吸光度-空白对照组吸光度)×100%。

1.4.4 硝酸还原酶法检测上清液中炎性递质一氧化氮水平方法参照文献报道^[17]，取对数生长期细胞，以 5 000个/孔接种于96孔板，37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养过夜待细胞贴壁，用含有不同处理因素的培养基培养细胞12 h，胰酶消化细胞，以1×10⁴/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，36 h后用一氧化氮试剂盒检测上清液中一氧化氮释放量，按试剂盒说明书进行操作。

1.4.5 实时PCR检测细胞中诱导型一氧化氮合酶、Cyclin D1和Cyclin E1 mRNA的表达水平方法参照文献报道^[18]，取对数生长期细胞，37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养过夜待细胞贴壁，用含有不同处理因素的培养基培养细胞12 h后，提取总RNA。以cDNA为模板，用PCR检测目标基因mRNA的表达水平。引物序列：诱导型一氧化氮合酶上游5’-GCC CTG CTT TGT GCG AAG-3’，下游5’-GCC CTT TGT GCT GGG AGT C-3’；Cyclin D1上游引物5’-ATT TCC AAC CCA CCC TCC AT-3’，下游引物5’-GGC TTC AAT CTG TTC CTG GC-3’；Cyclin E1上游引物5’-AGC CTC GGA AAA TCA GAC CA-3’，下游引物5’-CTT CGC ACA CCT CCA TTA GC-3’。

1.5 主要观察指标 ELISA法检测肿瘤坏死因子α刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2分泌能力，CCK-8比色法法检测RAW264.7细胞存活率，硝酸还原酶法检测炎性递质一氧化氮生成， Real-time PCR检测诱导型一氧化氮合酶，cyclin D1和cyclin E1基因mRNA表达水平。

1.6 统计学分析实验数据采用x(_)±s表示，用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，采用单因素方差分析或t 检验，以P < 0.05认为差异有显著性意义。

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讨论

炎症反应作为众多疾病的一个早期反应，在疾病的发生发展中占有着重要的位置，而巨噬细胞则是调节炎性疾病的一个靶细胞，当机体受到外来刺激的时候，巨噬细胞会发生活化，继而分泌大量的炎症递质，促进炎症的发生发展^[19]。白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2等炎症因子常作为炎症因子的检测指标^[20-26]，在多种疾病中表达上调，如骨性关节炎^[27-29]，类风湿关节炎^[30-35]，强直性脊柱炎^[36-38]。作者此次实验发现，肿瘤坏死因子α刺激细胞后，白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2等炎症因子的表达明显上调，在应用南蛇藤素后，可以抑制肿瘤坏死因子α诱导的RAW264.7细胞白细胞介素1β，6，8和前列腺素E2等炎症因子的表达，说明南蛇藤素通过抑制炎性细胞因子参与了抑制炎症反应的过程。

一氧化氮是一种简单却不稳定的自由基，参与多种生理和病理过程。在体内一氧化氮是由一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生。诱导型一氧化氮合酶主要是在炎症和免疫刺激下表达，进而催化一氧化氮持续生成，过量的一氧化氮则会促进炎症性疾病的发生和发展，并可作为一种炎症的观察指标^[39-42]。

此次实验发现，在不同处理情况下，南蛇藤素对肿瘤坏死因子α活化的RAW264.7细胞分泌一氧化氮和细胞诱导型一氧化氮合酶mRNA表达有一定的抑制作用，这提示南蛇藤素可以通过抑制肿瘤坏死因子α激活的巨噬细胞分泌一氧化氮来发挥抗炎作用。

此次实验结果显示，南蛇藤素可以抑制肿瘤坏死因子α诱导的RAW264.7细胞增殖，通过抑制RAW264.7细胞 Cyclin D1，Cyclin E1表达可能是其发挥作用的主要途径。Cyclin D1和Cyclin E1 都属于G₁期周期蛋白，如果Cyclin D1表达在G₁期受到抑制，细胞将不能进入S期；Cyclin E1也在细胞由G₁期进入S期过程中发挥作用^[43-46]。因此，Cyclin D1，Cyclin E1表达受到抑制后，会阻碍细胞的分裂增殖，从而减少RAW264.7细胞的活化，减少炎症反应。南蛇藤素下调Cyclin D1，Cyclin E1的表达，使得RAW264.7细胞的增殖受到抑制，可能是其发挥抗炎作用的途径。

中国许多的传统中药都具有抗炎、抗免疫作用，这些中药单体大都能通过影响细胞分泌炎症因子来减轻炎症反应，从而起到改善疾病的作用。许多具有抗炎作用的中药单体其抗炎作用机制也不是很清楚，所以需要进一步的研究探索，进而更明确地阐述中药发挥其抗炎作用的机制，为临床应用提供科学的依据。

综上所述，南蛇藤素对肿瘤坏死因子α刺激的RAW264. 7细胞炎症和增殖具有一定的抑制作用，其作用机制可能与南蛇藤素能够调控炎性因子表达，抑制一氧化氮的释放、降低诱导型一氧化氮合酶、Cyclin D1和Cyclin E1的表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程