补肾健脾活血方含药血清提高过表达Sost转染成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0275

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (16): 2461-2466.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0275

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补肾健脾活血方含药血清提高过表达Sost转染成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性

万雷1，黄宏兴1，黄红2，王凡3，柴爽4，王吉利4，刘少津4，黄佳纯4

Wan Lei1, Huang Hong-xing1, Huang Hong2, Wang Fan3, Chai Shuang4, Wang Ji-li4, Liu Shao-jin4, Huang Jia-chun4

收稿日期:2018-03-16 出版日期:2018-06-08 发布日期:2018-06-08
作者简介:万雷，男，1979年生，河南省商水县人，汉族，2011年广州中医药大学毕业，博士，副主任中医师，主要从事骨质疏松症的防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金课题(81673786，81302991)；广东省自然科学基金课题(S2013040016828)；广东省科技计划项目(2016A020216024)

Bushen Jianpi Huoxue decoction increases the proliferation of Sost-overexpressed adenovirus transfected osteoblasts and alkaline phosphatase activity

1广州中医药大学附属骨伤科医院，广东省广州市 510240；2广州中医药大学，广东省广州市 510405；3湖南省中医院，湖南省长沙市 410005；4广州中医药大学研究生院，广东省广州市 510405

1the Affiliated Orthopedics Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China; 2Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 3Hunan Provincial Hospital of Chinese Medicine, Changsha 410005, Hunan Province, China; 4Graduate School of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Received:2018-03-16 Online:2018-06-08 Published:2018-06-08
About author:Wan Lei, M.D., Associate chief physician, the Affiliated Orthopedics Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81673786 and 81302991; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2013040016828; the Science and Technology Program of Guangdong Province, No. 2016A020216024

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Sost：是骨硬化蛋白(Sclerostin)编码基因，也是Wnt信号通路中的关键拮抗因子，能竞争性地与低密度脂蛋白LRP5/6相结合，抑制Wnt信号通路的传导作用，影响成骨细胞的分化和增殖。
骨形成：是一个由多种因素调节的复杂过程，在这个过程中，激素与生长因子调节既相对独立又相互联系。LRP 5：是一种存在于成骨细胞表面的膜蛋白，其表达改变和功能丢失，可降低体外培养鼠头盖骨骨质密度，使骨质厚度变薄。

摘要
背景：有研究发现中药可以通过Wnt/β-catenin 信号通路影响成骨细胞，而Sost是Wnt信号通路的抑制因子和骨形成中的抑制蛋白，也是一种调控骨分化的拮抗因子，可调控成骨细胞的分化和增殖。补肾健脾活血方是广州中医药大学附属骨伤科医院临床防治骨质疏松症的经验方，对骨形成有促进作用，治疗骨质疏松症疗效显著。
目的：应用补肾健脾活血方含药血清干预过表达骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)重组腺病毒转染的成骨细胞，观察其对细胞增殖、碱性磷酸酶活性和相关蛋白的影响。
方法：将培养好的成骨细胞分为空白对照组、过表达Sost组(Ad-Sost组)2组，空白对照组给予空载腺病毒转染，Ad-Sost组予过表达Sost重组腺病毒转染，两组分别给予空白血清和含药血清干预，采用CCK-8检测细胞增殖、碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性，Western Blot检测骨调节蛋白表达情况。
结果与结论：①与空白血清干预比较，两组含药血清在24，48，72 h均可以提高细胞活性(P均< 0.01)；②与空白血清干预比较，两组含药血清均可以提高碱性磷酸酶活性(P < 0.01)；③与空白血清干预比较，空白对照组含药血清可以降低低密度脂蛋白受体相关蛋白5、骨保护蛋白的表达(P均< 0.01)，对骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α蛋白的表达无明显影响，Ad-Sost组含药血清也可以降低低密度脂蛋白受体相关蛋白5、骨保护蛋白、骨桥蛋白蛋白的表达(P均< 0.01)，提高肿瘤坏死因子α蛋白的表达(P < 0.01)；④结果说明，补肾健脾活血方含药血清可以提高过表达Sost转染成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性，影响低密度脂蛋白受体相关蛋白5、骨保护蛋白、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子α蛋白的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-3876-5506(万雷)

关键词: 骨质疏松, Sost, 过表达基因, 细胞实验, 补肾健脾活血方

Abstract:

BACKGROUND: Chinese herbs have been shown to affect osteoblasts through Wnt/β-catenin signaling pathway. Sclerostin (Sost) is an inhibitor of Wnt signaling pathway and an inhibitor of osteogenesis, and it is also an antagonistic factor that regulates the differentiation and proliferation of osteoblasts. Bushen Jianpi Huoxue decoction (BJHD) is the empirical formula in the prevention and treatment of osteoporosis at the Affiliated Orthopedics Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine. BJHD can promote osteogenesis and effectively treat osteoporosis.
OBJECTIVE: To observe the effect of BJHD on the cell proliferation, alkaline phosphatase activity and expression levels of related proteins in Sost-overexpressed adenovirus transfected osteoblasts.
METHODS: The osteoblasts were divided into two groups: blank control group (empty adenovirus transfection) and Sost overexpressed group (Sost overexpression and adenovirus transfection). Two groups were cultured with blank serum and medicine serum. The cell proliferation was tested by cell counting kit-8 assay, and alkaline phosphatase activity was tested by alkaline phosphatase kit. Expression levels of bone regulation-related proteins were tested by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank serum, medicine serum could increase the cell viability at 24, 48 and 72 hours in both groups (P < 0.01). Compared with the blank serum, medicine serum increased the alkaline phosphatase activity (P < 0.01). Compared with the blank serum, medicine serum in the blank control group decreased the expression of low-density lipoprotein receptor-related protein 5 and osteoprotegerin (P < 0.01), but showed no effect on the expression of osteopontin and tumor necrosis factor α. Medicine serum in the Sost-overexpressed group decreased the expression of low-density lipoprotein receptor-related protein 5, osteoprotegerin and osteopontin, increased the expression of tumor necrosis factor α (P < 0.01). These results indicate that BJHD can increase the proliferation of recombinant adenovirus transfected Sost-overexpressed osteoblasts and alkaline phosphatase activity, and regulate the expression of low-density lipoprotein receptor-related protein 5, osteoprotegerin, osteopontin, and tumor necrosis factor α.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoporosis, Osteoprotegerin, Drugs,Chinese Herbal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

万雷，黄宏兴，黄红，王凡，柴爽，王吉利，刘少津，黄佳纯. 补肾健脾活血方含药血清提高过表达Sost转染成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(16): 2461-2466.

Wan Lei1, Huang Hong-xing1, Huang Hong2, Wang Fan3, Chai Shuang4, Wang Ji-li4, Liu Shao-jin4, Huang Jia-chun4. Bushen Jianpi Huoxue decoction increases the proliferation of Sost-overexpressed adenovirus transfected osteoblasts and alkaline phosphatase activity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(16): 2461-2466.

图/表（结果） 3

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引言

骨质疏松症是一种以骨量低、骨微结构损坏、骨脆性增加、易发生骨折为特征的骨代谢疾病。中国40岁以上人群骨质疏松症发病率24.62%，约1.4亿人罹患该病，男性与女性每10年骨质疏松症的增长率分别约为15%和20%^[1]，骨质疏松症可发生于任何年龄，但多见于绝经后女性和老年男性。随着骨质疏松的发展，可造成骨骼持续疼痛、腰背畸形和脊柱变形，严重者发生骨折(脆性骨折)。其发病与多种因素有关，如遗传因素、环境因素、生活方式等均可导致骨形成和骨破坏之间平衡失调，进而诱发骨质疏松^[2]。

人体骨骼的代谢是随着骨吸收和骨重建之间动态平衡而变化的，从细胞学上讲，骨质疏松的主要原因是成骨细胞活性降低，破骨细胞活性升高。在骨代谢和骨形成过程中，成骨细胞发挥了最主要的作用，能够维持正常的成年骨骼系统^[3]。

Wnt信号通路是参与骨代谢的一个重要细胞内信号通路^[4]，而骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)是Wnt信号通路的抑制因子，Sost是骨形成中的抑制蛋白，也是一种调控骨分化的拮抗因子，在成熟的骨骼细胞中有特异性表达、可调控成骨细胞的分化和增殖^[5]，被视为骨相关疾病如骨质疏松、骨修复的治疗靶点^[6]。有研究发现补肾活血含药血清能够激活经典 Wnt/β-catenin信号通路，且可以明显促进成骨细胞的分化增殖及提高矿化功能^[7]；彭昕等^[8]研究表明壮骨止痛方可通过上调 Wnt3a、β-catenin蛋白调控Wnt/β-catenin 信号通路，提示中药可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞。

祖国医学认为骨质疏松症的发生主要与肾虚、脾虚、血瘀有关，其中肾虚是本病的主要病因，脾虚是本病的重要病因，血瘀是该病的病理产物也是致病原因^[9]。补肾健脾活血方是广州中医药大学附属骨伤科医院临床防治骨质疏松症的经验方，课题组前期研究证实其临床疗效显著^[10-11]，还能明显地提高成骨细胞活性和碱性磷酸酶的活性，提高钙离子浓度，可能通过调控Wnt信号通路抑制因子DKK1进而影响成骨细胞的代谢^[12]。因此为了研究补肾健脾活血方是否能通过调控Sost进而影响成骨细胞的代谢，故开展此次研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计分组对照细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年4月在广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选用6月龄SPF级健康雌性未孕SD大鼠16只，体质量240-260 g，南方医科大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：SCXK(粤)2011-0015。

1.3.2 实验药物补肾健脾活血方由补骨脂、制淫羊藿、黄芪、丹参等10味中药组成，其提取物中含生药量为 1 430 g/L，由广州中医药大学附属骨伤科医院制剂室提供。

1.3.3 实验用试剂和仪器 DMEM高糖培养基、FBS、胰酶(美国Gibco公司)，CCK8(中国同仁化学公司)，BCA蛋白定量试剂盒(中国弗德生物公司)，EGTA、Triton(美国Sigma公司)，脱脂奶粉(美国BD公司)，PVDF膜(美国Millipore公司)，抗骨硬化蛋白(Sost)抗体、抗骨保护蛋白(OPG)抗体、抗骨桥蛋白(OPN)抗体、抗肿瘤坏死因子(TNF)α抗体(美国Abcam)、抗低密度脂蛋白受体相关蛋白 (low density lipoprotein nreceptor-related protein，LRP)5抗体(美国Santa)，细胞培养箱、离心机(美国Thermo Fisher公司)，流式细胞仪(美国BD公司)，超净操作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.3.4 腺病毒和细胞实验所用腺病毒均来自课题组前期实验所构建包装的病毒，具体方法见前期研究基础^[13]；人成骨肉瘤细胞(MG63) 由中国科学院上海细胞所细胞库提供。

1.4 方法

1.4.1 含药血清制备实验大鼠随机分为生理盐水组和补肾健脾活血方中剂量组(4.8 g/kg)，每组8只。每天2次灌胃给药，连续灌胃3 d，最后一次灌胃后2 h进行腹主动脉取血，静置1 h，3 000 r/min，20 min离心取血清，灭活除菌后，放置-20 ℃冰箱。

1.4.2 细胞培养 MG63细胞培养于含体积分数为10%的FBS的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃，体积分数5%CO₂潮湿空气的培养箱中培养。每2-4 d换液1次，待细胞生长至80%-95%融合时进行细胞传代。弃旧液，加入2 mL 0.25%胰酶消化液，等细胞变圆上浮后，再加入4 mL培养液终止消化，然后移至无菌离心管中，在1 000 r/min条件下离心 4 min，弃上清，以1∶4-1∶6比例移至新培养瓶中培养。

1.4.3 细胞转染分别用空白血清或含药血清的培养基悬浮细胞，种块，分为空白对照组+空白血清、空白对照组+含药血清、过表达Sost组+空白血清(Ad-Sost组+空白血清)、过表达Sost组+含药血清(Ad-Sost组+含药血清)组，病毒干预过夜，更换空白血清或含药血清培养基。

1.4.4 CCK-8检测细胞增殖收集对数期细胞，分别用空白血清和含药血清重悬细胞，接种96孔板，每孔细胞数5×10⁴个/孔，分别培养0，24，48，72 h，换成100 μL含10% CCK-8的培养基，孵育1.5 h后，酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度(A)值。

1.4.5 碱性磷酸酶活性检测收集提取总蛋白，BCA定量检测蛋白浓度，使用碱性磷酸酶活性检测试剂盒，双蒸水、0.1 g/L酚标准应用液、样品、缓冲液、基质液、孵育箱中孵育15 min，加入显色剂，酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度(A)值。

1.4.6 Western Blot检测LRP5、骨保护蛋白、骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α表达细胞转染72-96 h后，分别提取细胞总蛋白，BCA检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为1 g/L，煮蛋白变性，取20 μL蛋白样品于电泳槽中电泳，电转蛋白至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入各蛋白一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后加入脱脂牛奶标记的二抗，室温孵育后洗涤3次，化学发光显色后，Image J软件分析目标带的光密度值。

1.5 主要观察指标细胞增殖；碱性磷酸酶活性；LRP 5、骨保护蛋白、骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α蛋白表达。

1.6 统计学分析测定结果采用SPSS 20.0统计软件分析，实验数据用x(_)±s表示，采用单因素方差分析进行两组间比较，P < 0.05视为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

目前骨质疏松症的治疗方法很多，但疗效并不理想，抗骨质疏松治疗以抑制骨吸收为主，而调控成骨细胞促进骨形成成为新的研究方向。祖国医学在骨质疏松症防治方面疗效确切，具有明显的优势，但其具体作用机制仍未阐明。骨质疏松症属于中医“骨痿”范畴，其病位主要在肾、脾、经络，病机主要与肾虚、脾虚和血瘀有关，以肾虚为主^[9]，针对上述基本病机，广州中医药大学附属骨伤科医院骨质疏松课题组提出了补肾、健脾、活血的治疗原则，并组成了补肾健脾活血方治疗骨质疏松，该方由右归饮和苁蓉汤化裁而来，补骨脂性温补肾壮骨为君，淫羊藿、肉苁蓉、菟丝子补肾为臣，佐黄芪补中益气，熟地、白芍滋阴益精，丹参、当归活血，大枣调中和胃为使。该方具有补肾壮骨、健脾益气、活血通络的作用，可以明显缓解骨质疏松患者疼痛等临床症状^[10-11]。

由Sost基因编码的骨硬化蛋白是一种分泌型糖蛋白，属于胱氨酸结构超家族的一员^[14]，特异性地表达于成骨细胞或骨细胞中，通过作用于成骨细胞而在骨代谢中发挥重要作用。单克隆抗体抑制Sost蛋白的表达可增加骨的形成和促进骨折愈合。Sost与成骨细胞表面的LRP5/6和Frizzled共同受体结合，抑制Wnt/β-catenin 信号传递^[15]，敲除Sost基因的小鼠在骨形成、骨密度和骨强度方面均有所增加^[16]；在啮齿类和灵长类动物中Sost也影响骨密度和骨强度的变化^[17-18]。Shah等^[19]研究发现Sost主要通过抑制Wnt/β-catain经典信号通路来抑制成骨细胞的活性。Sost拮抗剂在临床研究中发现可以提高腰椎骨密度，降低骨折风险^[20-21]。作者前期研究发现过表达Sost重组腺病毒转染具有人成骨细胞表型特征的MG63细胞后可降低其细胞增殖和碱性磷酸酶活性^[13]，提高钙离子浓度，对骨调节蛋白也有一定影响作用。抑制MG63细胞Sost的表达，能上调具有骨形成和双向调节作用的骨代谢调节相关蛋白表达水平、下调具有骨吸收作用的骨代谢调节相关蛋白表达水平^[22]。

为了研究补肾健脾活血方是否通过调控Sost进而影响成骨细胞的代谢，作者在前期过表达Sost转染的MG63细胞模型上进行干预研究，结果发现含药血清干预可以提高成骨细胞的活性，在过表达Sost重组腺病毒转染细胞导致细胞活性下降后，含药血清可以在培养24，48和72 h升高细胞活性，尤其在48 h时含药血清升高细胞活性的作用最强。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期特异性指标，也是矿化的先决条件，其含量的变化可预示骨细胞增殖程度^[23]，含药血清可提高细胞的碱性磷酸酶活性，也能升高因过表达Sost重组腺病毒转染细胞而降低的碱性磷酸酶活性。这说明补肾健脾活血方含药血清在一定程度上可抑制因过表达Sost重组腺病毒转染所造成的细胞增殖能力和碱性磷酸酶活性降低，促进细胞增殖和碱性磷酸酶活性的升高，有助于促进成骨细胞分化。

骨形成是一个由多种因素调节的复杂过程，在这个过程中，激素与生长因子调节既相对独立又相互联系^[24]。LRP 5是一种存在于成骨细胞表面的膜蛋白，其表达改变和功能丢失，可降低体外培养鼠头盖骨骨质密度，使骨质厚度变薄^[25]。

骨保护蛋白是肿瘤坏死因子受体家族成员，有抑制破骨细胞形成和活化的功能^[26]。骨桥蛋白是一种分泌型糖蛋白，在骨基质矿化、吸收及骨重塑等过程中发挥着重要作用，是介导骨组织细胞与骨基质间的桥梁^[27]，在细胞黏附和基质矿化中调节晶体的大小^[28]。肿瘤坏死因子α是一种促炎细胞因子，不仅增加破骨细胞前体细胞数量，还可增加破骨细胞介导的骨吸收，对成骨细胞功能也有影响^[29-31]。本实验对过表达Sost重组腺病毒转染MG63细胞给予补肾健脾活血方含药血清干预后，发现含药血清下调LRP 5、骨保护蛋白、骨桥蛋白的蛋白表达，上调肿瘤坏死因子α的蛋白表达，有抑制骨形成和促进骨吸收的趋势，这与作者的研究预想不太一致。可能的原因是补肾健脾活血方是复方制剂，可能存在多种药物联合作用和多靶点协同作用，结合前期研究发现该方中含有类性激素样作用和抗氧化作用的物质^[11^，^32]，作者认为其可能通过其他未知的作用途径调控LRP 5、骨保护蛋白、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子α表达而发挥影响骨重建的作用。

综上所述，补肾健脾活血方含药血清可提高成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性，影响LRP 5、骨保护蛋白、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子α的蛋白表达，尤其在过表达Sost重组腺病毒转染细胞后，仍可促进细胞的增殖、分化，并影响上述蛋白的表达，表明该方可能具有调控Sost的作用。但此次研究中含药血清和空白血清都提高了细胞增殖和碱性磷酸酶活性，影响LRP 5、骨保护蛋白、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子α的蛋白表达，提示补肾健脾活血方可能还存在其他影响成骨细胞活性的未知作用机制，有待进一步的研究探讨。

研究的局限性在于选用含药血清进行干预，以药物代谢来寻找入血成分是中药复方药效的主要研究方法^[33-34]，常受到给药方案、给药剂量、采血方法和时间点、机体的生理状态和病理状态等限制，所确定的成分是否是药效的代表性成分仍需深入发掘。但此次研究的主要意义是从补肾、健脾、活血角度探讨中医药防治骨质疏松症的作用机制，突出体现了中医整体观念，辨证论治的思想，显示出中医药在治疗骨质疏松症方面的独特优势^[35-36]。以Wnt/β-catenin 信号通路的拮抗因子Sost为靶基因检测成骨细胞的活性和骨形成相关蛋白的表达，是目前研究抗骨质疏松症的发展趋势，有利于深入探讨中药防治骨质疏松症的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补肾健脾活血方含药血清提高过表达Sost转染成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性

Bushen Jianpi Huoxue decoction increases the proliferation of Sost-overexpressed adenovirus transfected osteoblasts and alkaline phosphatase activity

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