慢病毒载体介导CC趋化因子受体7基因过表达可促进大鼠骨髓间充质干细胞归巢

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1789

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (25): 3973-3977.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1789

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慢病毒载体介导CC趋化因子受体7基因过表达可促进大鼠骨髓间充质干细胞归巢

王志红，陈为民，林芸，尚晋，魏天南

福建省立医院血液科，福建医科大学省立临床医学院，福建省福州市 350001

修回日期:2019-04-17 出版日期:2019-09-08 发布日期:2019-09-08
通讯作者: 陈为民，主任医师，福建省立医院血液科，福建医科大学省立临床医学院，福建省福州市 350001
作者简介:王志红，女，1980 年生，河北省邯郸市人，汉族，2011年南方医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事多能干细胞的应用研究。
基金资助:
福建省卫生计生中青年骨干人才培养项目(2016-ZQN-4)，项目负责人：王志红；福建省科技创新联合基金项目(2017Y9068)，项目负责人：王志红

Lentiviral vector-mediated over-expression of CC chemokine receptor 7 promotes homing of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Wang Zhihong, Chen Weimin, Lin Yun, Shang Jin, Wei Tiannan

Department of Hematology, Fujian Provincial Hospital, Clinical School of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China

Revised:2019-04-17 Online:2019-09-08 Published:2019-09-08
Contact: Chen Weimin, Chief physician, Department of Hematology, Fujian Provincial Hospital, Clinical School of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
About author:Wang Zhihong, MD, Associate chief physician, Department of Hematology, Fujian Provincial Hospital, Clinical School of Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China
Supported by:
the Young & Middle-Aged Backbone Talent Training Project of Fujian Provincial Health and Family Planning Commission, No. 2016-ZQN-4 (to WZH); Science and Technology Innovation Foundation of Fujian Province, No. 2017Y9068 (to WZH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
归巢：1983年Gallatin等在《自然》杂志上首次报道血源性淋巴细胞能选择性进入二级淋巴器官，这个过程用“归巢”进行了定义。近年来，随着干细胞疗法的兴起，归巢被引申至对多种干细胞的描述。所谓间充质干细胞归巢，是指自体或外源性间充质干细胞在多种因素的作用下定向趋向性迁移至靶器官并定植的过程。
SLC/CCR7信号通路：次级淋巴组织趋化因子(SLC)与细胞的迁移归巢有关，其受体CC趋化因子受体7(CCR7)是一类具有促进归巢功能的趋化因子受体，间充质干细胞特异性表达CCR7，而SLC/CCR7信号通路对间充质干细胞的归巢具有重要作用。

摘要
背景：研究发现，骨髓间充质干细胞特异性地表达CC趋化因子受体7(CC chemokine receptor，CCR7)，与其配体次级淋巴组织趋化因子(secondary lymphoid-tissue chemokine，SLC)相互作用，有助于骨髓间充质干细胞归巢到损伤部位。
目的：探讨CCR7基因过表达对大鼠骨髓间充质干细胞体内外归巢特性的影响。
方法：利用慢病毒载体介导大鼠骨髓间充质干细胞过表达CCR7基因，建立过表达CCR7的骨髓间充质干细胞。通过Transwell实验体外检测趋化因子SLC对过表达CCR7的骨髓间充质干细胞体外定向迁移的影响。将SD大鼠分为4组，每组动物10 只：①对照组：未接受全身照射大鼠作为对照组；②照射组：大鼠接受全身照射(⁶⁰Co单次全身照射，总剂量为7.5 Gy，照射量率为0.75 Gy/min)，输注生理盐水1 mL；③BMSCs-GFP组：大鼠经全身照射后，输注GFP标记的骨髓间充质干细胞悬液1 mL (含细胞5×10⁵个)；④CCR7-BMSCs-GFP组：大鼠经全身照射后，输注携带GFP和CCR7基因的骨髓间充质干细胞1 mL (含细胞5×10⁵个)。移植24 h后取大鼠脾脏做冰冻切片，荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞归巢情况，流式细胞技术检测骨髓间充质干细胞在脾脏的归巢率。ELISA方法检测照射后大鼠外周血中SLC水平。
结果与结论：①Transwell实验结果表明，过表达CCR7可促进骨髓间充质干细胞向趋化因子SLC迁移募集；②冰冻切片结果显示，过表达CCR7可明显提高骨髓间充质干细胞归巢至损伤脾脏的效率；③流式细胞术测定过表达CCR7的骨髓间充质干细胞归巢至脾脏数量明显高于BMSCs-GFP组(P < 0.05)；④ELISA结果显示，照射24 h后大鼠外周血中SLC水平明显升高；⑤结果表明，CCR7及其配体SLC对骨髓间充质干细胞的归巢有促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2225-3100(王志红)

关键词: SLC/CCR7, 骨髓, 间充质干细胞, 过表达CCR7基因, 干细胞移植, 细胞归巢, 脾脏

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells specifically express CC chemokine receptor 7 (CCR7). The interaction between secondary lymphoid-tissue chemokine and CCR7 contributes to the homing of bone marrow mesenchymal stem cells to the injured site.

OBJECTIVE: To explore the effects of CCR7 gene over-expression on the homing capacity of bone marrow mesenchymal stem cells in vivo.

METHODS: Rat bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing CCR7 were constructed by lentiviral vector. We conducted a Transwell experiment to detect the effect of secondary lymphoid-tissue chemokine on the directional migration of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Sprague-Dawley rats were divided into four groups (n=10/group): (1) Control group: non-irradiated rats were used as control group; (2) radiation group in which the rats were exposed to total body irradiation (⁶⁰Co, 0.75 Gy/min, 7.5 Gy in total), and then were infused with 1 mL of normal saline; (3) BMSCs-GFP group in which the rats were infused with bone marrow mesenchymal stem cell suspension (1 mL, 5×10⁵ cells) transfected by GFP via the tail vein after total body irradiation; (4) CCR7-BMSCs-GFP group in which the rats were infused with bone marrow mesenchymal stem cells (1 mL, 5×10⁵ cells) simultaneously carrying GFP and CCR7 gene via the tail vein after total body irradiation. The rats were sacrificed at 24 hours after infusion, and the frozen sections of the spleen were prepared to detect the distribution of infused cells. Furthermore, the homing rate of bone marrow mesenchymal stem cells to the rat spleen was detected by flow cytometry. The level of secondary lymphoid-tissue chemokine was detected by ELISA.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Results of the Transwell experiment showed that CCR7 over-expression gene promoted the directional migration of bone marrow mesenchymal stem cells to secondary lymphoid-tissue chemokine. (2) The CCR7 over-expression could significantly enhance the homing rate of bone marrow mesenchymal stem cells into the spleen. (3) Flow cytometry results slowed that the number of bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing CCR7 homing into the spleen was significantly higher than that in the BMSCs-GFP group (P < 0.05). (4) ELISA results showed that the level of secondary lymphoid-tissue chemokine in the peripheral blood after 24 hours of irradiation significantly increased (P < 0.05). These findings indicate that the over-expression of CCR7 gene mediated by lentiviral vector can promote the homing of bone marrow mesenchymal stem cells into the spleen.

Key words: SLC/CCR7, bone marrow, mesenchymal stem cells, overexpression of CCR7 gene, stem cell transplantation, cell homing, spleen

中图分类号:

王志红，陈为民，林芸，尚晋，魏天南. 慢病毒载体介导CC趋化因子受体7基因过表达可促进大鼠骨髓间充质干细胞归巢[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 3973-3977.

Wang Zhihong, Chen Weimin, Lin Yun, Shang Jin, Wei Tiannan.

Lentiviral vector-mediated over-expression of CC chemokine receptor 7 promotes homing of rat bone marrow mesenchymal stem cells

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(25): 3973-3977.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞体外实验和随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 2016年11月至2018年6月在福建省立医院中心实验室与动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康SPF级雌性SD大鼠60只(用于细胞分离培养20只，用于动物体内实验40只)，6-8周龄，体质量160-180 g，均购自福建医科大学动物实验中心(动物编号：SYXK闽2012-001)。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学规定。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；荧光直标的CD29、CD34、CD44、CD45单克隆抗体(美国e-BIOSCIENCE公司)；GFP慢病毒载体菌种、CCR7慢病毒颗粒包装试剂(上海吉凯基因化学技术有限公司)；流式细胞仪(美国Bection Dickinson公司)；显微照相机和倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；酶标仪(美国BIO-TEK公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 BMSCs的培养、鉴定 腹腔注射麻醉SD大鼠，无菌条件下分离出双侧股骨，暴露骨髓腔，PBS冲洗骨髓腔至无色，收集冲洗液，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，置37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养，光镜下观察细胞生长情况。原代细胞生长至汇合度达80%以上，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化进行传代。

取生长良好的第3代BMSCs，胰酶消化后，用PBS调整细胞数为2×10⁵个，制成4组样本，分别加入荧光标记单克隆抗体(mAb)CD29-FITC、CD34-PE、CD44-PE、CD45-FITC，应用流式细胞术检测细胞表面抗原表达。用大鼠IgG1-FITC和IgG1-PE作为同型抗体对照。

1.4.2 重组慢病毒载体构建及过表达CCR7-BMSCs的制备 按照文献[16]中的具体操作步骤，利用分子克隆技术进行GFP慢病毒的包装，建立BMSCs-GFP细胞；并构建自身失活型重组慢病毒载体pMSCV-CCR7-IRES-GFP，包装病毒后感染BMSCs，建立稳定表达目的基因CCR7的BMSCs，即CCR7-BMSCs-GFP细胞。

采用流式细胞技术检测转染后BMSCs表达GFP的阳性率，对照组为正常BMSCs。收集经过筛选获得的稳定表达CCR7的BMSCs。

1.4.3 Transwell体外趋化实验 为明确CCR7对BMSCs的迁移作用，在孔径8 μm的微孔隔离小室(Transwell)孔板中，分别接种1×10⁵个BMSCs或CCR7-BMSCs(100 μL)，下室的12孔板中分别加入100 μg/L趋化因子SLC溶液(600 μL)，每组设3个复孔，继续置于培养箱中，12 h后取出，PBS洗涤3次，用棉签刮去膜表面细胞，40 g/L多聚甲醛固定15 min，0.5%结晶紫染色10 min，倒置显微镜下进行照相和细胞计数，随机取5个视野(×200)。细胞相对迁移率=(细胞数目/2×10⁶)×100%。

1.4.4 动物体内实验分组 SD大鼠随机分为4组，每组10只。①对照组：未接受全身照射大鼠作为对照组；②照射组：大鼠在麻醉状态下接受全身照射后(⁶⁰Co单次全身照射，总剂量为7.5 Gy，照射量率为0.75 Gy/min)输注生理盐水1 mL；③BMSCs-GFP组：大鼠接受全身照射后，通过尾静脉输注转染GFP的BMSCs(生理盐水重悬，容积1 mL，含细胞5×10⁵个)；④CCR7-BMSCs-GFP组：大鼠接受全身照射后，通过尾静脉输注同时携带GFP和CCR7基因的BMSCs(生理盐水重悬，容积1 mL，含细胞5×10⁵个)，即过表达CCR7的BMSCs。

1.4.5 BMSCs的归巢效果 细胞移植24 h后，将BMSCs-GFP组和CCR7-BMSCs-GFP组大鼠处死，取出脾脏组织，一部分脾组织冷冻，加入包埋剂包埋，制成冰冻切片，荧光显微镜下观察并计数GFP阳性细胞数。取另一部分脾组织，剪碎研磨，1 000 r/min离心10 min，收集脾细胞，流式细胞仪检测GFP阳性细胞数，统计各组BMSCs移植后的归巢情况。

1.4.6 ELISA检测外周血中SLC水平 取对照组和照射组大鼠检测外周血中SLC水平。大鼠接受照射24 h后，取尾静脉血，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，按ELISA试剂盒说明书分别检测标准品和样品的吸光度值，绘制标准曲线，计算血清样本中SLC水平。

1.5 主要观察指标 ①体外检测趋化因子SLC对CCR7-BMSCs定向迁移的影响；②CCR7对大鼠BMSCs向脾脏归巢的影响；③照射损伤对大鼠外周血SLC水平的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，实验数据均以x(_)±s表示，组间样本采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

BMSCs是骨髓中具有自我更新和多向分化能力的基质干细胞，具有容易获取及体外扩增等特点，在临床移植治疗中展示了广阔的应用前景^[17-20]。BMSCs具有归巢的特性，然而在组织工程中的一个亟待解决的问题，就是BMSCs在体内归巢组织中比例低，而归巢数量和移植疗效密切相关^[21]。如何能够高效地促进BMSCs归巢募集，是目前研究的热点。进一步了解归巢机制，提出促进BMSCs归巢的策略，才能达到理想的移植效果。

作者在前期实验中已经初步证实了异体BMSCs能够迁移到D-半乳糖致衰老模型大鼠的胸腺和脾脏中^[22]，通过尾静脉输注BMSCs能明显改善大鼠损伤免疫器官的组织结构^[23]。外源性的间充质干细胞经过静脉回输后，在体内具有组织归巢募集的能力，并且研究发现BMSCs主要向炎症损伤部位趋化。趋化因子是一类对免疫细胞有趋化作用的蛋白质，而BMSCs表达CCR7等趋化因子受体，在BMSCs归巢过程中发挥关键性作用^[24-26]。

研究证实，SLC可使表达其配体CCR7的T细胞、树突细胞正确嵌入二级淋巴器官(secondary lymphoid organ，SLO)的T细胞富集区^[27]。BMSCs特异性地表达CCR7，通过CCR7/SLC的相互作用，有助于SLO的T细胞归巢到损伤组织。因此CCR7/SLC生物轴在SLO的T细胞向损伤组织定向迁移过程中起到关键的作用。实验选择CCR7基因作为目的基因，探讨过表达CCR7对BMSCs增殖和迁移的影响。采用慢病毒技术成功构建了CCR7-BMSCs并使其过表达CCR7蛋白。通过体外Transwell迁移实验，上调CCR7基因表达，使得BMSCs迁移数目明显增高。

体内动物实验结果显示，相对于正常BMSCs，尾静脉回输过表达CCR7的BMSCs能够更有效地归巢至照射后大鼠的脾脏组织。通过荧光显微镜观察可见体外输注过表达CCR7的BMSCs能够成功归巢聚集到照射损伤的脾脏组织。该实验提示CCR7可增强BMSCs迁移归巢能力。实验进一步检测CCR7的配体趋化因子SLC在大鼠体内的表达，结果显示大鼠接受照射后，外周血趋化因子SLC水平增高，通过受体与配体的结合作用机制，介导了表达CCR7的BMSCs归巢迁移至靶组织，从而证实了CCR7/SLC信号轴在BMSCs归巢中发挥重要作用。这也与文献报道相同，即BMSCs归巢性与其表面表达的趋化因子受体有关，通过趋化因子受体与相应配体结合，引起细胞内信号转导，促进细胞迁移归巢^[28-30]。

实验着重研究过表达趋化因子受体CCR7对BMSCs迁移能力的影响，但是趋化因子SLC是通过哪些信号途径影响BMSCs的迁移？而且BMSCs归巢并非只有CCR7/SLC信号轴因素参与调节，其他因素在BMSCs的迁移归巢中是否发挥协同作用？这还需要进一步的研究。未来还需开展更多的研究以及更长时间的观察，以进一步阐释BMSCs在动物甚至人体的体内归巢过程和机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢病毒载体介导CC趋化因子受体7基因过表达可促进大鼠骨髓间充质干细胞归巢

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