慢病毒载体转染内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压并黄芪总苷干预

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0475

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1425-1431.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0475

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慢病毒载体转染内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压并黄芪总苷干预

周小雄¹，魏伟超²，孙策²，叶桃春¹，王嵩¹，卿立金¹，吴辉¹，冼绍祥¹

¹广州中医药大学第一附属医院心血管科，广东省广州市 510400；²广州中医药大学，广东省广州市 510006

修回日期:2017-12-30 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 冼绍祥，博士，教授，广州中医药大学第一附属医院心血管科，广东省广州市 510400
作者简介:周小雄，男，1980年生，江西省安福县人，汉族，广州中医药大学同等学历申请博士学位人员，主治医师，主要从事肺动脉高压的基础和临床研究。
基金资助:
广东省医学科学技术研究基金(A2016606)；广东省高水平大学建设项目

Transplantation of lentiviral-transfected endothelial progenitor cells for pulmonary hypertension and the interventional effect of astragalosides

Zhou Xiao-xiong¹, Wei Wei-chao², Sun Ce², Ye Tao-chun¹, Wang Song¹, Qing Li-jin¹, Wu Hui¹, Xian Shao-xiang¹

¹Department of Cardiovascular Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510400, Guangdong Province, China; ²Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Revised:2017-12-30 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Xian Shao-xiang, M.D., Professor, Department of Cardiovascular Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510400, Guangdong Province, China
About author:Zhou Xiao-xiong, Attending physician, Department of Cardiovascular Medicine, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510400, Guangdong Province, China
Supported by:
the Medical Science and Technology Research Foundation of Guangdong Province, No. A2016606; the High-Level University Construction Program of Guangdong Province

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
内皮祖细胞：是一类能分化为成熟内皮细胞的祖细胞，存在于骨髓、脐血、成人外周血及成人组织器官的大、中血管，在血管损伤时能趋化迁移至受损部位，代替凋亡内皮细胞，维持血管内膜的完整性。
RNA干扰技术：是一种由双链RNA引发的基因沉默效应，分长双链RNA(dsRNA)和短发夹RNA(shRNA)，可快速、高效、特异地抑制靶基因，并且shRNA的胞内稳定性较好，可在体内长期发挥作用，应用较广泛。

摘要
背景：CD40通路的激活对内皮祖细胞的疗效起负向调节作用，而抑制该通路能增强内皮祖细胞的生物学功能。
目的：比较CD40基因沉默的内皮祖细胞(shRNA-CD40转染内皮祖细胞)与常规内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压模型的疗效，并探讨黄芪总苷在内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压中的干预作用。
方法：将90只SD大鼠以随机数字表法分为5组，分别为正常对照组(n=24)、模型组(n=24)、慢病毒转染组(n=18)、常规移植组(n=18)及黄芪总苷组(n=6)。除正常对照组外，其余4组均以野百合碱诱发肺动脉高压模型，慢病毒转染组大鼠分别于野百合碱注射后第7，14，21天尾静脉注射Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞，每个时间点6只；常规移植组大鼠分别于野百合碱注射后第7，14，21天尾静脉注射内皮祖细胞，每个时间点6只；黄芪总苷组在野百合碱注射后第21天时间点注射Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞，同时在第1-21天每日一次给予80 mg/(kg•d)黄芪总苷腹腔注射。野百合碱注射后第28天，进行血流动力学、血浆内皮素1水平与右心室肥大指数检测。
结果与结论：①与正常对照组比较，模型组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均升高(P < 0.05)。与模型组比较，慢病毒转染组、常规移植组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均明显下降(P < 0.05)。随着移植内皮祖细胞时间的延长，2个细胞移植组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数均有逐渐升高趋势，但慢病毒转染组变化差异不明显；②与正常对照组比较，模型组大鼠血浆内皮素1水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，慢病毒转染组、常规移植组血浆内皮素1水平降低(P < 0.05)；慢病毒转染组相同移植时间点的血浆内皮素1水平低于常规移植组(P < 0.05)；③黄芪总苷组的血流动力学、血浆内皮素1水平及右心室肥大指数均优于慢病毒转染组(P < 0.05)；④结果表明，CD40基因沉默的内皮祖细胞治疗肺动脉高压的效果更明显且更持久，黄芪总苷可增强其治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7677-1598(周小雄)

关键词: 黄芪总苷, 干细胞, 内皮祖细胞, 慢病毒载体, 肺动脉高压, CD40, 右心室压力, 肺动脉压, 右心室肥大指数, 内皮素1

Abstract:

BACKGROUND: Activation of CD40 pathway negatively regulates the therapeutic effect of endothelial progenitor cells (EPCs), while inhibition of this pathway can enhance the biological function of the cells.
OBJECTIVE: To compare the therapeutic effects of CD40-silenced EPCs (EPCs shRNA-CD40) and conventional EPCs transplantation in an animal model of pulmonary hypertension, and to explore the interventional effect of astragalosides on EPCs transplantation in the treatment of pulmonary hypertension.
METHODS: Ninety SD rats were randomly divided into five groups: normal control group (n=24), model group (n=24), lentivirus transfection group (n=18), conventional transplantation group (n=18) and astragaloside group (n=6). Except the normal control group, the remaining four groups were given monocrotaline to induce pulmonary hypertension. Rats in the lentivirus transfection and conventional transplantation groups were given intravenous injection of Lv-shRNA-CD40-transfected EPCs and conventional EPCs respectively at 7, 14, 21 days after modeling (n=6 at each time point). Rats in the astragaloside group were given daily intraperitoneal injection of 80 mg/(kg•d) astragaloside within 1-21 days after modeling, and then Lv-shRNA-CD40-transfected EPCs were intravenously injected at 21 days after modeling. Hemodynamics, plasma endothelin-1 level and right ventricular hypertrophy index were detected at 28 days after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After modeling, right ventricular pressure, mean pulmonary arterial pressure and right ventricular hypertrophy index were all increased compared with the normal control group (P < 0.05), while these indices were then decreased significantly after EPCs transplantation (P < 0.05). With the increasing of transplantation time, there was an increasing trend in the right ventricular pressure, mean pulmonary arterial pressure and right ventricular hypertrophy index in the two EPCs transplantation groups, but this trend was not remarkable in the lentivirus transfection group. (2) After modeling, the level of endothelin-1 was increased significantly compared with the normal control group (P < 0.05), and then decreased after EPCs transplantation (P < 0.05). The level of endothelin-1 in the lentivirus transfection group was significantly lower than that in the conventional transplantation group at the same time point (P < 0.05). (3) A significant improvement in hemodynamics, plasma endothelin-1 level and right ventricular hypertrophy index was observed in the astragaloside group as compared with the lentivirus transfection group (P < 0.05). Given the above findings, CD40-silenced EPCs transplantation is more effective and durable than the conventional transplantation in the treatment of pulmonary hypertension, and moreover, astragaloside can enhance the therapeutic effect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hypertension, Pulmonary, Endothelial Cells, Lentivirus Infections, CD40 Ligand, Astragalus membranaceus, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

周小雄，魏伟超，孙策，叶桃春，王嵩，卿立金，吴辉，冼绍祥. 慢病毒载体转染内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压并黄芪总苷干预[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1425-1431.

Zhou Xiao-xiong, Wei Wei-chao, Sun Ce, Ye Tao-chun, Wang Song, Qing Li-jin, Wu Hui, Xian Shao-xiang. Transplantation of lentiviral-transfected endothelial progenitor cells for pulmonary hypertension and the interventional effect of astragalosides[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1425-1431.

图/表（结果） 2

2.1 内皮祖细胞的培养与鉴定 原代培养48 h后，有少量细胞贴壁，多数为小的圆形细胞。随着培养时间延长，细胞体积增大，呈梭形。培养至第7天时，形成细胞集落，可见部分细胞由梭形变为菱形；荧光显微镜下双染色显示，DiI-Ac-LDL染色后细胞呈红色(图1A)，FITC-UEA-1染色后细胞呈绿色(图1B)，双染细胞叠加呈黄色(图1C)；流式细胞仪检测结果显示，细胞高表达CD133及FIK-1，阳性表达率分别为(68.6±5.9)%，(58.6±7.8)%，以上结果提示实验获得的为早期内皮祖细胞。

2.2 Lv-shRNA-CD40慢病毒载体的转染 转染24 h后，荧光显微镜下可见转染成功的细胞发出绿色荧光，转染效率达85%以上；Western Blot检测显示，Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞CD40蛋白表达明显低于未转染内皮祖细胞(P < 0.05，图2)；PCR检测结果显示，Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞CD40基因表达明显低于未转染内皮祖细胞(P < 0.05，图3)，与Western Blot检测结果相同。

2.3 可溶性CD40L水平 野百合碱注射后第7-21天，正常对照组可溶性CD40L水平变化不大，模型组可溶性CD40L水平不断升高，且野百合碱注射后第14，21天的可溶性CD40L水平均高于正常对照组(P < 0.05)，见图4，说明PAH伴随可溶性CD40L水平的升高，CD40通路参与了其发病及发展过程。

2.4 血流动力学检测结果 与正常对照组比较，模型组野百合碱注射后的右心室压力及平均肺动脉压均升高(P < 0.05)，见表1，提示造模成功。与模型组比较，慢病毒转染组、常规移植组右心室压力与平均肺动脉压均明显下降(P < 0.05)，说明内皮祖细胞移植具有改善PAH右心室压力及平均肺动脉压的作用。

常规移植组组内，随着移植内皮祖细胞时间的延长，右心室压力与平均肺动脉压逐渐升高，野百合碱注射后第7，14，21天移植细胞的大鼠右心室压力、平均肺动脉压比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明常规内皮祖细胞移植效果不稳定。

慢病毒转染组组内，随着移植内皮祖细胞时间的延长，虽然右心室压力与平均肺动脉压逐渐升高，但野百合碱注射后第7，14，21天移植细胞的大鼠右心室压力、平均肺动脉压比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明慢病毒转染内皮祖细胞移植效果稳定。

慢病毒转染组野百合碱注射后第7，14天移植细胞的大鼠右心室压力与平均肺动脉压均低于常规移植组(P < 0.05)。

2.5 血浆内皮素1水平检测结果 与正常对照组比较，模型组大鼠血浆内皮素1水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，慢病毒转染组、常规移植组血浆内皮素1水平降低(P < 0.05)；慢病毒转染组相同移植时间点的血浆内皮素1水平低于常规移植组(P < 0.05)，见图5。

2.6 右心室肥大指数检测结果 与正常对照组比较，模型组野百合碱注射后的右心室肥大指数均升高(P < 0.05)，见图6。与模型组比较，慢病毒转染组、常规移植组右心室肥大指数均明显下降(P < 0.05)，说明内皮祖细胞移植具有改善右心室肥大指数的作用。

常规移植组组内，随着移植内皮祖细胞时间的延长，右心室肥大指数逐渐升高，野百合碱注射后第7，14，21天移植细胞各时间点间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明常规内皮祖细胞移植效果不稳定。

慢病毒转染组组内，随着移植内皮祖细胞时间的延长，虽然右心室肥大指数有升高趋势，但野百合碱注射后第7，14，21天移植细胞各时间点间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明慢病毒转染内皮祖细胞移植效果稳定。

慢病毒转染组野百合碱注射后第7，14天移植细胞的大鼠右心室肥大指数均低于常规移植组(P < 0.05)。

2.7 黄芪总苷的干预效果 黄芪总苷组右心室压力、平均肺动脉压、右心室肥大指数及血浆内皮素1水平均低于慢病毒转染组(P < 0.05)，见图7。

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引言

众所周知，肺动脉高压(pulmonary hypertension，PAH)是一种可由多原因导致的肺静脉压力正常而肺动脉压力增高的循环系统疾病，可诱发右心衰竭，属于常见病、多发病，目前尚缺乏有效的治疗方式，病死率较高^[1-3]。目前公认的PAH血管病理改变主要有：肺细小动脉中层肌性肥厚、肺微细动脉肌型化、动脉内膜纤维性增生增厚。多种不利因素，如缺氧、炎症、药物毒性等均可引发肺血管内皮功能失调，致血管壁结构异常，诱发PAH，而内皮细胞凋亡被认为是PAH疾病发生的始动因素。

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)是一类能分化为成熟内皮细胞的祖细胞，存在于骨髓、脐血、成人外周血及成人组织器官的大、中血管，在血管损伤时能趋化迁移至受损部位，代替凋亡内皮细胞，维持血管内膜的完整性。因此，体外培养扩增内皮祖细胞，用于PAH血管内皮细胞的修复是目前研究的热点。动物实验及临床研究表明，回输体外培养扩增的内皮祖细胞对PAH有一定的治疗效果，例如杨志瑜等^[4]将外周血内皮祖细胞经尾静脉途径移植治疗野百合碱导致的PAH，发现外周血内皮祖细胞可在一定程度上修复损伤的肺血管系统，有利于改善PAH；宋则周等^[5]对26例PAH患者实施自体内皮祖细胞移植治疗，3个月后超声心动图显示患者肺动脉收缩压明显下降，右心室结构和功能及非同步运动参数明显好转。但是随着研究的深入，人们逐渐发现内皮祖细胞除可旁分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子等保护因子外，还可分泌基质金属蛋白酶、白细胞介素、单核细胞趋化蛋白1等促炎症因子，因此将内皮祖细胞移植应用于PAH，势必要抑制其炎症效应。

CD40通路(CD40/CD40L)是体内重要的炎症调节通路^[6]，在内皮祖细胞表面存在CD40通路受体分子，因此CD40通路的激活对内皮祖细胞的疗效起负向调节作用，而抑制该通路能增强内皮祖细胞的生物学功能。RNA干扰(RNAi)技术是一种由双链RNA引发的基因沉默效应，分长双链RNA(dsRNA)和短发夹RNA(shRNA)，可快速、高效、特异地抑制靶基因，并且shRNA的胞内稳定性较好，可在体内长期发挥作用，应用较广泛^[7-8]。但是直接将shRNA转染至未分化细胞、原代细胞及非分裂细胞中，转染效率极低，需要一个稳定的载体将其递送至细胞中发挥作用。慢病毒载体已被证实是shRNA的良好载体，可提高shRNA的转染效率，且安全、可靠^[9-11]。因此可采用慢病毒介导RNA干扰技术阻断CD40通路。

中医药在临床实践中对缺血性疾病积累了丰富经验，通过其整体观念指导下的有效中药复方的综合作用及中药的特殊归经理论，能够同时作用于疾病发生的不同环节。因此从补肾益精、补益心气、调肝理气、活血化瘀、养血生脉的角度，或多重功效相结合，探索中药的促血管生成作用，是一个比较有意义的研究方向。黄芪含有黄芪多糖、黄芪皂甙、黄酮等多种化合物，具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和抗炎等生物活性。黄芪总苷，又称黄芪总皂甙，由蒙古黄芪的根提取，可用于调节体内血糖，增强机体免疫力，促进生长，提高机体抗氧化能力，有研究发现其在一定浓度范围内(10-500 mg/L)可促进内皮细胞的增殖，并促进内皮细胞分泌血管内皮生长因子，促进血管新生^[12]。

实验以野百合碱构建PAH大鼠模型为研究对象，比较CD40基因沉默的内皮祖细胞(shRNA-CD40转染内皮祖细胞)与常规内皮祖细胞移植治疗PAH模型的疗效，并探讨黄芪总苷在内皮祖细胞移植治疗PAH中的干预作用，为中医药促血管新生提供新的研究方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机分组对比观察动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年1至10月在广州中医药大学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选取7周龄雄性SD大鼠93只，体质量 (120±25) g，由广州中医药大学实验中心提供。实验过程中对动物的处置严格依照动物伦理学标准进行。

1.3.2 实验试剂 胎牛血清(Hyclone)；EMG-2培养液(上海祥树实业发展有限公司)；DMEM培养液(Sigma- Aldrichdmem)；DiI-Ac-LDL、FITC-UEA-I(北京百诺威生物科技有限公司)；大肠杆菌(武汉普建生物)；淋巴细胞分离液(上海绿齐化工科技有限公司)；ELISA试剂盒(南京金益柏生物科技有限公司)；CD133及FIK-1(德国Miltenyi美天旎)；一抗兔抗大鼠CD40抗体(美国Abcam公司)；野百合碱(美国Sigma公司)；DNA-Lipofectamine 2000复合物(上海玉博生物科技有限公司)；黄芪总苷(成都曼思特生物科技有限公司)；293T细胞(上海然泰生物科技有限公司)。

1.3.3 实验仪器 流式细胞仪(贝克曼库尔特)；实时荧光定量PCR仪(济南光耀医疗设备有限公司)；荧光显微镜(上海蔡康光学仪器厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 分离培养内皮祖细胞 取3只SD大鼠，以3 mL/kg水合氯醛麻醉，麻醉生效后，颈椎脱臼处死大鼠，将其浸泡于体积分数75%乙醇中，10 min后取胫骨与股骨，PBS反复冲洗骨髓腔，至清洗液清亮后，反复吹打冲洗液，使其混匀，以100 μm过滤网过滤，加至等体积的单个核细胞分离液上，3 500 r/min离心30 min，吸取中间单个核细胞层，以PBS洗涤沉淀2次，加入含体积分数15%胎牛血清的EMG-2培养液重悬细胞，以1×10⁷/cm²的密度接种于包被纤维连接蛋白的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，3 d后去除未贴壁细胞，更换新的培养基继续培养^[13-14]。

1.4.2 内皮祖细胞的鉴定

Dil-ac-LDL及FITC-UEA-I双荧光染色鉴定：细胞培养第7天，换无血清培养液，加入体积分数1.5% DiI-Ac-LDL，37 ℃孵育2 h；20 g/L多聚甲醛固定5 min后，PBS洗涤3次，每次5 min；再加入FITC-UEA-I(20 mg/L)，37 ℃孵育1 h后，PBS洗涤3次，每次5 min；封固，在荧光显微镜下观察细胞摄取DiI-ac-LDL 后呈现红色荧光(激发波长543 nm)，摄取FITC-UEA-1后呈现绿色荧光(激发波长477 nm)。

流式细胞仪鉴定：细胞培养第7天，胰酶消化细胞，PBS清洗后离心，计数细胞，采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD133及FIK-1的表达^[13]。

1.4.3 构建Lv-shRNA-CD40慢病毒载体与转染^[15] ①选择CD40基因靶点序列，LV3-CD40-rat-182：GCT CTT GAG AAG ACC CAA TGC，LV3-CD40-rat-427：GGC CAC TGA GAC TAC TGA TAC，LV3-CD40-rat-522：GCT GTG AAG ATC AGA AGC TGA，LV3-CD40-rat-676：GGT GGT CAA GAA ACC AAA GGA，LV3-NC：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T；②从Genepharma软件中设计合成LV3-shRNA对应的DNA茎环结构，退火后，得到shRNA模板，进行整体线性化、酶切及琼脂糖电泳及连接反应；③挑取大肠杆菌单菌落，采用氯化钙法制备感受态细菌培养液，-70 ℃保存；④复苏感受态细菌，置于37 ℃培养箱中培养16 h；⑤使用减裂解法抽提质粒，进行单酶切鉴定；⑥取对数生长期的293T细胞，以6×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于细胞培养皿，置于37℃、含体积分数5%CO₂培养箱过夜，更换含胎牛血清的DMEM培养液，加入DNA-Lipofectamine 2000复合物，置于37℃、含体积分数5%CO₂培养箱过夜，更换含胎牛血清的DMEM培养液继续培养。48，72 h后，分别浓缩培养上清，高速离心后沉淀病毒颗粒，弃上清；⑦选取70%-80%融合的293T细胞，采用孔稀释法检测病毒滴度；⑧选取70%-80%融合的内皮祖细胞，胰酶消化，加入慢病毒原液(慢病毒Lv-shRNA- CD40)进行转染24 h，获得慢病毒Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞，采用PCR及Western Blot检测细胞转染前后的CD40表达。

1.4.4 实验分组 将90只SD大鼠以随机数字表法分为5组，分别为正常对照组(n=24)、模型组(n=24)、慢病毒转染组(n=18)、常规移植组(n=18)、黄芪总苷组(n=6)。

1.4.5 构建PAH模型 野百合碱的配制：2份乙醇和8份生理盐水混合，加入野百合碱制成1%悬液，于超声波清洗仪中助溶约1 h至粉末肉眼不可见。取模型组、慢病毒转染组、常规移植组及黄芪总苷组大鼠，颈背部皮下注射野百合碱60 mg/kg^[15]，均注射1次，正常对照组不注射。通过血流动力学检测平均肺动脉压> 4.655 kPa判定为造模成功。

1.4.6 细胞移植 正常对照组和模型组不进行细胞移植。慢病毒转染组大鼠分别于野百合碱注射后第7，14，21天尾静脉注射5×10⁹ L^-1 Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞0.2 mL，每个时间点6只；常规移植组大鼠分别于野百合碱注射后第7，14，21天尾静脉注射5×10⁹ L^-1的内皮祖细胞0.2 mL，每个时间点6只；黄芪总苷组于野百合碱注射后第21天时间点注射5×10⁹ L^-1 Lv-shRNA-CD40转染的内皮祖细胞0.2 mL，同时在第1-21天每日一次给予80 mg/(kg•d)黄芪总苷腹腔注射^[16]，仅与野百合碱注射后第21天移植Lv-shRNA-CD40转染内皮祖细胞的慢病毒转染组进行对比。

1.5 主要观察指标

可溶性CD40L水平：野百合碱注射后第7，14，21天，以戊巴比妥钠麻醉模型组、正常对照组大鼠，每组每个时间点6只，抽取腹主动脉血，采用ELISA法检测可溶性CD40L水平^[17]。

血流动力学指标：野百合碱注射后第28天，以戊巴比妥钠麻醉所有大鼠，右心导管法检测平均肺动脉压与右心室压。

血浆内皮素1水平：野百合碱注射后第28天，以戊巴比妥钠麻醉所有大鼠，抽取腹主动脉血，采用ELISA法检测血浆内皮素水平^[18]。

右心室肥大指数：野百合碱注射后第28天，抽取腹主动脉血后，处死所有大鼠，分离心脏，清除连接血管，沿室间隔剪开，分离右心室壁肌肉、左心室和室间隔肌肉，在电子秤上称质量，计算右心室肥大指数。右心室肥大指数=右心室质量/(左心室质量+室间隔质量)。

1.6 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行统计分析，实验数据以x(_)±s表示，两组均数间比较用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

CD40蛋白属于肿瘤坏死因子受体超家族，而其配体(CD40L)属于肿瘤坏死因子超家族^[19]。CD40L有两种存在形式：膜型配体(mCD40L)及可溶性配体(sCD40L)^[20]。CD40/CD40L通路的激活能引发并放大机体炎症及凝血反应，而阻断该通道能阻止急慢性炎症的发展。该通路能刺激内皮细胞及平滑肌细胞促炎因子的表达，促进免疫细胞的招募及浸润^[21]。在多种炎症相关疾病中均可发现异常增高的sCD40L血清水平，包括PAH、动脉粥样硬化等^[22]。

实验成功构建了慢病毒载体转染内皮祖细胞移植体系，转染率较高，并且明显抑制了CD40基因及蛋白表达，有效沉默了CD40基因，为日后研究提供了一定的参考。但是实验仅设置了24 h转染时间点，其转染效率是否会随着时间的进展发生变化，也就是其抑制效果是否稳定还需要更进一步的观察与研究。

实验通过检测造模后可溶性CD40L水平变化，初步探讨PAH发病与CD40通路的关系，结果显示随着造模时间的延长，可溶性CD40L水平逐渐升高，呈时间依赖性，显示了CD40通路参与了PAH发病的过程。因此实验假设沉默CD40基因有利于内皮祖细胞移植治疗PAH的效果。为了验证这一结果，进行了PAH造模。PAH模型建立的方式主要有缺氧与野百合碱注射两种，实验采用的是后种方法。野百合碱主要通过破坏血管内膜来引发机体内环境发生变化，导致肺血管重构及肺动脉增高。目前对内皮祖细胞移植治疗缺氧性PAH的效果有很大争议^[23-25]，但内皮祖细胞移植治疗野百合碱诱发的PAH具有较好的治疗效果，本实验也验证了此说法，2个细胞移植组的血流动力学、右心室肥大指数、血浆内皮素水平均有明显改善。

随着研究的深入，学者们发现内皮祖细胞移植的时间窗不同，移植效果也不尽相同^[26-28]，那么早期移植与晚期移植是否真正存在差异呢？为了了解其中的差异，实验选择了在造模后的不同时间点进行细胞移植，结果发现随着移植时间的延长，常规移植组治疗效果逐渐下降，且不同时间点间差异显著。发生此现象的原因，推测可能与以下因素有关：内皮祖细胞不能自由迁移至新的受损部分，并且随着时间的延长，增殖能力有所下降；在病理环境中，内皮祖细胞的功能发生变化，失去了原有的修复优势。这些还有待进一步的研究明确。但是，相反地，在慢病毒转染组虽然也出现了随移植时间的延长治疗效果下降的现象，但差异无显著性意义，并且相对于常规移植组也显示了较好的治疗效果，证实了慢病毒转染可使内皮祖细胞稳定且长久的发挥治疗作用。

中医药在临床实践中对缺血性疾患积累了丰富经验, 通过其整体观念指导下的有效中药复方的综合作用及中药的特殊归经理论，能够同时作用于疾病发生的不同环节。因此从补肾益精、补益心气、调肝理气、活血化瘀、养血生脉的角度，或多重功效相结合，探索中药的促血管生成作用，是一个比较有意义的研究方向。基于以往的研究实验选择了具有多种活性作用的黄芪总苷，探讨黄芪总苷提高内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压的可行性，以期为中医药促血管新生提供新的研究方向。在实验选择浓度下，黄芪总苷可增强内皮祖细胞移植治疗PAH的效果。但是黄芪总苷具体的作用机制还需要进一步明确。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢病毒载体转染内皮祖细胞移植治疗肺动脉高压并黄芪总苷干预

Transplantation of lentiviral-transfected endothelial progenitor cells for pulmonary hypertension and the interventional effect of astragalosides

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