活性生物材料支架体外诱导神经干细胞向神经元高比例分化并形成神经网络

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0476

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (9): 1432-1437.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0476

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

活性生物材料支架体外诱导神经干细胞向神经元高比例分化并形成神经网络

李莹¹，张皑峰²，高钰丹^1，3，赵文^1，3，段红梅^1，3，郝鹏^1，3，尚俊奎¹，杨朝阳^1，3，李晓光^1，3

¹首都医科大学神经生物学系，北京市 100069；²首都医科大学附属北京友谊医院口腔科，北京市 100050；³北京航空航天大学生物与医学工程学院，生物材料和神经再生北京市实验室，大数据精准医疗高精尖创新中心，北京市 100191

修回日期:2018-02-01 出版日期:2018-03-28 发布日期:2018-04-03
通讯作者: 李晓光，博士，教授，首都医科大学神经生物学系，北京市 100069；北京航空航天大学生物与医学工程学院，生物材料和神经再生北京市实验室，大数据精准医疗高精尖创新中心，北京市 100191
作者简介:李莹，女，1990年生，青海省西宁市人，首都医科大学在读硕士，主要从事应用活性生物材料支架体外构建神经环路及其影响的相关研究。
基金资助:
国家重点研发计划(2017YFC1104002；2017YFC1104001)；国家自然科学基金面上项目(31670988；31771053)；国家自然科学基金应急管理项目(31650001)；国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目(31320103903)；高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目(201356)；国家自然科学基金重点项目(31730030)；北京市科技计划(Z171100002217066)

High-proportion differentiation of neural stem cells into neurons and formation of neural networks induced by active biomaterial scaffolds in vitro

Li Ying¹, Zhang Ai-feng², Gao Yu-dan^{1, 3}, Zhao Wen^{1, 3}, Duan Hong-mei^{1, 3}, Hao Peng^{1, 3}, Shang Jun-kui¹, Yang Zhao-yang^{1, 3}, Li Xiao-guang^{1, 3}

¹Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China; ²Department of Stomatology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China; ³Department of Biomedical Engineering, School of Biological Science and Medical Engineering, Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision Medicine, Beihang University, Beijing 100191, China

Revised:2018-02-01 Online:2018-03-28 Published:2018-04-03
Contact: Li Xiao-guang, M.D., Professor, Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China; School of Biological Science and Medical Engineering, Beijing Advanced Innovation Center for Big Data-Based Precision, Beihang University, Beijing 100191, China
About author:Li Ying, Master candidate, Department of Neurobiology, Capital Medical University, Beijing 100069, China
Supported by:
the National Key Research and Development Program of China, No. 2017YFC1104002, 2017YFC1104001; General Programs of National Natural Science Foundation of China, No. 31670988, 31771053; Emergency Management Program of National Natural Science Foundation of China, No. 31650001; Projects of International Cooperation and Exchanges of National Natural Science Foundation of China, No. 31320103903; Key Program of National Natural Science Foundation of China, No. 31730030; Special Funds for the Authors of Excellent Doctoral Dissertations of Universities and Colleges, No. 201356; Beijing Science and Technology Program, No. Z171100002217066

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
活性生物材料支架：神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架，可以在体外缓慢释放神经营养因子3长达14周，具有良好的生物活性和组织相容性，能为体外细胞培养及体内细胞生长提供良好的细胞外微环境。
神经干细胞：存在于神经系统中，具有自我更新功能的细胞群落，有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的潜能。神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架能够高比例诱导神经干细胞向神经元分化并抑制胶质细胞的形成，为研究神经干细胞向神经元的定向分化及神经干细胞移植治疗中枢神经损伤、神经退行性病变、脑卒中等疾病提供新思路。
神经网络：各级神经元之间通过突触形成的网络，是神经元间信号传递和中枢神经系统执行功能的结构基础。

摘要
背景：活性生物材料的良好组织相容性和生物活性与神经干细胞的多向分化潜能均有极大的应用前景和应用价值。
目的：观察神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架在体外对神经干细胞的诱导分化作用及神经干细胞神经营养因子3信号通路关键蛋白的表达。
方法：提取并纯化新生24 h Wistar大鼠脊髓神经干细胞，分4组进行诱导分化：对照组(单纯培养基组)、可溶性神经营养因子3组、单纯壳聚糖组、神经营养因子3-壳聚糖组。诱导6 h，提取蛋白质行Western Blot检测神经营养因子3信号通路关键蛋白TrkC、Akt/p-Akt、Erk/p-Erk的表达；诱导7 d，行MAP2、MBP、GFAP免疫细胞化学染色观察神经元的多向分化及各类细胞的分化比例；诱导14 d，行MAP2、Synapsin-1、PSD95免疫细胞化学染色观察神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料是否诱导神经干细胞分化形成神经网络。
结果与结论：①神经营养因子3-壳聚糖组诱导神经干细胞高比例分化为神经元，比例为73.8%，明显高于其他3组，同时分化形成的胶质细胞低于其他3组；②神经营养因子3-壳聚糖组中关键蛋白TrkC、p-Akt、p-Erk的表达高于其他3组；③神经营养因子3-壳聚糖可以诱导神经干细胞在体外分化形成神经网络。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8899-7313(李莹)

关键词: 神经干细胞, 神经营养因子, 壳聚糖, TrkC受体, MAPK/Erk信号通路, Akt信号通路, 神经网络, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Either good biocompatibility and biological activity of active biological materials or the potential of multidirectional differentiation of neural stem cells has great application prospect and value.
OBJECTIVE: To investigate the effect of neurotrophic factor 3-chitosan active biomaterial scaffolds on the differentiation of neural stem cells and the expression of key proteins of the neurotrophic factor 3 signal pathway in vitro.
METHODS: The neural stem cells were extracted and purified, and then divided into pure culture medium group, soluble neurotrophic factor 3 group, pure chitosan group, and neurotrophic factor 3-chitosan group for differentiation induction. The expression of TrkC, Akt / p-Akt and Erk/p-Erk in the neurotrophic factor 3 signaling pathway was detected by western blot after 6 hours of induction. After 7 days of induction, differentiation of neural stem cells was observed by immunocytochemistry of MAP2, MBP, and GFAP. After 14 days of induction, formation of neural network induced by neurotrophic factor 3-chitosan active biomaterials was observed by immunocytochemistry of MAP2, Synapsin-1, and PSD95.
RESULTS AND CONCLUSION: The neurotrophic factor 3-chitosan group induced a high proportion of neural stem cells differentiated into neurons, with a ratio of 73.8%, which was significantly higher than that in the other three groups. Meanwhile, the proportion of cells differentiated into glial cells waslower than that in the other three groups. The expression of key proteins TrkC, p-Akt and p-Erk in the neurotrophic factor 3-chitosan group was higher than that in the other three groups. Meanwhile, neurotrophic factor 3-chitosan could induce the in vitro differentiation of neural stem cells to form neural network.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Neurotrophin 3, Chitosan, Neurons, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李莹，张皑峰，高钰丹，赵文，段红梅，郝鹏，尚俊奎，杨朝阳，李晓光. 活性生物材料支架体外诱导神经干细胞向神经元高比例分化并形成神经网络[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(9): 1432-1437.

Li Ying, Zhang Ai-feng, Gao Yu-dan, Zhao Wen, Duan Hong-mei, Hao Peng, Shang Jun-kui, Yang Zhao-yang, Li Xiao-guang. High-proportion differentiation of neural stem cells into neurons and formation of neural networks induced by active biomaterial scaffolds in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(9): 1432-1437.

图/表（结果） 1

2.1 脊髓源神经干细胞的培养、纯化与鉴定结果 神经细胞悬液接种约24 h后逐渐形成小神经球，可观察到较多的细胞碎片。随着细胞的增殖，神经球球体逐渐增大变圆，悬浮液中细胞碎片减少。传代至第3代时可见纯化的神经球体积较大、边界清晰、折光性强，纯化的神经球表达神经干细胞特异性标记物巢蛋白(Nestin)(图1)，证明提取并纯化的脊髓源性神经球为神经干细胞。

2.2 神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架诱导神经干细胞高比例向神经元分化并抑制神经干细胞向胶质细胞分化 诱导7 d后4组神经球均发生不同程度的分化，各组均可见微管相关蛋白2(MAP2)阳性神经元、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性星形胶质细胞、髓磷脂碱性蛋白(MBP)阳性少突胶质细胞，其中神经营养因子3-壳聚糖组神经元比例最高(73.8%)且明显高于其他3组，而星形胶质细胞和少突胶质细胞比例最低(图2)，证明了神经干细胞具有多向分化潜能，同时也证明了神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架能够诱导神经干细胞向神经元高比例分化，并抑制胶质细胞的生成。

2.3 神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架诱导TrkC信号通路关键蛋白高比例表达 神经营养因子3主要通过与细胞膜表面神经营养因子3受体，即TrkC受体结合，进而激活Akt及MAPK/Erk通路以维持神经干细胞的生长和分化，并且介导突触的形成。通过检测神经营养因子3信号通路中TrkC受体、Akt/p-Akt、Erk/p-Erk不同时间点蛋白表达，发现在4组神经球诱导分化至6 h时，被检蛋白的表达含量最高，因此提取4组神经球诱导分化6 h时的蛋白进行Western Blot检测蛋白表达水平，发现神经营养因子3-壳聚糖组神经干细胞表达的关键蛋白水平高于其他3组(图3)，进一步证明神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架能够促进神经元的生长和分化。

2.4 神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架诱导神经干细胞形成突触与神经网络 突触形成是神经元成熟的标志，也是神经网络形成的基础。由于神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架能够诱导神经干细胞高比例分化形成神经元，因此进一步检测神经营养因子3-壳聚糖支架诱导分化出的神经元之间是否能形成突触结构。诱导14 d后对神经营养因子3-壳聚糖组的细胞进行免疫细胞化学染色发现，MAP2阳性神经元之间有突触囊泡蛋白(Synapsin-1)阳性的突触前成分表达，也有突触后密度蛋白(Postsynaptic Density Protein 95，PSD95)阳性的突触后成分表达，并且突触前成分和突触后成分存在共定位现象(图4)，说明神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架诱导神经干细胞分化出的神经元之间形成了突触，同时分化出大量的神经元之间也通过突触的相互联系形成了神经网络。

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引言

脑和脊髓损伤通常导致永久性功能丧失，但在成年人中枢神经系统中发现的神经干细胞，使人们通过对激活内源性干/祖细胞的发生，诱导神经系统的再生来治疗中枢神经系统损伤产生了浓厚的兴趣^[1]。成年动物脑中，内源性神经干细胞主要在侧脑室脑室下区(subventricular zone，SVZ)中不断产生新生神经元，并迁移到嗅球(olfactory bulb)以及海马齿状回(subdentate gyrus zone，SGZ)^[2]。脊髓中神经干细胞主要存在于脊髓中央管室管膜区(central canal，CC)^[3]。这些细胞的存在最早是通过提取并体外培养出具有自我更新能力及能够向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的细胞来证明的^[4]。通过体外培养神经干细胞并进行中枢神经系统损伤区移植是一直以来的研究热点^[5]，而研究生物材料定向诱导神经元分化并修复损伤区结构和功能将为临床治疗中枢神经系统损伤带来新导向^[6]。

神经营养因子3(neurotrophin 3，NT-3)是众多神经营养因子的一种，是对神经元的发育、存活和凋亡有重要作用的蛋白质，其对胚胎发育早期的多向分化潜能作用尤为重要^[7]。神经营养因子3主要作用于神经元表面的TrkC受体，进而激活下游MAPK/ERK与Akt信号通路，以维持神经元的生长、诱导神经元的分化和促进神经元之间突触的形成^[8]。但神经营养因子3在体内的半衰期短，单独存在时易被降解且价格昂贵，故实验采用壳聚糖作为神经营养因子3的载体，且作者所在实验室之前的研究已经证实神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架可以在体外缓慢释放神经营养因子3，释放时程长达14周，并且可以在体外诱导神经干细胞高比例分化形成神经元^[9]。在体内，神经营养因子3-壳聚糖载体可以激活大鼠完全性脊髓横断后脊髓内源性神经干细胞，诱导内源性神经干细胞分化形成功能性神经元，并与宿主脊髓建立功能性神经环路^[10]。

实验旨在研究神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架体外诱导神经干细胞的分化情况、TrkC信号通路中关键蛋白的表达及能否诱导神经干细胞分化形成突触及神经网络，为下一步临床应用活性生物材料支架治疗中枢神经系统损伤等疾病进一步提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6月至2017年7月在首都医科大学基础科研楼完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 新生24 h SPF级Wistar大鼠60只，雌雄不限，由首都医科大学实验动物部提供，许可证号：SCXK(京)2016-0006。所有实验均由首都医科大学实验动物中心批准，并按照首都医科大学实验动物中心和北京实验动物协会的标准执行。

1.3.2 主要试剂及仪器 PBS粉末、DMEM/F12、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)；B27(Invitrogen公司)；神经营养因子3、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、青链霉素、左旋多聚赖氨酸、壳聚糖(Sigma公司)；封闭用正常羊血清(中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗大鼠Nestin单克隆抗体(1︰200)(Abcam公司)；小鼠抗大鼠MAP2单克隆抗体(1︰250)(Sigma公司)；兔抗大鼠MBP多克隆抗体(1︰200) (Millipore公司)；鸡抗大鼠GFAP单克隆抗体(1︰1 000) (Abcam公司)；兔抗大鼠Synapsin-1单克隆抗体(1︰200) (Cell Signaling Technology公司)；小鼠抗大鼠PSD95单克隆抗体(1︰200)(Sigma公司)；山羊抗小鼠Alexa Fluor488(1∶200)、山羊抗兔Alexa Fluor 568(1∶200)、山羊抗鸡Alexa Fluor 633(1∶200)、山羊抗鸡Alexa Fluor488(1∶200)(Life Technologies公司)；兔抗大鼠TrkC单克隆抗体(1︰1 000)、兔抗大鼠ERK单克隆抗体(1︰1 000)、兔抗大鼠p-ERK单克隆抗体(1︰1 500)、兔抗大鼠Akt单克隆抗体(1︰1 000)、兔抗大鼠p-Akt单克隆抗体(1︰1 500)、小鼠抗大鼠GAPDH多克隆抗体(1︰1 000)(Cell Singnaling公司)；小鼠抗大鼠Na⁺-K⁺-ATPase多克隆抗体(1︰10 000)(Proteintech公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或小鼠二抗(1︰4 000)(Thermo Scientific公司)；超净台(BOXUN净化设备公司)；解剖显微镜、相差倒置显微镜(OLYMPUS公司)；恒温CO₂培养箱(SANYO公司)；培养瓶、6孔板(Corning公司)；激光共聚焦扫描显微镜(Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1 神经干细胞的提取、培养及纯化 取新生24 h Wistar大鼠冰冻麻醉，浸于体积分数为75%乙醇中消毒10 min后取出，用滤纸吸去多余乙醇，置入超净台培养皿，剪开背部皮肤并暴露脊柱，剪断颈、尾椎，吹出脊髓，置于PBS中清洗3次，在解剖显微镜下剥离硬脊膜后置于DMEM/F12培养基中，用眼科剪剪碎脊髓，用巴氏管轻轻吹打形成单细胞悬液，以1×10⁵个/cm²的密度接种于含神经干细胞培养基的培养瓶中。神经干细胞培养基成分：DMEM/F12，添加2%B27、0.1%碱性成纤维生长因子(bFGF，20 μg/L)、0.1%表皮生长因子(EGF，20 μg/L)和1%青链霉素。将培养瓶放入37 ℃，体积分数为5%CO₂的恒温培养箱中进行悬浮培养(即原代)，每3 d半量换液1次，即细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃半量上清后加入等量新鲜培养基，吹打混匀。培养1周形成神经球时传代(即第1代)。第3代时用相差倒置显微镜观察神经球形态。

1.4.2 神经干细胞诱导分化 取第3代神经球，以350球/cm²的密度种植于包被左旋多聚赖氨酸的盖玻片上分4组进行诱导：①对照组：加入条件培养基(DMEM/F12，添加2%B27，1%青链霉素)；②可溶性神经营养因子3组：在培养开始时于条件培养基中一次性添加20 μg/L神经营养因子3；③单纯壳聚糖组：在培养开始时于条件培养基中一次性添加10 g/L壳聚糖；④神经营养因子3-壳聚糖组：在培养开始时于条件培养基中一次性添加10 g/L神经营养因子3-壳聚糖载体(自制)^[7]。每3 d半量换液1次。

1.4.3 免疫荧光染色 第3代神经球行Nestin免疫荧光染色鉴定神经干细胞，第3代神经球经诱导分化7 d行MAP2、MBP、GFAP免疫荧光染色鉴定分化细胞种类，分化14 d行MAP2、Synapsin-1、PSD95免疫荧光三标染色鉴定突触及神经网络的形成。免疫荧光染色过程如下：细胞除去培养基，0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min；40 g/L多聚甲醛4 ℃固定40 min，0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min；0.1%TritonX-100破膜15 min，0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min；体积分数为5%封闭用正常羊血清室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜；0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min；加入相应二抗避光室温孵育1 h，0.01 mol/L PBS冲洗；Hoechst33342复染核，50%甘油封固，激光共聚焦扫描显微镜观察。

1.4.4 Western Blot检测 分别收集4组诱导分化6 h的神经干细胞，4 ℃，12 000 r/min离心15 min后弃上清，加入细胞裂解液于冰上裂解，再4 ℃，12 000 r/min离心5 min，取上清，用BCA法蛋白定量后制成蛋白含量为3 g/L的电泳样品，取10 μL(30 μg总蛋白)用8%SDS-PAGE进行电泳，聚集胶：10 mA，30 min；分离胶：15 mA，90 min。电泳结束后行蛋白质转膜：孔径0.22 μm的PVDF膜，4 ℃，电流300 mA，60 min。Western Blot杂交步骤：室温5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h，TTBS漂洗3次，每次10 min，与TrkC、ERK、p-ERK、Akt、p-Akt、GADPH、Na-K-ATPase一抗杂交反应，4 ℃过夜后，TTBS漂洗同上，再将PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠二抗杂交反应1 h，TTBS再次漂洗，过程同上。取出PVDF膜喷洒ECL发光液放入超灵敏多功能成像仪曝光，用Fusion Capt16.15软件获得图像。

1.5 主要观察指标 神经干细胞分化成各型细胞的数量及比例、细胞形态、关键蛋白的表达量、神经元之间是否形成突触及神经网络。

1.6 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，所有数据均以x(_)±s表示，4组神经元/星形胶质细胞/少突胶质细胞分化比例的组间比较、4组蛋白表达的组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，对照组和可溶性神经营养因子3组的神经元表达比例的组间比较采用Bonferroni法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

在中枢神经系统损伤的治疗中，神经干细胞的临床治疗常常通过其分化形成的神经元取代坏死神经元以及通过分泌神经营养因子来维持受损细胞的生存来实现，但移植的神经干细胞生存率低、神经元分化程度低、细胞迁移程度差，使神经干细胞的临床治疗效果受到了严重的限制^[11-17]。而神经营养因子能够刺激神经干细胞的生存、增殖和分化，并且可以为损伤区及其周围损伤区域的细胞提供营养，故神经营养因子与神经干细胞共同移植被认为是治疗中枢神经系统损伤的潜在方案^[18]。神经营养因子3能够有效刺激神经干/祖细胞的生存和增殖^[19]，结合壳聚糖可降解、毒性低、可辅助神经修复等生物特点^[20-21]，让神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架缓释的神经营养因子3在神经系统损伤区的发挥时效增长，为神经干细胞的生存、增殖和分化提供了良好的细胞外微环境。

中枢神经系统损伤会带来一系列的病理改变，如神经元变性坏死、轴突及髓鞘崩解、胶质瘢痕形成、炎性细胞浸润等，这些病理改变对神经干细胞的内源性发生极为不利^[22-23]。而实验发现神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架能够诱导神经干细胞高比例向神经元分化，分化比例高达73.8%，同时分化形成的星形胶质细胞和少突胶质细胞比例均有不同程度的降低，证明神经营养因子3-壳聚糖生物活性支架在诱导神经干细胞高比例分化形成神经元的同时，能够抑制胶质细胞的分化，从一定程度上抑制胶质瘢痕的形成^[24]，从而减少髓磷脂相关蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖等抑制神经干细胞内源性发生蛋白分子的释放^[25]，激活内源性神经干细胞发生。作者所在的实验室在前期研究中发现，神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架具有抗炎和促进血管形成的作用^[26]，这为新生神经元与宿主建立功能性突触联系提供了更为有利的生长条件。

神经营养因子3主要通过作用于细胞表面的TrkC受体激活下游信号通路来发挥生物学效应，通过激活Akt信号通路和MAPK/Erk信号通路来维持细胞生存和分化^[27]，实验发现神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架组TrkC表达水平、Akt与Erk的磷酸化水平都较对照组、可溶性神经营养因子3组、单纯壳聚糖组增高，进一步从分子生物学角度，证明神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架可以维持并增强细胞的生存和分化。

突触联系是神经元之间信息传递和中枢神经系统执行功能的基础^[28-30]，神经元与神经元之间常常形成轴-体突触和轴-树突触，进一步形成神经网络，进行信息的接收、整合、输出和传导，实现神经元之间的信息交换^[31-34]。生物材料诱导神经干细胞分化出神经元并形成突触联系是生物材料发挥生物学作用的另一关键。实验通过免疫细胞化学的方法进行神经元、突触前膜成分、突触后膜成分的标记，发现了三标的共定位现象，验证了神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架诱导神经干细胞在体外高比例分化形成神经元的同时，各神经元之间形成了轴-体突触和轴-树突触，从形态学方面证明了神经网络的形成。

实验通过体外培养脊髓源神经干细胞并诱导分化证明，神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架能够诱导神经干细胞多向分化的同时，可以高比例分化形成神经元并抑制胶质细胞的分化，TrkC信号通路中关键蛋白高表达，且各级神经元之间在形态学上形成了突触联系。虽然形态学是功能学的基础，但这是远远不够的，接下来可以从电生理的角度进一步检测神经营养因子3-壳聚糖活性生物材料支架诱导神经干细胞形成的神经元和神经网络是否能产生电活动，进一步完善活性生物材料支架在体外细胞培养中对神经干细胞的作用，为神经干细胞和生物材料的临床应用提供理论数据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

活性生物材料支架体外诱导神经干细胞向神经元高比例分化并形成神经网络

High-proportion differentiation of neural stem cells into neurons and formation of neural networks induced by active biomaterial scaffolds in vitro

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