不同浓度厄贝沙坦对前成骨细胞分化和矿化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
厄贝沙坦：为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，是常用的治疗高血压和心力衰竭的药物。厄贝沙坦主要通过诱导监测骨吸收、增加骨密度发挥作用，其不仅可在骨痂形成中发挥作用，同时也可抑制成骨细胞的基质钙化。多年来，关于厄贝沙坦与促进成骨细胞分化的研究较少，目前仍集中在动物水平。最近的研究表明，厄贝沙坦在成骨细胞分化过程发挥重要调节作用，可改善骨质疏松。
Runt相关转录因子2：对骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化有一定的促成骨效应。Runt相关转录因子2基因的缺失将导致骨发育不良或骨发育终止，可见 Runt相关转录因子2基因是成骨细胞分化的控制基因，也是骨形成过程中的控制基因。Runt相关转录因子2能调节多种成骨细胞的特异性标志物的增殖分化和表达。

摘要
背景：有研究发现，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对骨的保护作用强于较血管紧张素转换酶抑制剂。
目的：观察不同浓度血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂厄贝沙坦对小鼠前成骨细胞分化和矿化的影响。
方法：选取对数生长期小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1，分4组培养，分别加入含0(对照)，0.001，0.01，0.1 mmol/L厄贝沙坦的成骨诱导培养基培养。诱导培养10 d，采用碱性磷酸酶染色观察细胞分化情况；诱导培养21 d，采用茜素红染色观察细胞矿化情况；诱导培养1，4，7，14，21 d，RT-PCR检测细胞成骨细胞内骨钙素、碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2mRNA的相对表达量。
结果与结论：①碱性磷酸酶染色：0.001，0.01，0.1 mmol/L厄贝沙坦组碱性磷酸酶活性均高于对照组(P < 0.05)，其中以0.01 mmol/L效果最明显；②茜素红染色：0.001，0.01，0.1 mmol/L厄贝沙坦组钙结节数量及面积均高于对照组(P < 0.05)，其中以0.01 mmol/L效果最明显；③RT-PCR检测：0.01 mmol/L厄贝沙坦组诱导培养不同时间点的碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA相对表达量均高于对照组(P < 0.05)；④结果表明：0.01 mmol/L厄贝沙坦可显著促进成骨细胞的分化和矿化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-6605-5432(赵忠海)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 厄贝沙坦, 成骨细胞, 分化, 矿化, 碱性磷酸酶染色

Abstract:

Abstract
BACKGROUND: Angiotensin II receptor antagonists have been found to exerct a stronger protective effect on bone than angiotensin converting enzyme inhibitors.
OBJECTIVE: To investigate the effect of different concentrations of irbesartan (angiotensin II receptor antagonist) on the differentiation and mineralization of mouse preosteoblasts.
METHODS: Mouse preosteoblast cell lines MC3T3-E1 in logarithmic phase were selected and cultured in the osteogenic induction medium containing 0 (control group), 0.001, 0.01, 0.1 mmol/L irbesartan, respectively. Ten days later, the cell differentiation was observed by alkaline phosphatase staining. The mineralization was observed by alizarin red staining after 21 days of culture. mRNA expressions of osteocalcin, alkaline
phosphatase and Runt-associated transcription factor 2 in osteoblasts were detected by real-time PCR at 1, 4, 7, 14 and 21 days of culture.
RESULTS AND CONCLUSION: The activity of alkaline phosphatase in all the irbesartan groups (0, 0.001, 0.01, 0.1) was higher than that in the control group (P < 0.05), which was the most obvious in 0.01 mmol/L. The number and area of calcium nodules in each irbesartan group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05), especially in 0.01 mmol/L. Compared with the control group, 0.01 mmol/L irbesartan significantly upregulated the mRNA expressions of osteocalcin, alkaline phosphatase and Runt-associated transcription factor 2 (P < 0.05). These results suggest that 0.01 mmol/L irbesartan significantly promotes the differentiation and mineralization of osteoblasts.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoblasts, Cell Differentiation, Alkaline Phosphatase, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计分组对比，体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点实验于2014年6月至2015年12月在沈阳医学院附属中心医院完成。

1.3 材料小鼠前体成骨细胞株MC3T3-E1购自上海生命科学研究院细胞资源中心；高糖a-MEM培养基、胎牛血清(杭州四季青公司)；厄贝沙坦(杭州制药有限公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

成骨细胞系MC3T3-E1的传代培养及分化能力检测：按照90%DMEM+体积分数10%胎牛血清的比例配制普通培养基，将细胞在普通培养基、37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养，二三天更换1次培养基，待细胞长至80%左右进行细胞传代及细胞冻存处理。

细胞传代：待细胞融合度达到80%左右时，可进行细胞传代，先吸取旧培养基，沿培养瓶壁缓缓注入适量PBS，充分洗涤后将洗涤液吸出，再次重复上述洗涤过程后将洗涤液吸出，滴加0.25%胰蛋白酶1.0-2.0 mL，将贴壁的梭形细胞消化成单个球形细胞，倒置显微镜低倍视野下观察细胞消化情况，当约80%细胞变成球形，少量贴壁细胞呈漂浮状可停止消化，加入与消化液等量的培养基终止消化。以吸管吹打混匀消化终止液，将仍然贴壁的细胞吹打进入悬浮状态，顺序可按照至上而下、从左到右，培养瓶底面的各处均需进行吹打，动作尽量轻柔避免造成不必要的细胞损失，吹打结束后可置于倒置显微镜下观察细胞状态。将含有大量细胞的消化液移入离心管中，800 r/min离心 5 min，离心结束后，离心管底部可见淡黄色或灰白色的细胞团块，将上清液吸出后重新加入新的培养基，再次吹打混匀，最后将细胞悬浮液平均加入新的培养瓶中继续培养，根据细胞数量，采用一传二或一传三的方式传代。

细胞冻存：事先配置好冻存液，冻存液一般现配现用，即将体积分数90%胎牛血清+10%DMSO混匀，总量根据所冻存的细胞数而定，一般每根容积为2 mL的冻存管可用于冻存1 mL细胞悬浮液。具体步骤同上，直至离心结束，将离心管中的上清吸出，尽量吸净上清液，加入事先配置好的冻存液，吹打混匀后分装入冻存管中，封口后采用逐渐降温冻存法降温至-196 ℃：4 ℃ 30 min，-20 ℃ 2 h，-80 ℃过夜，置入液氮中长期保存。

诱导培养基的配制：①抗坏血酸：以双蒸水为溶剂溶解50 mg抗坏血酸，定容至10 mL，配成5 g/L的抗坏血酸母液，0.22 μm滤膜过滤后避光4 ℃封口保存，使用时，每100 mL培养基加入1 mL抗坏血酸母液，培养基终浓度为 50 mg/L；②β-磷酸甘油酸钠：以双蒸水为溶剂溶解2.3 g β-磷酸甘油酸钠，定容至10 mL，配成1 mol/L的母液，0.22 μm滤膜过滤后4 ℃封口保存，使用时，每100 mL培养基加入1 mL β-磷酸甘油酸钠母液，培养基的终浓度为 10 mmol/L；③地塞米松：以为溶剂溶解地塞米松3.925 mg，定容至10 mL，配成10^-6 mol/mL的母液，0.22 μm膜过滤后4 ℃封口保存，使用时，每100 mL培养基加入0.1 mL地塞米松母液，培养基终浓度为10^-8mol/L。

小鼠前成骨细胞的成骨诱导：将前成骨细胞以90%DMEM+体积分数10%胎牛血清培养基进行培养，待细胞铺满培养面40%-50%时，可更换为诱导培养基。更换为成骨培养基后，部分前成骨细胞可出现死亡，细胞密度较高部位细胞死亡率稍低，而细胞密度较低部位细胞死亡率较高。以诱导培养基培养24 h后，更换为含不同浓度厄贝沙坦的诱导培养基[0(对照)，0.001，0.01，0.1 mmol/L]进行分组培养。

1.5 主要观察指标

RT-PCR检测成骨细胞骨钙素、碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2mRNA的相对表达量：为了证实厄贝沙坦对成骨细胞分化功能有一定的影响作用，在含不同浓度厄贝沙坦诱导培养基诱导培养第1，4，7，14，21天，将成骨细胞以1×10⁴/孔的密度接种于六孔板上，通过real-timePCR技术分别检测出各组骨钙素、碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2mRNA的相对表达量。①细胞总的RNA提取：将六孔板的培养基弃去，用无菌PBS冲洗1次，在每个孔的细胞中加入Trizol试剂1 mL，在冰块上放置5 min，用枪头吹打二三次。将各孔裂解液吸到1.5 mL的EP管中，每个EP管中加入氯仿0.2 mL，然后用力震荡15 s，在30 ℃下孵育 3 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min。离心后液体可分为3层，将上层无色液体吸入另一新的EP管中，加入同样体积的异丙醇0.4-0.5 mL，均匀混和，在15 ℃下孵育30 min，然后 4 ℃下以12 000×g离心10 min。弃去上清，在沉淀中加入 1 mL体积分数75%的乙醇，涡旋震荡30 s，4 ℃下7 500×g离心5 min。弃掉上清，管内沉淀物在超净的工作台鼓风静置干燥5 min。在沉淀中加入DEPC水20 μL溶解，分装每管5 μL，保存在-70 ℃冰箱；②反转录：根据每个样品总 RNA的浓度，将每个样品的总RNA浓度稀释到100 g/L。在 0.2 mL PCR管中加入0.2 μg总RNA，Oligo(dT)18引物0.2 μg，加入DEPC水处理，使总的体积达到8 μL，在 4 ℃下8 000 r/min 瞬时离心后，在 PCR仪内70 ℃下孵育 5 min，之后迅速放置冰盒上冷却。加去5×RTase Buffer (250 mmol/L Tris-HCl(pH=8.3)，250 mmol/L KCl，20 mmol/L MgCl₂，50 mmol/L DTT)4 μL，10 mmol/L dNTPmix (dATP、dCTP、dGTP、dTTP，各10 mmol/L) 2μL，瞬时离心后，在PCR仪内 37 ℃下孵育 5 min。以上的实验步骤均在冰上操作完成。将1 μL RertAiddTM M-MμLV Revserse Tramscriptase(200 U/μL) 瞬时离心后，在 PCR仪内43 ℃下孵育1 h。之后 70 ℃ 10 min终止反应，所得的即为cDNA，放置于-20 ℃冰箱内保存备用；③目的PCR片段扩增：用实用定量引物进行RT-PCR，在0.2 mLPCR管逐步加入2.0 μg cDNA，10×RT-PCR 扩增缓冲液 2.0 μL，dNT (dATP、dCTP、dGTP、dTTP，各10 mmol/L) 1.5 μL，1.0 μL上游引物(10 mmol/L)，1.0 μL下游引物 (10 mmol/L)，Tap酶0.2 μL，加RNase Free水到总体积为20 μL。以上的步骤应在冰上操作。瞬时离心后，将PCR反应液放置在 RT-PCR反应仪器上进行PCR扩增反应，RT-PCR反应条件为：95 ℃预变性10 s；95 ℃变性5 s，退火30 s，共40个循环；熔解曲线 95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，1 个循环。以β-actin作为内参来估计初始拷贝数，反应的特异性通过溶解曲线来分析，用2^-^??Ct法来计算细胞相关基因的相对表达量，用于统计学的分析。

RT-PCR引物：
引物	正向引物	反向引物
β-actin	5’-AGA TGT GGA TCA GCA AGC AG-3′	5’-GCG CAA GTT AGG TTT TGT CA-3′
碱性磷酸酶	5’-GCA GCT TGG TGC ACA CCT AG-3'	5’-GAG ACA TTT TCC CGT TCA CC-3′
Runt相关转录因子2	5’-CCG GCA AGA TGA GCG AGG TCA-3′	5’-GTG GGT TGA GAA GCG GCT CT-3′
骨钙素	5’-ATG AGG ACC CTC TCT CTG CT-3′	5’-GGA GCT GCT GTG ACA TCC AT-3′

碱性磷酸酶及茜素红染色：①茜素红染色液的配制：称取14.41 g茜素红溶解于100 mL去离子水中，充分搅拌混匀后，将pH值调整为4.1，过滤备用；②碱性磷酸酶染色工作液的配置：将33 μL BC2P与66 μL NBT混合，PBS补足至10 mL。用PBS洗细胞3次，加入适量40 g/L多聚甲醛，室温避光固定30 min，同时按照操作说明配制碱性磷酸酶染液。30 min后PBS洗细胞3次，分别加入碱性磷酸酶染液(含不同浓度厄贝沙坦诱导培养基诱导培养第10天)和茜素红染液(含不同浓度厄贝沙坦诱导培养基诱导培养第21天)。碱性磷酸酶染色于室温环境下，避光染色15 min。茜素红染色于37 ℃环境中孵育30 min。之后使用PBS和双蒸水交替冲洗细胞3次。倒置显微镜观察染色效果并拍照。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0 for windows软件进行统计学处理，计数资料采用χ²检验，计量资料采用x(_)±s表示，采用t 检验，当P < 0.05时表示差异有显著性意义。

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讨论

实验取诱导第14天的成骨细胞进行碱性磷酸酶染色，各浓度药物组较对照组均有促成骨作用，0.01mmol/L厄贝沙坦组较其他浓度有较强的促成骨作用。实验取诱导至 21 d的细胞进行茜素红染色，可见0.01mmol/L厄贝沙坦组钙化结节表达最为明显，提示0.01 mmol/L厄贝沙坦能显著提高促进钙盐沉积，促进成骨细胞矿化能力。与对照组相比，0.01 mmol/L厄贝沙坦组Runt相关转录因子2、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA表达量明显增加(P均< 0.05)。

近年来，动物和流行病学证据表明，高血压与钙离子的代谢异常有关，其主要是钙流失增加，增加了骨质疏松风险^[3-4]。血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂是常用的治疗高血压和心力衰竭的药物。有研究证明，血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物在治疗高血压和正常血压骨质疏松大鼠中均可显著增加骨密度，降低骨质疏松风险。但在人类临床实验中，关于血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物对骨骼影响的研究甚少。厄贝沙坦主要通过诱导监测骨吸收，增加骨密度发挥作用，其不仅可在骨痂形成中发挥作用，同时也可抑制成骨细胞的基质钙化。

骨形成分为3个阶段：细胞增殖、细胞外基质的产生及矿化。在细胞增殖阶段，胶原蛋白开始产生，之后碱性磷酸酶、骨钙素表达逐渐增加，与矿化基质的分化及稳定相关，此后钙盐开始沉积^[5-6]。骨代谢主要包括骨形成和骨吸收，正常骨量的维持主要是通过成骨过程与破骨过程平衡实现的。成骨细胞可特异性分泌多种生物活性物质，这些活性物质可直或是间接地调节骨的形成和重建过程。它富含碱性磷酸酶和骨钙素，二者分别是成骨细胞早期分化和晚期的分化标志^[7]。

骨钙素成骨细胞晚期合成的，成骨细胞外基质钙化和骨钙素高度相关，是成骨骨细胞外基质特异性蛋白分化标志。实验通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测骨钙素mRNA的活性。实验中发现厄贝沙坦可促进骨钙素mRNA的表达。

碱性磷酸酶活性、骨钙素和I型胶原的表达及矿化结节的检测是鉴定骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞的主要标志^[8-9]。碱性磷酸酶可分解有机质中磷酸，增加局部无机磷酸盐浓度，促进矿化，是成骨细胞分化和功能成熟的前期标志^[10]，其活性越高，说明前期成骨细胞向成熟成骨细胞的分化越明显。实验实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测碱性磷酸酶的活性，发现厄贝沙坦可促进碱性磷酸酶mRNA的表达。

Runt相关转录因子2对骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化有一定的促成骨效应^[11]。Runt相关转录因子2基因的缺失将导致骨发育不良或骨发育终止，可见 Runt相关转录因子2基因是成骨细胞分化的控制基因，也是骨形成过程中的控制基因。Runt相关转录因子2能调节多种成骨细胞的特异性标志物的增殖分化和表达^[12]。Valenti等^[13]研究发现，Runt相关转录因子2表达相对较高情况下能促进新生成骨细胞的分化，Runt相关转录因子2基因与成骨细胞特异顺式作用元结合后，能够激活骨钙蛋白、骨桥素、骨涎蛋白和工型胶原基因的转录和表达。Runt相关转录因子2作为成骨细胞分化的重要调节因子^[14-15]，在成骨细胞的诱导、复制和成熟的整个过程中发挥着重要作用。多数影响成骨细胞分化的信号通路及影响其分化的转录因子，都是通过直接影响 Runt相关转录因子2的产生及和活化Runt相关转录因子2的活性来发挥其相应生物学作用的。实验采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测Runt相关转录因子2 mRNA的相对表达量，发现厄贝沙坦可促进Runt相关转录因子2 mRNA的表达。

多年来，关于厄贝沙坦与促进成骨细胞分化的研究较少，目前仍集中在动物水平。最近的研究表明，厄贝沙坦在成骨细胞分化过程发挥重要调节作用，可改善骨质疏松。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物发挥此作用主要通过专向阻断血管紧张素Ⅱ受体中AT1受体，对成骨细胞的分化产生影响^[16]，目前，国内外的很多实验均证明，持续性应用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类药物(调整了年龄和体重等影响因素后)可显著增加股骨颈的骨密度。在中国女性和男性患者中^[17-26]，持续性应用血管紧张素转化酶抑制剂患者的股骨颈骨密度显著优于未用药者，同样的结果在长期血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂药物应用的患者中也得到证实。

综上所述，实验发现0.01 mmol/L厄贝沙坦促进成骨细胞增殖和分化的作用最为显著，在将来随着对其作用机制的进一步研究和生物科学技术的发展，对厄贝沙坦的有效调控可能会成为促进成骨细胞分化的一种新技术。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程